农业农村部公告第628号-9-2022 转基因植物及其产品成分检测 大豆常见转基因成分筛查.pdf

2022?12?19发布2023?03?01实施转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查04中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准备案号：XXXX-XXXX65.020.01BDetection of genetically modified plants and derived productsScreening of common genetically modified components in soybean中华人民共和国农业农村部发 布农业农村部公告第 628 号92022CCS农业农村部公告第 号 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、山西农业大学.本文件主要起草人:高建华、张秀杰、史宗勇、陈子言、刘璇、许冬梅、张雨琪、李夏莹、梁晋刚、王颢潜、郭俊佩、赵娟丽.农业农村部公告第 号 转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查范围本文件规定了大豆中常见转基因成分的定性筛查方法.本文件适用于 种转基因大豆转化体(见附录A)及其加工产品中常见转基因成分(C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r yA c基因和E终止子)的定性筛查.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件,不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.农业部 号公告 转基因植物及其产品成分检测D NA提取和纯化农业部 号公告 转基因植物及其产品成分检测抽样NY/T 转基因植物及其产品检测通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件.L e c t i n基因L e c t i ng e n e编码大豆凝集素L e c t i n的基因,本文件中作为大豆内标准基因.C a MV S启动子 Sp r o m o t e r f r o mc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s来自花椰菜花叶病毒(c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s,C a MV)的 S启动子.N O S终止子 t e r m i n a t o ro fn o p a l i n e s y n t h a s eg e n e来自胭脂碱合成酶(n o p a l i n es y n t h a s e)基因的终止子.p a t基因p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s eg e n e来源于绿产色链霉菌(S t r e p t o m y c e sv i r i d o c h r o m o g e n e s),编码膦丝菌素乙酰转移酶(p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e,P AT).c r y A c基因c r y A cg e n e编码苏云金芽孢杆菌(B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s)c r y A c杀虫晶体蛋白的基因.E终止子 t e r m i n a t o ro f r i b u l o s e ,b i p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e s m a l l s u b u n i t来自豌豆核酮糖,二磷酸羧化酶小亚基(r i b u l o s e ,b i p h o s p h a t ec a r b o x y l a s es m a l ls u b u n i t)基因的 端终止序列.原理依据 种转基因大豆转化体中常见的种调控元件和基因序列,选择特异性引物及探针,对试样进行农业农村部公告第 号 P C R扩增.依据是否扩增获得预期的D N A片段或典型扩增曲线,判断样品中是否含有相应的转基因成分.试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.琼脂糖.g/L溴化乙锭(E B)溶液:称取 g溴化乙锭,溶解于 mL水中,避光保存.警告 溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.m o l/L氢氧化钠(N a OH)溶液:在 mL水中加入 g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到 mL.mm o l/L乙二胺四乙酸二钠(E D TA N a)溶液(p H ):称取 g乙二胺四乙酸二钠,加入 m L水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见 )直至E D TA N a完全溶解,用氢氧化钠溶液(见 )调p H至 ,加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.m o l/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(T r i s HC l)溶液(p H ):称取 g三羟甲基氨基甲烷溶解于 m L水中,用盐酸调p H至 ,加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.T E缓冲液(p H ):分别量取 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(见 )和mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见 ),加水定容至 mL.在 k P a()条件下灭菌 m i n.TA E缓冲液:称取 g三羟甲基氨基甲烷(T r i s),先用 mL水加热搅拌溶解后,加入 m L乙二胺四乙酸二钠溶液(见 ),用冰乙酸调p H至 ,然后加水定容到 mL.