茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用项目建设投资可行性研究报告.doc

茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用 54目 录一、项目概要11项目名称12建设地点13建设内容14资金筹措15建设期限16项目效益1二、研制开发的目的和意义21农业植物疫病虫害发生频繁22茄科土传病害危害及经济重要性23茄科土传病害流行猖獗24茄科土传病害的危害及防治的关键问题3三、国内外相关技术发展概况和趋势4（一）青枯病研究进展41植物青枯病的症状42青枯雷尔氏菌的形态特征43青枯病发病规律和侵染循环54植物青枯病的生物防治研究进展5（二）枯萎病研究现状71枯萎病的发生与危害72枯萎病原菌的微生物学特性83枯萎病原菌的生理生化104枯萎病的防治11四、前期研制开发情况17（一）青枯雷尔氏菌及其生物防治研究基础171青枯雷尔氏菌致病力分化的研究172青枯雷尔氏菌强致病力菌株和无致病力菌株的鉴别183青枯病生物杀菌剂的研究基础204无致病力青枯雷尔菌的GFP基因标记21（二）尖孢镰刀菌及其生物防治研究基础221尖孢镰刀菌的培养特性222蔗糖浓度对尖孢镰刀菌生长的影响273培养基营养成分对尖孢镰刀菌生长的影响294尖孢镰刀菌的生防因子芽孢杆菌的初筛335尖孢镰刀菌生防因子芽孢杆菌的复筛36五、主要研制开发内容和考核目标381建设规模382研究内容38六、项目组织实施方案401项目的技术路线402项目建设期限与进度安排413研究队伍人员配置41七、产业化依托或工程依托落实情况421项目承担单位422项目成果对接企业433与企业的对接协议44八、技术经济分析和社会经济效益分析451茄科土传病害拮抗菌剂的研究为解决“餐桌污染”提供技术保障452茄科土传病害拮抗菌剂的应用对提高中国农产品贸易竞争力意义重大453茄科土传病害拮抗菌剂的研究与绿色食品产业息息相关.454茄科土传病害拮抗菌剂的研究是创汇农业产业的基础455茄科土传病害拮抗菌剂的研究与环境保护产业紧密相联456茄科土传病害拮抗菌剂的研究将成为我省生物工程产业龙头467茄科土传病害拮抗菌剂的应用将带动商业贸易的发展46九、项目资金预算471资金预算472资金筹措47十、项目申报单位及协作单位概况48十一、其他需要说明的情况491安全食品的发展对本研究的需求492控制茄科土传病害的暴发是本研究的目的493经济效益预测49十二、项目申报单位签章50十三、项目主持单位审核并盖章50相关附件：1福建众智生物科技有限公司营业执照复印件 2成果对接协议茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用一、项目概要1项目名称茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用。2建设地点福建省农业科学院生物技术研究所生物农药研究中心（福建省生物农药工程研究中心），位于福州市马尾江滨东大道108号福建留学人员创业园。3建设内容（1）建立茄科土传病害拮抗菌筛选体系；（2）建立茄科土传病害拮抗菌剂生防机理研究体系（3）建立拮抗菌剂生物测定体系； （4）建立茄科土传病害拮抗菌剂工艺关键技术研究体系（5）茄科土传病害拮抗菌剂中试推广应用4资金筹措本项目计划总投资160万元。其中自筹资金80万元，向省发改委申请项目专项资金80万元。5建设期限本项目建设期限2年。6项目效益茄科作物包括了番茄、辣椒、茄子、马铃薯等，是我省重要的经济作物。重要的茄科土传病害有枯萎病、青枯病等，危害严重，造成巨大的经济损失，同时，至今无特效的化学农药防治方法。拮抗菌剂进行茄科土传病害生物防治成为研究的重点，显示出很好的应用前景。本项目建设内容：（1）建立茄科土传病害拮抗菌筛选体系，拟从全国各地收集微生物菌种资源，从丰富的天然资源中筛选含对茄科土传病害枯萎病、青枯病等具有高效拮抗效果的生防菌株，通过脂肪酸测定、分子标记等方法进行菌株的分类鉴定；采用冷冻干燥等方法对菌株进行保藏；建立茄科土传病害生防菌株资源库，成立菌种及菌种突变体筛选保存中心，利用计算机信息管理管理系统对菌种的收集、保藏、筛选和产业化应用前期研究进行全程管理。