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杏鲍菇液体菌种最佳培养周期的研究

河 南 科 技 大 学
毕 业 设 计(论 文)

杏鲍菇液体菌种最佳培养周期的研究

毕 业 设 计（ 论 文 ）任 务 书
（指导教师填表）
填表时间：2013 年 3 月 5 日
学生姓名

专 业
班 级
园艺093
指 导
教 师

课 题
类 型
论文
设计（论文）题目
杏鲍菇液体菌种最佳培养周期的研究
主要研
究内容
1．不同培养时间对杏鲍菇液体菌种生长性状的影响：包括菌球直径，菌球密度，培养基pH。
2．不同培养时间对液体菌种四种胞外酶活性的影响（淀粉酶、羧甲基纤维素酶、多酚氧化酶、漆酶）。
主要技
术指标(或研究目标)
1．菌球直径的测定；
2．菌球密度的测定；
3．培养基pH的测定；
4．四种胞外酶活性的测定（淀粉酶、羧甲基纤维素酶、多酚氧化酶、漆酶）。
进度计划
2013.3～2013.4 查找相关资料，进行试验方法设计、仪器药品的准备；
2013.3～2013.5 进行杏鲍菇液体培养，获得可靠、详实的试验数据；
2013.5～2013.6 结果统计分析，完成论文，进行毕业论文答辩。
主要参
考文献
[1] 杨梅．杏鲍菇菌丝深层培养及氨基酸分析研究[J]．福建师范大学学报(自然科学版)，2000，16(4)：70-73．
[2] 张桂香．食用菌液体菌种生产的技术关键[J]．甘肃农业科技， 1998．
[3] 马立芝，马浩，武薇杏．鲍菇菌种液体培养研究初报[J]．中国农业大学，2008．
教研室主任签字： 2013年3月5日
河南科技大学毕业设计（论文）
杏鲍菇液体菌种最佳培养周期的研究
摘 要
杏鲍菇是近些年国内外迅速发展的食用菌之一，但绝大多数是采用固体菌种，而采用液体菌种相对于采用固体菌种无疑具有很大优势。液体菌种质量是影响萌发出菇的关键因素之一，评判液体菌种质量可用以下四种指标：菌球直径、菌球密度、培养基pH以及四种胞外酶活性。试验以黄豆粉液体培养基为基础，在温度25℃﹑振荡速率150转/分钟、装液量100ml、接种量10%的条件下培养，分别在第3、4、5、6、7、8、9天取样，测定液体培养基中的菌球直径、菌球密度、培养基pH以及淀粉酶、羧甲基纤维素酶、多酚氧化酶和漆酶等四种胞外酶活性。
结果显示：菌球直径先变小后增大，第六天达到最小，最小为1.09mm；菌球密度先变大后变小，在第六天达到最大，最大为128个/ml；培养基pH一直变小；淀粉酶活性在前三天内活性很低，第四4天迅速增大，第六天达到最大，最大为0.447，随后逐渐下降；羧甲基纤维素酶在前四天内活性很低，到第五天迅速增大，第六天达到最大，最大为0.594，之后又迅速下降；多酚氧化酶活性在前五天内逐渐上升，第七天达到最大，最大为0.701，而后又下降；漆酶活性在前六天内逐渐增加，第六天达到最大，最大为0.596，而后迅速下降，第七天以后漆酶的活性一直处于较低水平。综上所述，杏鲍菇液体菌种最佳培养周期为六天。