使用时用水稀释成TA E.加样缓冲液:称取 m g溴酚蓝,加入 mL水,在室温下溶解 h;称取 m g二甲基苯腈蓝,加 mL水溶解;称取 g蔗糖,加 mL水溶解.混合以上种溶液,加水定容至 mL,在下保存.D NA分子量标准:可以清楚区分 b p b p的D NA片段.d NT P s混合溶液:将浓度为 mm o l/L的d AT P、d T T P、d G T P、d C T P种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.T a qD NA聚合酶、P C R扩增缓冲液及 mm o l/L氯化镁(M g C l)溶液.普通P C R方法引物检测参数的普通P C R方法引物序列及目的片段大小见表.表普通P C R方法引物组合信息表检测参数引物序列()目的片段大小,b pL e c t i n基因L e c t i n FG G G T GA G GA T A G G G T T C T C T GL e c t i n RG C GA T C GA G T A G T GA GA G T C G C a MV S启动子P C a MV S FG C T C C T A C AAA T G C C A T C A T T G CP C a MV S RGA T A G T G G GA T T G T G C G T C A T C C C NO S终止子T NO S FGAA T C C T G T T G C C G G T C T T GT NO S RT T A T C C T A G T T T G C G C G C T A p a t基因p a t FC C G GA GA G GA GA C C A G T T GA GA Tp a t RT T C C A G G G C C C A G C G T AA G c r yA c基因c r y A c FGAA G G T T T GA G C AA T C T C T A Cc r y A c RC GA T C A G C C T A G T AA G G T C G T E 终止子T e FC G C A C A C A C C A GAA T C C T A C T GAT e RA G G C C A C GA T T T GA C A C A 实时荧光P C R方法引物和探针检测参数的实时荧光P C R方法引物/探针序列及目的片段大小见表,探针 端标记荧光报告基团农业农村部公告第 号 (如F AM、HE X等),端标记对应的淬灭基团(如TAMR A、BHQ 等).表实时荧光P C R方法引物和探针组合信息表检测参数引物/探针序列()目的片段大小,b pL e c t i n基因L e c t i n q FG C C C T C T A C T C C A C C C C C AL e c t i n q RG C C C A T C T G C AA G C C T T T T TL e c t i n q PA G C T T C G C C G C T T C C T T C AA C T T C A C C a MV S启动子P C a MV S q FC GA C A G T G G T C C C AAA GAP C a MV S q RAA GA C G T G G T T G GAA C G T C T T CP C a MV S q PT G GA C C C C C A C C C A C GA G GA G C A T C NO S终止子T NO S q FA T C G T T C AAA C A T T T G G C AT NO S q RA T T G C G G GA C T C T AA T C A T AT NO S q PC A T C G C AA GA C C G G C AA C A G G p a t基因p a t q FG T C GA C A T G T C T C C G GA GA Gp a t q RG C AA C C AA C C AA G G G T A T Cp a t q PT G G C C G C G G T T T G T GA T A T C G T T AA c r y A c基因c r y A c q FGA C C C T C A C A G T T T T G GA C A T T Gc r y A c q RA T T T C T C T G G T AA G T T G G GA C A C Tc r y A c q PT C C C GAA C T A T GA C T C C A GAA C C T A C C C T A T C C E 终止子T e q FT C T T G T A C C A T T T G T T G T G C T T G TT e q RG GA C C A T A T C A T T C A T T AA C T C T T C T C CT e q PC G G T T T T C G C T A T C GAA C T G T GAAA T G GAAA T G G 引物/探针溶液:用T E缓冲液(见 )或水分别将上述引物或探针稀释到 m o l/L.石蜡油.D NA提取试剂盒.定性P C R试剂盒.P C R产物回收试剂盒.实时荧光P C R试剂盒.主要仪器和设备 分析天平:感量 g和 m g.P C R扩增仪:升降温速度 /s,孔间温度差异 .实时荧光P C R仪.电泳槽、电泳仪等电泳装置.凝胶成像系统或照相系统.操作步骤 抽样按NY/T 和农业部 号公告 的规定执行.试样制备按NY/T 和农业部 号公告 的规定执行.试样预处理按农业部 号公告 的规定执行.D N A模板制备按农业部 号公告 的规定执行.P C R扩增农业农村部公告第 号 普通P C R方法 试样P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.按表依次加入反应试剂,混匀,分装到P C R管中,再加 L石蜡油(有热盖功能的P C R仪可不加).也可采用经验证的、效果相当的定性P C R试剂盒配制反应体系.