（2）建立茄科土传病害拮抗菌剂生防机理研究体系，对初筛后认为有前途的菌株进行形态特征、生长条件、培养特性、抑菌特性、抑菌物质、生防机理（抑制、拮抗、诱导、竞争、致弱）等研究，明确拮抗菌应用相关的生防机理，为拮抗菌剂的应用提供科学依据。（3）建立拮抗菌剂生物测定体系，以抑菌圈测定、组培苗回接、盆载苗测定、小区实验、大田实验为技术，形成茄科土传病害拮抗菌剂生物测定系统，建立拮抗菌剂生防效果测定标准操作规程，为可靠鉴定拮抗菌剂的防治效果提供技术保障。（4）建立茄科土传病害拮抗菌剂工艺关键技术研究体系，研究拮抗菌剂的培养基配方、发酵条件、分离工艺、浓缩工艺、提取工艺、制剂配方技术、助剂技术、制剂工艺等，制定拮抗菌剂的生产质量标准和生产工艺标准操作规程，建成茄科土传病害茄科土传病害拮抗菌剂工艺研究中试车间，并形成年产100吨的中试生产规模。（5）茄科土传病害拮抗菌剂中试推广应用，研究拮抗菌剂使用方法，不同作物，不同浓度，不同季节，不同地区，不同生育期条件下，拮抗菌剂使用技术。制定拮抗菌剂使用标准操作规程。项目的研究为我省生物农药的研究平台建设提供模式，为产业发展提供技术支持。通过转让形式向国内外生产企业和研究机构相关配套技术，促进生物农药资源的高效共享和持续利用。二、研制开发的目的和意义1农业植物疫病虫害发生频繁近年来，我省农业植物疫病虫害发生频繁，对我省的农业生产造成了直接的损失，给人民群众生活带来严重影响。因此，加强农业植物重大疫病虫害综合防治技术及其应用研究，有效预防农业植物重大疫病虫害的发生，减少对农业生产造成的损失和对人民生活造成的不良影响已刻不容缓，这是我省广大农业科技工作者义不容辞的责任。茄科病害枯萎病、青枯病为世界性的重要土传植物病害之一。据目前的统计，茄科土传病害如青枯病能侵染44多科300多种植物，其中包括许多重要的经济作物和粮食作物，引起的经济损失极为严重。青枯病具有发病广、传播快等特点，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，但随着全球气候变暖等因素的影响，气候凉爽地带的青枯病也呈现上升趋势。为防治茄科土传病害青枯病发生，世界各国科研工作者进行了大量的工作，并因地制宜的提出了一些防治方法，如选用抗病品种和利用抗病砧木嫁接，轮作，培育无病壮苗，利用抑菌土和土壤添加剂调节土壤酸碱度等。但是，无病留种及上述措施的推行难度较大；化学防治药剂污染、残留过多，效果也并不十分显著；同时频发的厄尔尼诺，使得全球的气候条件也越来越适宜青枯病的发生，因此，青枯病未能得到有效的控制，其危害仍在加重。图1 青枯病为害的植株图2青枯病病原菌图3病原细菌堵塞维管束2茄科土传病害危害及经济重要性 茄科土传病害如青枯病菌寄主范围非常广泛，能侵染44多个科200多种植物，主要危害茄子、番茄、马铃薯和辣椒等茄科作物，并能侵害占国民经济重要地位的烟草、生姜、花生等多种经济作物。植株一旦感染青枯病菌，青枯菌即侵害植株的维管束组织，并在其中繁殖，产生大量的胞外多糖，并诱发侵添体等物质，阻滞了植株内水分的输导，导致整个植株生长受到影响，继而造成全株死亡。该病传染速度快，危害程度高，轻则减产，重则绝收，是一种毁灭性病害。病原菌在植株的全生育期均可发生，因此一旦发病，就难以根除，并随着连作年份的增加，发病率升高，是一种顽固的土传病害病田一般减产2030%、严重田块可达5060%，甚至绝产，是目前造成蔬菜生产大面积减产的主要原因之一，限制着我省蔬菜生产发展。3茄科土传病害流行猖獗青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）主要在土壤中及遗落在土壤中的病株残体上越冬，亦能潜伏于种子中或生长在各种寄主体内。越冬作物的营养体和繁殖体可将病菌进行远距离传播。青枯病的初侵染来源主要为土壤、病残组织和未沤熟的农家肥料。这些病原菌借灌溉水、带菌肥料、带病菌的种子或附着在幼苗上的病土以及人畜和生产工具而传播。附生于作物表面的菌源可由雨水传播，雨水将烟草表面的菌源洗落于地，可使土壤表面的病原菌浓度增高。雨水中的病源体或轻或重地侵染植物，被认为是地面上的一个重要侵染来源。在大风雨的情况下，青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）可在邻近的健株上广泛传播。传播到叶上的病原菌在95%RH下生存期可超过15天。