关键词： 杏鲍菇； 液体培养； 培养时间； 液体菌种

OPTIMAL CULTURE PERIOD OF LIQUID SPAWN OF PLEUROTUS ERYNGII
ABSTRACT
Pleurotus eryngii at home and abroad in recent years the rapid development of edible fungi, but the vast majority is the use of solid strains, while the use of liquid bacteria strains relative to the use of solid undoubtedly has a great advantage. Strain the liquid mass is a key factor affecting the germination of fruiting, one can judge the quality of liquid spawn the following four indicators: fungus ball diameter, ball bacterial density, medium pH and four extracellular enzyme activity. Experiment with soy flour based liquid medium, at a temperature of 25 ℃ ﹑ oscillation rate of 150 rev / min, liquid volume 100ml, 10% inoculum culture conditions, respectively, in the first 3,4,5,6,7,8 , 9 days sampling, determination of liquid medium ball diameter bacteria, fungus ball density, pH of the medium as well as amylase, carboxymethyl cellulase enzyme polyphenol oxidase and paint four kinds of extracellular enzyme activity.
The results showed that: fungus ball after the first smaller diameter increases, the sixth day minimum, the minimum is 1.09mm; bacteria density before the ball becomes larger and then smaller, the maximum on the sixth day, a maximum of 128 / ml; medium pH has become smaller; amylase activity is very low in the first three days, four days increases rapidly fourth, sixth day maximum, the maximum is 0.447, then decreased gradually; carboxymethyl cellulase activity is the first four days low, increases rapidly to the fifth day, the sixth day maximum, the maximum is 0.594, then decreased rapidly; polyphenol oxidase activity gradually increased in the first five days, the seventh day maximum, the maximum is 0.701, and later dropped ; laccase activity gradually increased the previous six days, the sixth day maximum, the maximum is 0.596, then decreased rapidly, the seventh day after the laccase activity has been at a low level. In summary, Optimal Pleurotus eryngii liquid bacteria culture period is six days.

KEY WORDS: eryngii; liquid culture; training time; liquid spawn

目 录
摘要
Abstract
1 前言 1
1.1 杏鲍菇的分类地位 1
1.2 杏鲍菇的作用和价值 1
1.2.1 杏鲍菇的营养价值 1
1.2.2 杏鲍菇的药用价值 1
1.2.3 杏鲍菇的经济价值 2
1.3 国内外杏鲍菇液体菌种的研究现状 2
1.3.1 液体菌种优势 2
1.3.2 国外杏鲍菇液体菌种研究现状 3
1.3.3 国内杏鲍菇液体菌种研究现状 3
1.4 杏鲍菇液体菌种生产中存在的问题 4
1.5 研究目的与意义 4
2 试验材料与方法 5
2.1 试验材料 5
2.1.1 供试菌种 5
2.1.2 设备仪器 5
2.1.3 所需药品 5
2.1.4 实验用具 5
2.2 试验试剂及配制 5
2.3 测定方法 6
2.3.1 菌球直径的测定 6
2.3.2 菌球密度的测定 7
2.3.3 淀粉酶活性的测定 7
2.3.4 羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性的测定 7
2.3.5 多酚氧化物酶活性测定 7
2.3.6 漆酶活性的测定 8
2.3.7 培养基pH的测定 8
2.4 数据处理 8
3 结果与分析 8
3.1 不同培养时间下的菌球直径变化 8
3.2 不同培养时间下的菌球密度变化 9
3.3 不同培养时间下的液体培养基pH变化 10
3.4 不同培养时间下的四种胞外酶活性变化 11
3.4.1 淀粉酶活性变化 11
3.4.2 羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性变化 12
3.4.3 多酚氧化物酶活性变化 13
3.4.4 漆酶活性变化 13
4 结论与讨论 15
4.1 结论 15
4.2 讨论 15
参考文献 18
致 谢 20