表普通P C R扩增体系试剂终浓度体积d d HO P C R缓冲液 L mm o l/L氯化镁溶液 mm o l/L Ld N T P s混合溶液(各 mm o l/L)mm o l/L L m o l/L上游引物 m o l/L L m o l/L下游引物 m o l/L LT a qD NA聚合酶 U/L m g/LD NA模板 m g/L L总体积 L“”表示体积不确定,如果P C R缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据T a q酶的浓度确定其体积,并相应调整d d HO的体积,使反应体系总体积达到 L.若采用定性P C R试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系,但上下游引物用量按表执行.将P C R管放在离心机上,g g离心 s,然后取出P C R管,放入P C R仪中.进行P C R扩增.反应程序为:变性m i n;变性 s,退火 s,延伸 s,共进行 次循环;延伸m i n;保存.反应结束后取出P C R管,对P C R扩增产物进行电泳检测.对照P C R扩增在试样P C R扩增的同时,应设置P C R阳性对照、P C R阴性对照和P C R空白对照.以含有对应调控元件或基因的质量分数为 的大豆基因组D NA(或采用对应调控元件或基因与非转基因大豆基因组相比拷贝数分数为 的D NA溶液)为阳性对照;以非转基因大豆基因组D NA作为阴性对照;以水作为空白对照.除模板外,对照P C R扩增与试样P C R扩增相同(见 ).P C R产物电泳检测按 g/L的质量浓度称量琼脂糖,加入TA E缓冲液中,加热溶解,配制成琼脂糖溶液.每 m L琼脂糖溶液中加入LE B溶液或适量的其他核酸染料,混匀,稍适冷却后,将其倒入电泳板上,插上梳板,室温下凝固成凝胶后,放入TA E缓冲液中,垂直向上轻轻拔去梳板.取 LP C R产物与L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔,同时在其中一个点样孔中加入D NA分子量标准,接通电源在V/c mV/c m条件下电泳检测.凝胶成像分析电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上成像.根据D NA分子量标准估计扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照.如需通过序列分析确认P C R扩增片段是否为目的D NA片段,按照 和 的规定执行.P C R产物回收按P C R产物回收试剂盒说明书,回收P C R扩增的D NA片段.P C R产物测序验证将回收的P C R产物测序,与对应调控元件或基因的序列(参见附录B)进行比对,确定P C R扩增的D NA片段是否为目的D NA片段.农业农村部公告第 号 实时荧光P C R方法 试样P C R扩增 每个试样P C R扩增设置个平行.按表依次加入反应试剂,混匀,分装的P C R管.也可采用经验证的、效果相当的实时荧光P C R试剂盒配制反应体系.表实时荧光P C R扩增体系试剂终浓度体积d d HO P C R缓冲液 L mm o l/L氯化镁溶液 mm o l/L Ld N T P s混合溶液(各 mm o l/L)mm o l/L L m o l/L上游引物 m o l/L L m o l/L下游引物 m o l/L L m o l/L探针 m o l/L LT a qD NA聚合酶 U/L m g/LD NA模板 m g/L L总体积 L“”表示体积不确定.如果P C R缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据T a q酶的浓度确定其体积,并相应调整d d HO的体积,使反应体系总体积达到 L.若采用实时荧光P C R试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系,但上下游引物用量按表执行.将P C R管放在离心机上,g g离心 s,然后取出P C R管,放入实时荧光P C R仪中.进行实时荧光P C R扩增.反应程序为 变性m i n;变性 s,退火延伸 s,共进行 个循环;在第二阶段的退火延伸()时段收集荧光信号.注:可根据仪器和试剂要求将反应参数作适当调整.对照P C R扩增在试样P C R扩增的同时,应设置P C R阳性对照、P C R阴性对照和P C R空白对照.以含有对应调控元件或基因的质量分数为 的大豆基因组D NA(或采用对应调控元件或基因与非转基因大豆基因组相比拷贝数分数为 的D NA溶液)为阳性对照;以非转基因大豆基因组D NA作为阴性对照;以水作为空白对照.除模板外,对照P C R扩增与试样P C R扩增相同(见 ).结果分析与表述 普通P C R方法 对照检测结果分析P C R扩增中,阳性对照内标准基因及对应调控元件和基因均得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致;阴性对照仅扩增出大豆内标准基因片段;空白对照没有扩增片段,表明P C R扩增体系正常工作.否则,重新检测.样品检测结果分析和表述 试样大豆内标准基因扩增出预期大小的片段,对应调控元件或基因C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因、E 终止子中任何一个扩增出预期大小的片段,表明样品中检测出调控元件或基因,表述为“样品中检测出(C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因、E 终止子)成分,检测结果为阳性”.试样大豆内标准基因扩增出预期大小的片段,但对应调控元件或基因C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因和E 终止子均未扩增出预期大小的片段,表明样品中未检测出调控元件农业农村部公告第 号 或基因,表述为“样品中未检测出C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因和E 终止子成分,检测结果为阴性”.试样大豆内标准基因未扩增出预期大小的片段,表明样品中未检出大豆成分,结果表述为“样品中未检测出大豆基因组D NA成分”.实时荧光P C R方法 基线与阈值的设定实时荧光P C R扩增结束后,以P C R扩增刚好进入指数期来设置荧光信号阈值,并根据仪器噪声情况进行调整.