曾东方等（1994）从湖北红安花生青枯病病地采集的花生种子，未经晾晒直接播于温室，青枯病发病率分别为4.8%和7.7%。对种子进行青枯雷尔氏菌分离，带菌率4.9%，但风干2个月后播种，未见传病现象。另外，花生种子用病菌悬浮液浸泡24小时后，经烘、晾、晒干燥处理3天，当含水量降到10%左右时，分离不到青枯雷尔氏菌。说明花生青枯病可通过种子传播，但病原菌的发病与湿度的关系较大。4茄科土传病害的危害及防治的关键问题青枯病对茄科植物的危害甚为严重，1988年对南京地区茄科作物青枯病调查报道表明，一般田块发病率为2530%，严重田块可达80100%。马铃薯对青枯病十分敏感，通常造成20-30%的产量损失，严重时可造成75%以上的损失。蕃茄生长过程经常受到青枯病的危害，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害。我国南方各省都有青枯病危害，福建烟草的青枯病发病率一般为1030，严重田块100，以至全田烟草枯死，此病已成为福建烟草生产的主要障碍之一。此外，在花生、辣椒、番茄、茄子、甘薯、生姜等作物上，青枯病发生亦很严重，易感病作物面积近500万亩。随着研究的进展，青枯病的新寄主不断发现，以及全球气温变暖等因素，世界范围内青枯病发生越来越普遍，并日趋严重。近年来，我国南方桉树、木麻黄、桑树等林木青枯病害发生日趋严重，造成较大经济损失，林木青枯病害已成为林业上的一种毁灭性病害。为防治青枯病发生，世界各国科研工作者进行了大量的工作，并因地制宜的提出了一些防治方法，如选用抗病品种和利用抗病砧木嫁接，轮作，培育无病壮苗，利用抑菌土和土壤添加剂调节土壤酸碱度等。但是，无病留种及上述措施的推行难度较大；化学防治药剂污染、残留过多，效果也并不十分显著；同时频发的厄尔尼诺，使全球的气候条件也越来越适宜青枯病的发生，因此，青枯病未能得到有效的控制，其危害仍在加重。近两年来，随着我省人民对生存环境质量的要求越来越高，“蔬菜残留农药超标”问题严重侵害了消费者权益，影响了城乡居民的生活质量和身体健康，已成为群众反映最强烈的问题之一。从2001年开始我省在全国率先开发治理“餐桌污染”，净化“菜篮子”。因此为了共同建立福建省食品安全法规保障体系，本研究将利用最新技术对植物青枯病的生物学、生态学和综合防治技术进行研究，达到有效预防、控制和减少青枯病害和降低蔬菜农药残留的目的，在减少对农业生产造成的损失的同时保障人民生活健康。三、国内外相关技术发展概况和趋势（一）青枯病研究进展1植物青枯病的症状植物青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的土传病害。青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）侵害寄主（特别是茄科寄主）后，寄主植物（如番茄、辣椒、茄子等）在发病时出现青枯症状，即植物的叶子萎蔫下垂。发病初期，部分叶子发生萎蔫，发病中期，大部分叶子在阳光下发生萎蔫，在早晚恢复正常，发病后期，萎蔫的叶子无法恢复。青枯萎蔫作为青枯雷尔氏菌危害寄主植物的重要致害特征。但近年来，田间也发现呈枯萎或萎蔫病状的青枯病植株，1990年在山东沂南县调查发现烟草枯萎的病株，分离到5个细菌菌株，经对各菌株致病性测定、格兰氏染色反应、细菌形态、培养性状、生理生化测定和血清学反应的鉴定，结果表明：这个菌株均属于青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）（郑继法等，1990）。图4 青枯病的为害症状在河南省上蔡县采集生姜萎蔫青枯病害姜块，分离测定结果表明，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）。因而，青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）的不同致害特征，应根据受害寄主分离细菌的鉴定确定原因。2青枯雷尔氏菌的形态特征电镜下观察，青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）（Smith，1896）的基本形态为椭圆形至长椭圆形，革兰氏染色为阴性，菌体大小为0.50.81.32.2微米，两极着色较深，不同作物上分离的青枯雷尔氏菌形态的大小、宽长比差异很大。