河南科技大学毕业设计（论文）
1 前言
1.1 杏鲍菇的分类地位
杏鲍菇（学名：Pleurotus eryngii），又称刺芹菇、刺芹侧耳，是生长于欧洲地中海区域、中东和北非，但也在亚洲部分地区生长的食用性菇类。在分类学上杏鲍菇隶属于真菌界，担子菌门，伞菌纲，无隔担子菌亚纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属[1]。杏鲍菇春末至夏初腐生兼寄生于伞形花科植物刺芹等的根上和周围土中，它是高山、草原、沙漠地带的一种品质优良的大型肉质伞菌。杏鲍菇有许多生态型，各生态型垂直分布完全不同，主要分布于南欧、北非、中亚等地区，我国四川(九寨沟和长海草地)、青海、新疆也有分布。
1.2 杏鲍菇的作用和价值
1.2.1 杏鲍菇的营养价值
杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，特别是菌柄组织致密、结实、乳白，可全部食用，且菌柄比菌盖更脆滑、爽口，被称为“平菇王”、“干贝菇”，具有杏仁香味和如鲍鱼的口感，适合保鲜、加工，深得人们的喜爱。菌肉肥厚似鲍鱼，因而得名杏鲍菇。杏鲍菇营养丰富，质地脆嫩，口感绝佳，风味独特，故有“草原上的美味牛肝菌”之美称。其食用方法有干品和鲜品两种主要方式，通过对杏鲍菇干、鲜品营养成分测定可知，其主要营养成分齐全，具有很高的营养价值[2]。新鲜杏鲍菇粗蛋白含量为20％，粗脂肪为3.50％，粗纤维为13.28％，灰分为6.10％，矿物质含量较高[3]，人体中必需的微量元素钙、镁含量是猴头菇钙含量20ug/g的7.1倍，姬松茸钙含量21.4ug/g的6.6倍[4]。杏鲍菇的多糖含量为6.3％。已测17种氨基酸总量为15.85％。其中人体必需氨基酸为6.65％，赖氨酸、精氨酸的含量特别高。钾、磷人体必需元素在杏鲍菇子实体内含量也相当高。
1.2.2 杏鲍菇的药用价值
杏鲍菇中含有丰富的多糖物质，多糖又称多聚糖，是由单糖缩合成的多聚物，广泛存在于高等植物、动物和微生物中[5]。现代医学研究发现，食用菌中能显著增强癌症患者抵抗力的生理活性物质即为食用菌多糖。食用菌多糖具有多种生物活性，包括：抗肿瘤[6]、调节免疫、降血压、降血脂、降血糖、健胃保肝、抗病毒，除此之外它还具有抗氧化[7]、延缓衰老、抗感染、抗辐射、抗水肿、抗疲劳和修复损伤组织细胞等方面的功效。目前，食用菌多糖已广泛应用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和肿瘤等疾病的临床治疗及医药领域的其它用途，如制备医用透析膜、药物缓释剂、血浆代用品及疫苗等[8]。
1.2.3 杏鲍菇的经济价值
杏鲍菇在国内开发生产时间较晚，但发展速度很快，由于栽培技术难度较小、产量较高等原因，常规生产的杏鲍菇市场价格一直偏低，一般均在每千克4-6元，超市售价一般为每千克8-10元；夏季反季节栽培的产品，一般在每千克10元左右，最高曾达18元，而且货源很少。栽培杏鲍菇的原料很广泛，棉子壳、阔叶木屑以及棉秆粉、玉米心等均可，辅之以麦麸等即可正常出菇。
1.3 国内外杏鲍菇液体菌种的研究现状
1.3.1 液体菌种优势
“液体菌种”是用液体培养基，在生物发酵罐中，通过深层培养（液体发酵）技术生产的液体形态的食用菌菌种。液体指的是培养基物理状态，液体深层培养就是发酵工程技术[12]。 “液体制种”实质是利用生物发酵工程生产液体菌种，取代传统、朴素的固体制种；利用生物发酵原理，给菌丝生长提供一个最佳的营养、酸碱度、温度、供氧量，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间达到一定菌球数量，完成一个发酵周期，即培养完毕[13]。液体菌种具有固体菌种不可比拟的优势：
一、工艺更简便。液体菌种没有级别之分，也就是说液体菌种既可以做为母种接原种，也可以做为栽培种直接接栽培袋，简化了生产工艺。
二、菌种更纯。液体菌种生产需经过筛选、提纯，属纯菌种；在生产过程中设备封闭运行，是一个选优复壮的过程，属纯培养。
三、周期更短。采用液体菌种从制种到菌丝长满栽培袋只需30天左右的时间，从制种到出菇大部分品种只需1个月，整个生产周期一般也就是两个月。
四、成本更低。用液体菌种无论是生产栽培种还是栽培袋，其菌种成本就2－3分钱。
五、污染更少。采用液体菌种接种后24小时萌发，菌种萌发速度超过杂菌生长速度，杂菌污染少。
六、操作更简便。液体菌种整个生产过程都是在一个罐体内完成，按键操作，既成倍降低了生产、管理费用，又节省人工，轻松制种。
七、出菇整齐上市早。采用液体菌种的产品可以早上市2个月以上，早上市与晚上市在效益上差的可就大了。此外，采用液体菌种的栽培袋菌龄短，出菇整齐一致，适合出口要求，在价格上占优势。
1.3.2 国外杏鲍菇液体菌种研究现状
20世纪中期，微生物液体深层培养（发酵）技术迅猛发展，从而形成了现代医学、食品发酵工业。1948年美国科学家Humfeld 等成功地对蘑菇进行了液体深层培养，从而揭开了人类进行食用菌液体培养和液体菌种研究的序幕，并很快使欧美国家蘑菇生产在五、六十年代快步进入了液体菌种和工业化栽培时代[9]。近年来，日本韩国等亚洲国家对香菇、金针菇、平菇液体菌种的研究应用已经很深入，已有许多菇厂开始用中小型发酵罐生产液体菌种进行栽培。