对照检测结果分析P C R扩增中,阳性对照内标准基因及对应调控元件和基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于;阴性对照仅大豆内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于;空白对照无典型扩增曲线,表明P C R扩增体系正常工作.否则,重新检测.样品检测结果分析和表述 试样大豆内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,对应调控元件或基因C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因、E 终止子中任何一个出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,表明样品中检测出调控元件或基因,表述为“样品中检测出(C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因、E 终止子)成分,检测结果为阳性”.试样大豆内标准基因出现典型扩增曲线且C t值小于或等于,对应调控元件或基因C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因和E 终止子均未出现典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检测出调控元件或基因,表述为“样品中未检测出C a MV S启动子、NO S终止子、p a t基因、c r y A c基因和E 终止子成分,检测结果为阴性”.试样大豆内标准基因未出现典型扩增曲线或C t值大于,表明样品中未检出大豆成分,表述为“样品中未检测出大豆基因组D NA成分”.注:个平行的P C R扩增结果出现不一致的,应重做P C R扩增样品次,最终以多数结果为准.注:为相应检测参数的名称.检出限 普通P C R方法的检出限为 (含靶序列样品D NA/总样品D NA).实时荧光P C R方法的检出限为 (含靶序列样品D NA/总样品D NA).注:本标准的检出限是在P C R检测反应体系中加入 n gD NA模板进行测算的.覆盖的转化体信息本文件方法中检测参数覆盖的转化体信息见附录C.农业农村部公告第 号 附录A(规范性)本文件适用的大豆转化体本文件适用的大豆转化体见表A .表A 本文件适用的大豆转化体序号转化体名称A A D A S D A S D B N F G G T S MON MON MON MON MON MON S H Z D S YHT H 中黄 农业农村部公告第 号 附录B(资料性)P C R产物扩增序列B L e c t i n基因普通P C R产物序列G G G T G A G G A TA G G G T T C T C TG C T G C C A C G GG A C T C G A C A TA C C T G G G G AAT C G C A T GA C G T G C T T T C T T GG T C T T T T G C TT C C AA T T T G CC A C A C G C T A GC A G TAA C A T TG A T C C T T T G G A T C T TA C AA GG T T T G T G T T GC A T GA G G C C AT C T AAA T G T GA C AG A T C G AAG GAAG AAA G T G T AA T AA G A CG A C T C T C A C TA C T C GA T C G CB L e c t i n基因实时荧光P C R产物序列G C C C T C TA C TC C A C C C C C A TC C A C A T T T G GG A C AAA G AAAC C G G T A G C G TT G C C AG C T T C G C C G C T T C C TT C AA C T T C A CC T T C T A T G C CC C T GA C A C AAAAA G G C T T G CA GA T G G G CB C a MV S启动子普通P C R产物序列G C T C C TA C AAA T G C C A T C A TT G C GA TAAAGGAAA G G C T A TC A T T C AAG A TG C C T C T G C C G A C A G T G G T C CC AAA GA T G G AC C C C C A C C C AC GA G GA G C A TC G T G GAAAAAG AA GA C G T T C C AA C C A C G T CT T C AAAG C AAG T G G A T T GA TG T G A C A T C T CC A C T G A C G TAA G G G A T GA C G C A C AA T C C C AC T A T CB C a MV S启动子实时荧光P C R产物序列C G A C AG T G G TC C C AAA G A T GGA C C C C C A C CC A C G A G G AG CA T CG T G G AAAAA GAAG A C G T T C C AA C C A C GT C T TB N O S终止子普通P C R产物序列GAA T C C T G T TG C C G G T C T T GC G A T G A T T A TC A TA TAA T T TC T G T T G AA T TA C G T TAAG C A T G T AA TAA T TAA C A T G T AA TG C A T G A C G T TA T T TA T GA GAT G G G T T T T TAT G A T T A GA G T C C C G C AA T TAT A C A T T T AA TA C G C GA T AG AAAA C AAAA T AT A G C G C G C AAA C T AG GA T AAB N O S终止子实时荧光P C R产物序列A T C G T T C AAAC A T T T G G C AAT AAA G T T T C TT AA G A T T GAAT C C T G T T G C CG G T C T T G C G A T GA T T A T C A TA T