极生鞭毛14根。电镜4万倍，大小0.831.15um，宽长比0.73电镜4万倍，大小0.751.50um，宽长比0.50电镜5万倍下显示了荚膜构造。青枯雷尔氏菌菌落形态番茄青枯病电镜1万倍下显示鞭毛青枯雷尔氏菌菌株显微照片图5 青枯雷尔氏菌的形态特征3青枯病发病规律和侵染循环图6 青枯病原菌侵染循环青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）生长极限温度为1041，最适温度为3037，病菌发生与土壤的温度、含水量和酸碱度密切相关，当土壤温度为2227，含水量超过25%，氢离子浓度251.2 nmol/L （pH6.6）时，发病最重，因此高温、高湿易诱发青枯病。此外，植株幼苗生长不壮，多年连作，中耕伤根，低洼积水，土壤偏酸等，均可促进发病，加重为害。由于青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）在土壤中存活时间长、传播快，用药剂防治不能有效地控制病害虫的发生，导致连作区烟草发病更严重，减产高达60%以上，甚至失收。青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）在一般条件下是从植株根部伤口侵入，但不能从植物气孔侵入。温室试验证明，把植株的根用消毒刀弄伤后立即接种，植株感病受害严重，而24小时后再接种植株几乎不受伤害。幼苗移栽时造成的根部伤口比成苗伤口更易引起青枯雷尔氏菌侵入。接种量大时，就是没有伤口，此菌也能侵入，一般是从次生根萌发处或根毛与皮层连接处侵入，侵入率较低。病菌进入寄主组织后即可繁殖，并进入维管束，继续向其他组织扩展蔓延，同时分泌果胶酶、纤维素毒等，分解寄主的中胶层，使寄主皮层和髓部组织残废腐烂。寄主组织破坏腐烂后，病菌落入土壤中或堆肥中越冬，来年碰到有利条件，继续侵入寄主为害。4植物青枯病的生物防治研究进展（1）无致病力青枯雷尔氏菌的利用从80年代初开始，用无致病力青枯雷尔氏菌菌株防治植物青枯病在国内外青枯病的生物防治研究和应用方面投入人力最多，发表论文最多。用无致病力产细菌素的青枯雷尔氏菌（ABPS）121菌株、日本Tanaka等用ABPSM4S菌株及其噬菌体、日本的Hara和Ono用ABPS OM2菌株、朝鲜Yi用ABPS Y61-1菌株防治烟草青枯病，任欣正等用ABPS菌株MA-7和nOE-104防治番茄青枯病，均取得温室或小区试验的良好的防效，但后期防效降低，大田试验尚未取得成功，这可能性主要由于ABPS菌株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其它微生物的竞争力所致。郑继法等研究了烟草细菌性青枯雷尔氏菌的无毒产细菌素菌株对烟草青枯雷尔氏菌4-11的防治作用。结果指出：用浸根法处理A3-5，A4-3，A1-4三个无毒菌株对致病菌4-11均有防治效果。其中A3-5防效最好，病毒情指数比治作用，病情指数比对照降低达80%，推迟发病25天，说明在烟草根际保持较高数量的A3-5，是提高其防治效果的必要条件。（2）芽孢杆菌的利用 Bacillus spp.因其易培养、易保存、有效期长等特性，较之其它生防菌更受到厂家和商家的青睐。用于防治青枯病试验的芽孢杆菌有：多粘芽孢杆菌FU6（Bacillus polymyxa）（Aspiras et al., 1985）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）（Phae et al., 1993）、凝固芽孢杆菌BA24 (B. coagulans)、蜡状芽孢杆菌BA3 （B. cereus）（Silveira et al., 1995）、巨大芽孢杆菌B1301（B. megaterium）等。刘波等从番茄病株筛选到青枯病生防菌ANTI-8098菌株，对番茄青枯病有较好的防效，经农业部药检所指定的田间药效测定表明：对茄子青枯病的防效在75-85%，菌株经德国菌种保存中心（DSMZ）鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，strain ANTI-8098A，鉴定号：ID-01-1000），并对番茄青枯病菌的致病力分化以及生防菌形态特征、生化特性、培养特性、抑菌机理、生产工艺、生物测定、大田试验进行了研究。