1.3.3 国内杏鲍菇液体菌种研究现状
我国较早从事食用菌液体深层发酵研究的是上海植物生理研究所孙美聿等人。1979年上海师院的杨庆尧教授开始对香菇、金针菇等培养液体菌种，并进行栽培试验。自80年代至20世纪来，我国许多科研院所的专家教授前辈开始对食用菌深层发酵、液体菌种及中小型发酵设备进行了反复、深入和刻苦的研究， 为今天我国液体菌种的社会化推广应用，不论在发酵设备、工艺技术还是在栽培应用上，都提供了宝贵的经验，奠定了坚实的基础[10]。目前已见的液体菌种生产与应用的食用菌品种，包括平菇、香菇、黑木耳、双孢菇等常规品种和白灵菇、杏鲍菇、真姬菇等珍稀品种约五十多个品种[11]。但对于液体菌种存在的保存期短，易失活，易污染，不便运输等问题，还未见提出有效的解决办法。虽然有资料表示液体菌种在0-4℃保存2—3个月仍可作菌种，但也有试验显示液体菌种0-4℃保存超过3天，菌种的生活力就有所下降，萌发慢，菌袋易污染。
1.4 杏鲍菇液体菌种生产中存在的问题
液体菌种虽然在栽培上具有许多优点，但目前仍不能取代固体菌种推广使用，原因主要有以下几方面[14]：
1．生产液体菌种的投入比较大。液体菌种生产设备投资大，一家一户小规模生产，购买设备不划算；培养设备需要有电源，而偏远农村常常停电；液体菌种需要良好的培养环境，刨造良好的环境也需要较高的投入。
2．液体菌种生产技术要求较高，需要专业的技术人员管理，才能保证菌种不受污染。一些小型食用菌生产厂家和一般菇农很难生产出优质的液体菌种应用于生产。
3．液体菌种菌丝球悬浮于液体培养基中，营养易于吸收，菌丝生长快，老化也快，液体菌种一旦生产出来应该及早使用，在接种时间上缺乏周转余地，一次性投资大。
因此，目前我国液体菌种只在个别大规模、工厂化的食用菌生产单位使用，而我国目前食用菌生产的现状是分散的、小规模的副业式生产占据主体，因此科研和生产仍存在着差距，以致成果无法推广。
1.5 研究目的与意义
杏鲍菇的栽培，是以收获子实体为目的的，并通过市场渠道而获得经济效益，菌种虽然不是最终目的，但是重要的中间手段。对杏鲍菇的菌种进行液体培养，单位体积液体培养基中生产菌丝速度快，生产量大，只需4—5天即可生产几升到几十升甚至更多。生产的液体菌种可以用作栽培用的母种或原种，也可直接作栽培种。液体菌种在固体培养基上萌发快、定植早、成品率高。据报道，把杏鲍菇的液体菌种接到固体培养料中，由于液体菌种具有流动性，因而接入的菌种可流散在不同的部位萌发生长[15]。但是液体菌种质量是影响萌发出菇的关键因素之一，采用质量好的菌种无疑能提高出菇产量。液体菌种培养时间短则菌种活力不足，培养时间长则菌种老化，所以确定适宜的培养周期非常关键。
2 试验材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试菌种
杏鲍菇菌株，由河南科技大学提供。
2.1.2 设备仪器
电热鼓风干燥箱， 霉菌培养箱，立式电，热压力蒸汽灭菌器， 双数显汽浴恒温振荡器，离心机，分光光度计。
2.1.3 所需药品
葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素b，蒸馏水, 醋酸，醋酸钠，羧甲基纤维素钠，可溶性淀粉，酒石酸钾钠，3，5-二硝基水杨酸，苯酚，氢氧化钠，磷酸氢钾，邻联甲苯胺，邻苯二酚等。
2.1.4 实验用具
80 目筛网，电磁炉，250ml三角瓶，试管，烧杯，吸管，培养皿，玻璃棒，量筒，温度计，试管架，100ml容量瓶，500ml容量瓶，比色皿等。
2.2 试验试剂及配制
0.5%可溶性淀粉溶液（ph4.8、0.1mol/l NaAc-HAc 缓冲液）；0.5%的羧甲基纤维素钠溶液（用ph=4.6、0.1mol/l NaAc-HAc 缓冲液配制）；0.05mol/l，ph=7.5的磷酸盐缓冲液；0.1mol/l，ph=4.6的醋酸缓冲液。
试管培养基：采用PDA培养基，马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，自来水1000毫升，自然pH。配制方法：现将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂。用四层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂融完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，加塞，包扎，灭菌20分钟取出，试管摆斜面，冷却后贮存备用。
试验培养基：采用黄豆粉培养基[16]，黄豆粉30g，葡萄糖15g，蛋白胨1g, 磷酸二氢钾0.25g，硫酸镁0.25g，维生素b 5mg，水500ml。配制方法如下：将黄豆粉加水煮沸30min后，用80目的筛网过滤，取其滤液，加入其他成分，补足水分，分装在250ml的三角瓶中， 121℃湿热灭菌30min。