AA T T T C T GT T GAA T T A C GT TAAG C A T G TAA TAA T T AA CA T G T AA T G C A T G A C G T T A T TTA T GA GA T G GG T T T T TA T GAT T A GA G T C C CG C AA TB p a t基因普通P C R产物序列C C G G AG A G G AG A C C A G T T G AG A T T A G G C C AG C T A C A G C A GC T G A T A T G G CC G C G G T T T G T GA TA T C G T T AA C C A T T A C A TT G AG A C G T C TA C A G T G AA C TT T AG G A C A GAG C C A C AAA C A C C A C AA G AG TG G A T T G A T G AT C TA G AG AG GT T G C AA GA T AG A TA C C C T T GG T T G G T T G C T GA G G T T GA G GG T G T T G T G G CT G G T A T T G C TT A C G C T G G G CC C T G G AAB p a t基因实时荧光P C R产物序列G T C G A C A T G TC T C C G GA G AGG AG A C C A G T TGA G A T T AG G CC A G C TA C AG CAG C T GA T A T G G C C G C G G T T TG T GA T A T C G TT AA C C A T T A CA T T G AG A C G TC TA C A G T G AAC T T T AG G A C A GA G C C A C AAAC A C C A C AAG AG T G GA T T G A TG A T C T AG AG AG G T T G C AAG AT A GA TA C C C T农业农村部公告第 号 T G G T T G G T T GCB c r yA c基因普通P C R产物序列GAAG G T T T G AG C AA T C T C T AC C AAA T C T A TG C AG A GA G C TT C AG A GA G T GG G AAG C C GA T C C T A C TAA C CC A G C T C T C C GC G AG G AAA T GC G T A T T C AA TT C AA C G A C A TGAA C A G C G C C T T G A C C A C AGC TA T C C C A T TG T T C G C A G T CC AG AA C T A C CAAG T T C C T C TC T T G T C C G T G TA C G T T C AA GC A G C TAA T C TT C A C C T C A G CG T G C T T C G AGA C G T TA G C G TG T T T G G G C AA AG G T G G G G A TT C GA T G C T G CAA C C A T C AA TA G C C G T T A C AA C G A C C T T A CT AG G C T G A T C GB c r y A c基因实时荧光P C R产物序列GA C C C T C A C AG T T T T G G A C AT T G T G T C T C TC T T C C C GAA CT A T G A C T C C AGAA C C T A C C C TA T C CG T A C AG T G T C C C AA CT T A C C A GA G AAA TB E 终止子普通P C R产物序列C G C A C A C A C CA G AA T C C T A CT G AG T T T G AGT A T T A T G G C AT T G G GAAAA CT G T T T T T C T T G T A C C A T T T GT T G T G C T T G TAA T T TA C T G TG T T T T T T A T TC G G T T T T C G CT A T C G AA C T G T G AAA T G G AAA T G GA T G G A GAAG AG T T AA TG AA T GA T A T GG T C C T T T T G TT C A T T C T C AA A T T AA TA T TAT T T G T T T T T TC T C T T A T T T GT T G T G T G T T GAA T T T GAAA TTA TAA GA GA T A T G C AAA C A TT T T G T T T T G AG TAAAAA T G TG T C AAA T C G TG G C C TB E终止子实时荧光P C R产物序列T C T T G T A C C AT T T G T T G T G CT T G T AA T T TAC T G T G T T T T TT A T T C G G T T TT C G C T A T C G A A C T G T G AAA TG GAAA T G GA TG G AG AAG AG TTAA T G AA T GATA T G G T C C注:序列方向为 .注:端划线部分为上游引物序列,端划线部分为下游引物的反向互补序列,中间波浪线部分为实时荧光P C R方法的探针序列或探针的反向互补序列.农业农村部公告第 号 附录C(资料性)本文件中检测参数覆盖的转化体信息本文件中检测参数覆盖的转化体信息见表C .表C 本文件中检测参数覆盖的转化体信息元件/基因转化体名称C a MV S启动子A 、A 、D B N 、G T S 、S YHT H、S H Z D 、中黄 NO S终止子F G 、G T S 、S YHT H、中黄 p a t基因A 、A 、D A S 、D A S 、D B N 、S YHT H c r y A c基因MON 、MON E 终止子D B N 、MON 、MON 、MON 、MON