印度Aunratha 和Gnanamanickam（1990）用Bacillus spp.B33和B36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分别取得了温室试验50%、61%和95%，田间试验50%、49%和36%的防效，同时植株鲜重和生物产值也得到提高。试验防效在45-95%。（3）链霉菌的利用 自然界70%以上的抗生素由Strepromyces spp.产生，所以很自然就有人将此类菌直接用于病害的生防。El-abyard等（1993）交替使用链霉菌菌株灰白链霉菌（Strepromyces canescens）、柠檬荧光链霉菌（Strepromyces citreco fluorescens）和极美链霉菌（Strepromyces pulcher）分别制成种衣剂处理番茄种子，可在42-63天内控制R. solanaceans造成的青枯病。（4）假单胞杆菌的利用 通过分析研究，番茄青枯雷尔氏菌的拮抗菌多数属于荧光假单孢菌属。经多次分离筛选，从土壤中分离出了对作物无不良影响而对番茄青枯雷尔氏菌有拮抗作用的菌株104个。经试验，利用这种拮抗菌防治番茄青枯病，当发病株率在25%以下时，防治效果可达100%；当发病株率达45%时，防治效果为50%左右。（5）菌根真菌的利用菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根内，而占有独特的生态位。它们从寄主得到营养成分供应，这一优势使它在与根系更紧密的联系中，获得更大的更有功能的总生物量，并以此增加对植物的作用（与仅限于根际的其它微生物相比）。因此菌根真菌作为根际群落的组成，其重要作用受到越来越广泛的承认。有些人亦捷足先登，将之用于植物病害的生物防治。印度Suresh和 Rai（1991）发现受泡囊丛枝状菌（VAM）感染的番茄根围菌根提取物可抑制R.solanacearum。在菲律宾的一项研究中，发现一种菌根可减弱番茄细菌性青枯病的严重程度（Hayward，1991）。VAM的作用可能是建立了一种机械屏障，阻止病原细菌进入寄主组织。（6）青枯拮抗菌的利用黎定军等（1997）对来自湖南嘉禾、郴县、永州、永兴、桂阳和湘西等23个烟区青枯病发病较轻的烟地根际土壤进行了室内细菌分离，获得317个菌株。测定了这些菌株对青枯雷尔氏菌拮抗性，筛选出有明显抑菌作用的菌株48个，其中最有效的拮抗菌株10个。对该10个菌株相互之间的拮抗性测定结果表明，有个菌株相互之间无拮抗作用，可在烟草青枯病的生物防治中应用。郭坚华等（1996）利用抑菌圈-定殖力双重测定法成功地筛选了青枯病生防细菌，该研究首先用平皿抑菌圈法，筛选出55个拮抗青枯雷尔氏菌的细菌菌株，将番茄幼苗在各菌菌悬液中浸根12后，栽种于温室未灭菌的土壤中，结果发现：有22个菌株在幼苗根部的定殖能力较强（终定殖密度大于104cfu/g根），其中革兰氏阴性土壤细菌占同类菌的86.3，革兰氏阳性土壤细菌占同类菌的13.0，其中有17个拮抗菌菌株在番茄幼苗根部的定殖密度超过所有致病菌。丁爱云等（1999）从山东滕州、临沂等县（市）的烟草、番茄和辣椒根际采集土壤样本15份，经内分离纯化获得细菌102株、放线菌55株。以烟草赤星病菌、野火病菌和青枯雷尔氏菌等为对象，对157个菌株进行平板对峙培养法抑菌测定，分别筛选出有拮抗活性的细菌33株和放线菌22株。郑福庆等（1998）从广东省不同地方、不同作物的根围及根际土壤中，筛选到对番茄青枯病病菌具抑菌效果的菌株20个，盆栽试验表明，这些菌株可推迟番茄青枯病发生10-35天，防治效果高达80%。 （7）基因工程生防菌的利用 中国农科院植保所康耀卫等采用转座子Tn5诱变R. solanacearum，获得了世界首例植物青枯雷尔氏菌胞外蛋白输出缺失突变体（简称eep突变体）。该突变体在缺失了多种胞外蛋白外输功能后，也失去了对寄主的致病力。eep突变体接种到植物体内后，在局部范围内有一定的定殖能力。温室和田间小区生防试验中，该突变体在30天以内有一定防治效果。虽然防效不甚理想，但在理论上该项研究代表了一个新的发展方向。而且，当eep突变体经过改造后，完全有可能进入大田实际应用。