一级菌种的制备：母种活化将保存的菌种转接到无菌的斜面培养基上，放入25℃左右恒温培养箱中，培养7—10 天，得到斜面母种。取0.5cm2 左右的母种菌块接种于装有150ml一级培养基的250ml三角瓶中，每瓶3 块，25℃下静置2 天，然后在温度25℃、转速150r/min，振荡培养5天[17]。
一级摇瓶培养基：葡萄糖30g，蛋白胨2g，琼脂4g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，VBl10mg，水1000ml，121℃灭菌20分钟[18]。
二级菌种的制备：将一级菌种按试验要求接种于装有二级培养基的250ml 三角瓶中，恒温振荡培养，温度25℃、转速120r／min。
DNS试剂配制 ：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存。但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50℃。
2.3 测定方法
2.3.1 菌球直径的测定
取lml培养液放入培养皿中，按lml培养液含菌球大小的数量比，取20个菌球在培养皿中排成一列，测总长度，然后计算单个菌球直径，取3次求平均值[19]。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，菌球直径（mm）为纵坐标，绘制曲线。
2.3.2 菌球密度的测定
将培养好的液体菌种摇匀后，取lml培养液于培养皿中，培养皿下垫方格纸直观计数，取3次求平均值。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，菌球密度（个）为纵坐标，绘制曲线。
2.3.3 淀粉酶活性的测定
在试管加入0.5%可溶性淀粉溶液（ph4.8、0.1mol/l NaAc-HAc 缓冲液）1.5ml，再加入稀释10倍粗酶液0.5ml，混匀，于38℃水浴保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5ml，煮沸5min后取出，冷却后加入蒸馏水21.5ml，混匀，测520nm处OD值，以煮沸灭活15min的酶液作对照[20]（设置三个重复）。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，淀粉酶活性OD值为纵坐标，绘制曲线。
2.3.4 羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性的测定
在试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液（用ph=4.6、0.1mol/lNaAc-HAc 缓冲液配制）1.5ml，加稀释10倍的粗酶液0.5ml，50℃水浴保湿10min，取出后立即加入DNS试剂1.5ml，煮沸5min，取出，冷却后加入蒸馏水21.5ml，混匀，测520nm处的OD值，以煮沸灭活15min的酶液作对照（设置三个重复）。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性OD值为纵坐标，绘制曲线。
2.3.5 多酚氧化物酶活性测定
先往试管中加入0.05mol/l，ph=7.5的磷酸盐缓冲液2.0ml，再加入0.1mol/l的邻苯二酚2.0ml，再加稀释10倍的粗酶液0.5ml，28℃保温30min，测400nm处OD值，以煮沸灭活15min的酶液作对照（设置三个重复）。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，多酚氧化物酶OD值为纵坐标，绘制曲线。
2.3.6 漆酶活性的测定
先往试管中加入0.1mol/l，ph=4.6的醋酸缓冲液3.4ml，再加入3.36mol/l的邻联甲苯胺0.5ml，再加入稀释10倍的粗酶液0.5ml，保温30min，测600nm处光密度（OD值），以煮沸灭活15min的酶液作对照（设置三个重复）。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，漆酶OD值为纵坐标，绘制曲线。
2.3.7 培养基pH的测定
用玻璃棒蘸取少量培养基浸湿精密pH试纸，与标准比色卡对比读数。（设置三个重复）。
曲线的绘制：以培养时间（天）为横坐标，培养基pH为纵坐标，绘制曲线。
2.4 数据处理
采用Excel等统计分析软件进行分析。
3 结果与分析
3.1 不同培养时间下的菌球直径变化
从液体菌种培养第三天起每天上午在超净工作台上吸取1ml培养液放入培养皿中，取20个菌球排成一列，测总长度，然后计算单个菌球直径[21]。试验结果见图1。
由图1可知：杏鲍菇液体菌种在接种后菌球直径变化曲线为V型，在前六天缓慢变小，第六天达到最小，单个菌球最小为1.09mm，第七天以后又逐渐增大。
菌球直径大小反应了菌种分裂生长能力的强弱。菌球直径越小说明液体菌种流动性越强，菌种生长越迅速。培养前期，培养基内物理化学性状较适合菌种生长菌种迅速分裂增殖直径变小。随着培养时间的延长，由于营养物质的消耗和代谢废物的增多，使得菌种竞争加剧，生长环境变恶劣，菌种分裂增殖速度降低甚至停止，菌球逐渐长大。另外有些小菌球聚合成大菌球也使菌球直径变大。