法国Trigalet和 Demery发现有6个Tn5诱变产生的无致病力青枯突变株，它们能在番茄茎、叶部定殖，它们与强致病菌株以等量或低量接种时，可阻止致病菌的增殖，具有较好的生防前景。Frey等也得到了相似的结果。（8）植物青枯病的生防菌剂研究关于青枯生防菌的生产工艺探索和研究，国内外研究者通过改进生产工艺，如营养配方、通气状态等，来提高生防菌的发酵水平，来提高生防菌的防治效果。关于青枯生防菌土壤存活基质配方研究，台湾黄振义和孙守恭教授年发现向土壤中施用一种名为S-H有机无机复合的添加物，能提高土壤中微生物含量，有效地防治和减轻青枯病害。将这种混合物做为基质，填充于研究的生防菌剂中，施用后可有利于生防菌在土地中生存繁殖，试验结果表明，用后7天土壤生防菌仍有施用时的70%以上，防效增加7%。但由于该混合物是农副产品，营养含量低、体积大，是它最大的不足之处，所以变成填充剂、做成活性基质将会影响制剂的效价，会影响生防菌的使用，生防菌存活基质有待于进一步的研究。（二）枯萎病研究现状1枯萎病的发生与危害1.1枯萎病原枯萎病是一类植物病害的总称，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫枯萎病有细菌性病原（如香蕉细菌性枯萎病等1）和真菌性病原两种2本文所指的枯萎病为真菌性病原，是由镰刀菌属真菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害3，其中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)是主要病菌种类之一尖孢镰刀菌属半知菌类（Fungiimperfecti）、梗孢目（Moniliales）、痤孢科（Tubercular）、镰刀菌属（Fusarium）自从Snyder和Hansen（1940）把镰刀菌属美丽组内的种合并为1个，成为尖孢镰刀菌（F. oxysporum）41.2寄主范围（1）经济作物：棉花、油桐、蓖麻、亚麻等5,6（2）茄科作物：番茄、胡椒、茄子、烟草、马铃薯等7,8（3）瓜类作物：黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜等9（4）豆科作物：大豆、四季豆、豇豆、猪屎豆、豌豆等10（5）花卉植物：康乃馨、郁金香、鱼尾菊、非洲菊、鸢尾、水仙、翠菊、合欢、百合、仙人掌、穿心莲、一品红、草坪草等11,12（6）林果植物：松树、相思树、柑桔、沙棘、水杉、铁线莲属植物、梨树等13,14（7）其它植物：莴苣、小麦、大蒜、荸荠、芦笋、姜、香蕉等15,161.3危害症状植株被尖孢镰刀菌侵染后，发病症状多种多样17，一般导致维管束枯萎、植株枯黄、球茎和根腐烂，植株生长衰弱2植株发病后，最初的症状表现嫩叶上出现轻微的褪绿9，而后老叶开始下垂苗期植株发病后迅速死亡18；成株期产生叶脉失绿和叶片下垂，植株生长缓慢、下部叶片黄化、不定根形成、叶片和嫩茎萎蔫、落叶、剩余叶片边缘坏死，最终导致全株死亡19维管束组织的褐变是尖孢镰刀菌引起的枯萎病最明显的特征20，在较老的植株上，从盛花期到果实成熟期，症状会变得更明显21,221.4侵染方式尖孢镰刀菌在土壤中营兼性寄生，它的腐生能力使得它可在土壤中长期生存23，在植株残株上也可以生存24这些真菌以菌丝体或3种孢子（小型分生孢子、分生孢子、厚垣孢子）中的任何一种存活25尖孢镰刀菌的孢子萌发管或菌丝体的侵入部位为植物根部，可直接从根尖、根部伤口或是在侧根生长点进入植株体 26一旦进入植株体内，菌丝体就在根皮层细胞间生长，当菌丝体到达木质部后，通过木质部的纹孔侵入导管，而后在导管中向上生长，至植株的茎和顶部27病原菌丝体生长过程会产生分枝、生成小型分生孢子，小型分生孢子顺着导管从下往上移动，当小型分生孢子萌发时，菌丝体会穿透木质部上层壁，在相邻的导管中产生更多的小型分生孢子28同时，尖孢镰刀菌也会通过木质部的纹孔横向进行进一步扩展由于病原菌在植株维管组织内的生长，植株的营养和水分供应受到了很大的影响，导致叶片气孔的关闭、萎蔫和植株的整体死亡27这时，病原菌侵入植株的软组织，直至最终到达死亡组织的表面，在那里大量地产生孢子，这些孢子又成为病原菌进一步扩散的接种体291.5传播途径枯萎病原菌以菌丝体、分生孢子、厚垣袍子在土壤及未腐熟的带菌绿肥中越冬，种子也可带菌尖孢镰刀菌的短距离传播主要是通过灌溉水和带菌的农用器具30长距离传播是通过带菌的种苗和土壤，也可以通过风进行孢子传播尽管病原菌有时也会侵染果实和种子，但通过种子传播的可能性很小311.6病害流行在我国南方，作物枯萎病中以瓜类枯萎病发生最为严重；在我国北方，以棉花枯萎病发生最为严重32枯萎病在植株的全生育期均可发生，一旦发病，就难以根除，随着连作年份的增加，发病率越发严重3320世纪90年代以来，我国设施蔬菜瓜类作物面积不断增加；由于在相对封闭的设施内形成的特殊小气候既有利于蔬菜生长，也成为各种病虫害滋生的温床，加之长年连作，使土壤中病原菌的数量不断增加，设施栽培蔬菜的枯萎病发生越来越重34作物枯萎病一般导致减产2030%，严重田块可达5080%，甚至绝产，已成为限制着我国作物生产发展重要因素352枯萎病原菌的微生物学特性2.1菌落形态在固体培养基（PDA）上，尖孢镰刀菌的不同专化型有不同的菌落形态36,37一般来说，最初的气生菌丝是白色的，而后不同的专化型菌落有着各种不同的颜色，从淡紫到深紫红色38分生孢子座在很多情况下，会出现奶油色或桔黄色病原菌在不同培养基上菌落直径大小、颜色、形态及产孢量均有所不同392.2孢子形态尖孢镰刀菌产生3种孢子，即小型分生孢子、分生孢子和厚垣孢子37小型分生孢子椭圆形，有01隔，产生量最多，是在被侵染植株导管中产生量最多的孢子类型分生孢子镰刀形，有35隔，这些孢子一般可在死亡植株的表面和分生孢子座群中发现38厚垣孢子为圆形，从老的菌丝体或分生孢子上产生，01隔分生孢子萌发的温度范围为836，最适温度为2830，pH值范围为310，最适pH为57菌丝生长的温度范围为834，最适温度为2628，pH值范围为310，最适pH为671998年对新疆棉花耐高温枯萎病菌HAI-17的分生孢子形态测定结果表明，HAI-17菌能在40下生长，易产生粘性分生孢子团，分生孢子镰刀形，大小为31.849.5 5.17.6 412.3 专化型枯萎病原菌存在着种下分化42，种下设生理型（form），后改称为专化型（forma specialis）43朱天圣等研究广东苦瓜枯萎病原菌，结果表明广东苦瓜枯萎病由尖孢镰刀菌（F oxysporum）侵染引起，经5科15种不同属植物接种专化型研究证明，该尖孢镰刀菌属苦瓜专化型（F. oxysporum Schl .f. sp. momordicae）44至今已报道的尖孢镰刀菌专化型有80多种，其中瓜类枯萎病菌有8个专化型： F. oxysporum Schl. f. sp. cucumerinum Owen，尖孢镰刀菌黄瓜专化型43； F. oxysporum Schl. f. sp. niveum (E.F.Smith) SnyderHansen，尖孢镰刀菌西瓜专化型45； F. oxysporum Schl. f. sp. melonis SnyderHansen，尖孢镰刀菌甜瓜专化型46； F. oxysporum Schl. f. sp. luffae Kwai, Suzuki & Kawai， 尖孢镰刀菌丝瓜专化型43； F. oxysporum Schl. f. sp. lagenariae Matuo & Yamamoto，尖孢镰刀菌葫芦专化型47； F. oxysporum Schl. f. sp. momordicae Sun S.K.Huang J.W.，尖孢镰刀菌苦瓜专化型48； F. oxysporum Schl. f. sp. benincasae Gerlagh M. & Ester A.，尖孢镰刀菌冬瓜专化型49； F. oxysporum Schl. f. sp. cucurbitacearum Gerlagh M.Block W.J.，黄瓜专化型502.4生理小种在尖孢镰刀菌的专化型下面，根据致病力的差异又划分为许多生理小种专化型和生理小种的鉴别，对于抗病育种、植物检疫以及病害防治，具有重要的理论和实际意义51同一专化型的枯萎病原菌在不同的地区，存在着明显的致病性分化，形成不同的生理小种52将西瓜、甜瓜和冬瓜枯萎病菌专化型，分别接种于幼苗期和成株期7种葫芦科作物后，相应的专化型菌均严重侵害寄主，而非专化型菌一般轻度或不侵染相应的寄主，各菌株具有高度选择致病性53，形成不同的生理小种尖孢镰刀菌专化型的生理小种分化在同工酶上存在着差异1989年在郑州、开封两市郊区采集的黄瓜、西瓜、瓠瓜和冬瓜枯萎病菌，经同工酶谱测定的结果表明4个专化型的酶谱有明显不同54鉴别寄主的抗感鉴定，可以区别尖孢镰刀菌的生理分化，用Armstrong等所采用的鉴别寄生MSU8519，MSU441034、PI390265进行“抗”或“感”的反应测定，结果证明国内黄瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌存在生理小种的分化55,56 