图1 杏鲍菇液体菌种菌球直径变化曲线
Figure 1 Pleurotus eryngii fungus ball diameter liquid strain curve

3.2 不同培养时间下的菌球密度变化
从液体菌种培养第三天起每天上午在超净工作台上吸取1ml培养液放入培养皿中，观察菌球个数，试验结果见图2。
由图2可知：液体菌种菌球密度变化曲线呈抛物线型：随培养时间的延长菌球密度逐渐增加，在第3-5天呈指数型增加，在第六天达到最大，每毫升最多有128个。第七天以后菌球密度开始下降，到第九天只剩下不到最大密度的一半。
菌球直径越小，菌球密度越大，菌种干重越大，则液体菌种流动性越强，越易分散，发菌点越多，萌发越快。培养初期，培养基内物理化学性状较适合菌种生长菌种开始大量增殖，菌球密度快速增加。
随着培养时间的延长，由于营养物质的消耗和代谢废物的增多，使得菌种竞争加剧，生长环境变恶劣，培养基越来越不适合菌种的生长，菌种生长逐渐变弱甚至停止。到后期，有些菌球开始老化自溶，所以菌球密度降低。

图2 杏鲍菇液体菌种菌球密度变化曲线
Figure 2 Pleurotus eryngii liquid bacteria bacteria density curve ball

3.3 不同培养时间下的液体培养基pH变化
从液体菌种培养第三天起每天上午用精密pH试纸测量液体培养基pH。所测结果见图3。
由图3可知：培养基pH变化曲线呈缓慢下降趋势。培养基初始pH为5.1，而第四天之前pH一直稳定在5.1，这说明在前第四天内培养基营养物质消耗较少，第五天后随着培养时间的增加，液体培养基PH逐渐降低，但幅度不是很大，第八天以后培养基pH下降到4.4以下。这可能与杏鲍菇液体菌种消耗有机氮源产生酸性代谢废物有关。但当培养基pH在4.4以下时菌种开始生长不良。所以第八天以后培养基已不适合菌种生长了。

图3 杏鲍菇液体菌种培养基pH变化曲线
Figure 3 Pleurotus eryngii liquid culture medium pH curve

3.4 不同培养时间下的四种胞外酶活性变化
3.4.1 淀粉酶活性变化
从液体菌种培养第三天起每天上午用分光光度计在520nm处测定淀粉酶活性，以OD值表示，试验结果见图4。

图4 杏鲍菇淀粉酶活性变化曲线
Figure 4 Pleurotus eryngii amylase activity curve

由图4可知：杏鲍菇淀粉酶活性变化曲线呈抛物线型。杏鲍菇液体菌种在1-3天内淀粉酶活性很低，维持在0.103以下，在4-5天淀粉酶活性迅速增大，在第五天淀粉酶活性已达0.435，在5-7天内淀粉酶维持较大活性（0.435-0.429），最大活性出现在第六天，最大为0.447。第八天以后淀粉酶活性逐渐下降。
上述变化可能与培养基内多糖有关。在培养初期菌种淀粉酶分泌较少，之后在丰富的多糖诱导下大量分泌淀粉酶。后期随着多糖的消耗，淀粉酶分泌减少，活性降低。
3.4.2 羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性变化
从液体菌种培养第三天起每天上午用分光光度计在520nm处测定羧甲基纤维素酶活性，以OD值表示，试验结果见图5。

图5 杏鲍菇羧甲基纤维素酶活性变化曲线
Figure 5 Pleurotus eryngii carboxymethyl cellulase activity curve

由图5可知：杏鲍菇羧甲基纤维素酶活性变化曲线呈锯齿型。在前四天内羧甲基纤维素酶活性很低，到第五天急剧分泌，第六天达到最大，最大为0.594，之后又迅速下降。但在第九天又出现回升趋势。
上述变化可能与培养基内纤维素有关。在培养初期菌种羧甲基纤维素酶分泌量一直较少，直到第五天才被大量诱导合成。至于第九天又出现上升趋势，可能与半纤维素有关。杏鲍菇优先分解利用纤维素，纤维素消耗完后开始分解利用半纤维素。
3.4.3 多酚氧化物酶活性变化
从液体菌种培养第三天起每天上午用分光光度计在400nm处测定多酚氧化酶活性，以OD值表示。所测结果见图6。

图6 杏鲍菇多酚氧化酶活性变化曲线
Figure 6 Pleurotus eryngii polyphenol oxidase activity curve

由图6可知：杏鲍菇多酚氧化酶活性变化曲线呈S型。在前四天多酚氧化酶保持较低活性，第四天以后多酚氧化酶的分泌量呈梯级上升，随后加速分泌，第七天达到分泌高峰，最高为0.701，而后又呈梯级下降。
多酚氧化酶在培养前期分泌较少，活性较低。在培养后期的高活性可能与菌球自溶有关。菌球溶解后多酚氧化酶被释放出来，所以前期活性很低，后期较高。
3.4.4 漆酶活性变化
从液体菌种培养第三天起每天上午用分光光度计在600nm处测定漆酶活性，以OD值表示，试验结果见图7。