2.5亲和群营养体亲和性是尖孢镰刀菌专化型生理小种分化鉴定的方法之一营养体亲和性鉴定方法是国外最近发明的一种新技术，这种方法利用了突变体的互补性以及遗传关系，测定两个被测菌株亲和的特性，同一生理小种菌株的菌落才能相互亲和生长56在分离、鉴定侵染黄瓜的尖孢镰刀菌的基础上，测定了30个尖孢镰刀菌菌株（包括6个专化型）对黄瓜的致病性和营养体亲和性，研究结果表明，侵染我国黄瓜的尖孢镰刀菌至少有5个以上的营养体亲和群（VCGs），除来自黑龙江的9909-1菌株与黄瓜根茎腐专化型（F. axysporum f. sp. radicis-cucmeinun, FORC）菌株属同一亲和群外，其它菌株均与希腊的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum. f. sp. cucumerinum, FOC）和FORC不亲和，所测定的尖孢镰刀无致病力菌株均与致病株不亲和，不同专化型的尖孢镰刀菌菌株归属于不同的营养体亲和群研究结果初步显示了应用营养体亲和性区分菌的致病性及专化型生理小种的可能性572.6 DNA序列同源性选取从河南棉花上分离的尖孢镰刀菌异核体菌株Agl49及其两个表型差异显著的同核型分离子Agl49-I和Agl49-III为材料，对它们的核糖体基因ITS区段进行测序分析结果表明，供试菌株核糖体基因ITS区段碱基组成完全相同，与GenBank中镰刀菌的ITS区序列进行同源性比较发现，属内种间的同源性在3499%之间，而大部分尖孢镰刀菌种内不同菌株之间的同源性均在98%以上序列分析表明，ITS区对于镰刀菌属内种间的差异鉴别具有参考价值，但并不适合于尖孢镰刀菌种内或种以下水平的鉴定和分类1393枯萎病原菌的生理生化3.1 毒素作用尖孢镰刀菌的致病力表现在毒素的作用，尖孢镰刀菌生长过程会分泌胞外毒素58利用遗传背景一致而抗病性不同的棉花品种岱-16的变异品系接种棉花枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. vasinfectum），并用尖孢镰刀菌粗毒素处理后，棉苗维管束的病理变化研究结果表明，接种枯萎病菌后，病株茎部导管及薄壁细胞中有尖孢镰刀菌菌丝存在，粗毒素处理能引起棉苗维管束的病理变化58粗毒素可用于品种抗性鉴定，用苦瓜枯萎病菌滤液-粗毒素测定苦瓜不同品种的苗期抗性，所得结果与常规人工苗期接种鉴定结果基本一致，因此采用病菌滤液来测定苦瓜苗期对枯萎病抗性的方法是可行的59尖孢镰刀菌产生一种非寄主特异性致病毒素-葡萄糖苷酶，在枯萎病病程中起着降解细菌壁纤维素而破坏植物细胞组织的作用王纯利等测定了28个采自新疆棉花上的菌株，发现其镰刀菌酸的产量极不稳定，且与致病力强弱无关，而-1,4葡萄糖苷酶活性与致病力存在显著相关性；表明-1,4-葡萄糖苷酶作为枯萎病原菌毒素，影响尖孢镰刀菌致病力60, 3.2 蛋白抗原通过尖孢镰刀菌菌丝和孢子蛋白抗原的制备，可进行枯萎病菌的特异性测定Sorbo等61以棉花枯萎病菌菌株为材料，用Lannelli法提取菌丝孢子蛋白抗原62，按改进的Devay免疫方案制备抗血清63，琼脂双扩散测得效价达1/64Linfield等64用琼脂双扩散(比较)对流免疫电泳间接ELISA及SPA-ELISA四种方法测定血清的特异性，结果表明4种检测方法基本上均能鉴别到尖孢镰刀菌种的水平，但不能鉴别到种以下的分类单位；4种方法检测所达的灵敏度约为4.862510-2，用于鉴定枯萎病菌的存在灵敏度较高但是，血清学用于枯萎病原菌致病力分化的鉴别难度较大653.3 抗性蛋白尖孢镰刀菌致病力因寄主的抗性而异，抗性等级不同的寄主，存在着抗性蛋白的差异66用SDS-PAGE方法分析了4种感枯萎病和抗枯萎病棉花后代的种子蛋白，结果表明棉花种子蛋白主要有分子量为14 KDa、16 KDa、23 KDa、27 KDa、3