图7 杏鲍菇漆酶活性变化曲线
Figure 7 Pleurotus eryngii laccase activity curve

由图7可知：杏鲍菇漆酶活性呈倒V型。杏鲍菇漆酶分泌量在前六天内逐渐增加，最大分泌量出现在第六天，最大为0.596，而后迅速下降，第七天以后漆酶的活性一直处于较低水平。
对于杏鲍菇液体菌种来讲，胞外酶活性越大，说明菌种的活性越强，接种后菌丝萌发越快[22]。本实验结果：淀粉酶活性在第5-7天内达到最大；羧甲基纤维素酶活性在第六天达到最大；多酚氧化酶活性在6-8天内很大；漆酶在第六天内达到最大。所以总的来讲：杏鲍菇四种胞外酶活性在第六天最大，菌种活性最强。
菌球的直径越小、菌球密度越大，则菌种的流动性越强、接种后越容易分散、发菌点也就越多。也就是说，在利用液体菌种生产杏鲍菇的过程中，液体菌种的菌球直径越小、密度越大、活性越强，则菌种的品质越好，越有利于生产。本实验结果：菌球直径在第六天最小；菌球密度在第六天最大。综上所述，杏鲍菇液体菌种在第六天最适合接种。
4 结论与讨论
4.1 结论
本文采取单因素试验，以培养时间为变量，以菌球直径、菌球密度、培养基pH、淀粉酶活性、羧甲基纤维素酶活性、多酚氧化酶活性和漆酶活性为指标，得出了在温度25℃﹑振荡速率150转/分钟、装液量100ml、接种量10%的条件下杏鲍菇液体菌种最佳培养周期为六天的结论。通过对菌球直径的测定得出第六天菌球直径最小，最小为0.109mm；通过对菌球密度的测定得出第六天菌球密度最大，最大为128个/ml；通过对培养基pH的测定得出前七天内较适合菌种生长；通过对四种胞外酶活性的测定得出第六天酶活性均较高。所以在此条件下第六天接种能显著缩短杏鲍菇萌发出菇时间，缩短栽培周期，获得较大经济利益。
杏鲍菇菌丝的生长发育包括菌丝的发菌、生长周期、生长速度、生长势、抗逆性、菌丝表现等。食用菌的一生可分为营养生长和生殖生长两大阶段。营养生长，即发菌养菌阶段。从营养生长和生殖生长两阶段的关系来说，前者为后者提供营养物质，只有积累足够的营养并达到生理成熟，方可顺利出菇，并获得较高的产量和较好质量。对培养过程中各指标的变化情况分析如下：在培养前3天内有少量新生菌球形成，为原转接的菌球脱落体；培养4天，新生菌球增多，菌球边缘有大量绒毛状菌丝形成；第6天新生小菌球大量增加，是由于振荡使大量绒毛状菌丝脱落形成，所以数目急剧增多，菌球直径达到最小；第8天菌球数目减少，可能是由于一些小菌球聚合成大的菌丝体，所以直径变大；9天之后由于菌球开始老化自溶。
4.2 讨论
杏鲍菇是近几年国内广为栽培的品种，但绝大多数是采用固体菌种，这种方法的操作环节多、接种过程中容易污染、菌丝生长速度较慢、出菇时间不整齐、不便于统一管理，不利于杏鲍菇的规模化和机械化栽培。采用杏鲍菇液体菌种进行生产具有菌种流动性好、接种后易于分散、污染几率小、菌丝萌发快、发菌点多、出菇时间整齐等特点。而液体菌种不同培养期对菌种各项指标影响巨大，探讨最佳培养周期无疑具有巨大意义。
从生产销售总体上看，中国食用菌存在着生产经营不规范、产量大、价格低等问题。中国食用菌协会有关负责人李玉春认为，其根本原因是质量问题。他指出，我国虽然从产量和消费上已成为食用菌产业大国，但由于受小农生产方式和习惯影响，还远远不是食用菌强国。这主要表现在生产各环节的不规范，从而导致产品质量不稳定甚至低下。国内一些食用菌生产企业设备简陋，卫生条件差，甚至有人用不法手段生产，这样的产品严重损害了食用菌产业声誉。有专家认为，食用菌规范化生产要解决好三个问题：一是菌种标准化。我国生产食用菌使用的品种绝大多数是未经审定、认定或登记的，导致稳定性和一致性差，质量参差不齐。二是生产过程缺乏标准。如食用菌生产的产地环境、设施标准，添加剂、杀虫剂、农药、化肥的使用方法和标准。三是包装不规范，常套用蔬菜卫生标准保鲜保藏，与国际不接轨。
总体来说，中国食用菌产业缺乏各环节的质量评价标准、质量保证和认证等规范化体系。香港中文大学国际食用菌生物技术中心主任张树庭认为，近年中国的食用菌产量虽不断增加，但出口数量所占的比例却在下降，其中虽有绿色壁垒问题，但关键是随着食用菌产业的快速发展，杏鲍菇越来越多的受到消费者的青睐，生产规模不断扩大为大众食用菌产品，其传统的生产模式已不能满足市场的需要。许多发达国家已经形成了杏鲍菇的工厂化、周年化生产。而我国的杏鲍菇生产目前仍然以分散的家庭小规模方式发展，是影响杏鲍菇产量、质量及规模化生产发展的主要原因之一。这严重制约了我国杏鲍菇的生产和出口。在食用菌的国际贸易中，我国的贸易量占到亚洲的80％，占到全球的40％。从市场前景上看，我国的食用菌消费潜力还相当大，我国13亿人口，2001年人均蔬菜年消费量达到240kg，而人均食用菌年消费量只有3kg左右，仅为1／80，潜在消费空间非常大。
随着杏鲍菇需求量的逐渐扩大，全国各地的杏鲍菇生产发展也相应的加快了。但一些问题也接踵而至，其一，劳动力的问题。我们正处在一个特定的发展时期，农村劳动力需要大量转移而传统的杏鲍菇栽培方式需要大量的劳动力。其二，劳动力素质问题。花费大量资金从国外引进的先进的技术和器材，没有会用，再先进、贵重的器材顷刻成为一堆废物。综合上述因素，再加上杏鲍菇市场价格普遍偏高的利益诱惑，广大菇农对杏鲍菇规模化、工厂化生产工艺创新提出了新的要求，他们急需一种容易掌握、操作方便、培养周期短、适宜大规模工厂化管理、生产的杏鲍菇栽培方式来取代现有的传统栽培方式。
液体菌种栽培以其特有的菌种流动性好、接种后易于分散、污染几率小、菌丝萌发快、发菌点多、出菇时间短而整齐等特点，越来越受到广大学者的关注，该方面的研究日益加深，从杏鲍菇适宜液体菌种栽培的菌株选育到杏鲍菇液体菌种栽培条件研究，乃至胞外酶活性、深层发酵，但关于筛选杏鲍菇液体菌种最佳培养周期的研究还比较少。本试验以培养时间为变量，以菌球直径、菌球密度、培养基PH、四种胞外酶活性为指