资源描述
湖南农业大学
硕士学位论文
马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的适应性研究
罗 杰
二0一四年五月
分类号 密 级
U D C 单位代码 10537
湖南农业大学
硕 士 学 位 论 文
马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的适应性研究
Adaptability research of Ditylenchus destructor response to low dose of nematicides
研究生姓名
罗 杰
指 导 教 师
丁中 副教授
学 科 专 业
农药学
研 究 方 向
农药毒理及有害生物抗药性
提交论文日期 论文答辩日期
答辩委员会主席 论文评阅人
学位授予日期
二○一四年五月
独 创 性 声 明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名： 时间： 年 月 日
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研究生签名： 时间： 年 月 日
导师签名： 时间： 年 月 日
摘 要
热激蛋白70（Heat shock proteins，Hsp70s）是热激蛋白家族中最重要的一类家族成员，广泛存在于原核生物和真核生物的细胞区室和器官中，其序列高度保守。马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是引起植物病害的重要病原物之一，每年给农业生产带来巨大的损失。杀线虫剂施用后主要以低剂量的形式存在于土壤中。
本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）三个热激蛋白70基因，分别命名为Dd-Hsp70-A（GenBank登录号KF792307）、Dd-Hsp70-C（GenBank登录号JQ422276）和Dd-Hsp70-F（GenBank登录号JQ422277），并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量（10、1、0.1、0.01和0.001µg/mL）杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理24h后，三个热激蛋白70基因表达量的变化。
结果表明，Dd-Hsp70-A基因的cDNA全长为2081bp，开放阅读框为1938bp，编码了645个氨基酸；Dd-Hsp70-C基因的cDNA全长为2436bp，开放阅读框为2019bp，编码了672个氨基酸；Dd-Hsp70-F基因的cDNA全长为2092bp，开放阅读框为1959bp，编码了652个氨基酸。同源性分析结果表明，三个基因与其他线虫的热激蛋白70基因具有较高的同源性，含有HSP70家族高度保守的基序。Dd-Hsp70-A的基因组由11个外显子和10个内含子组成；Dd-Hsp70-C的基因组由13个外显子和12个内含子组成；Dd-Hsp70-F的基因组由11个外显子和10个内含子组成。蛋白质预测结构表明，克隆所得的三个基因在N端均形成了ATP酶结构域，在近C端均形成了底物肽结合结构域和C端结构域。
qRT-PCR分析结果表明，经热激及低剂量阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理后，Dd-Hsp70-A基因与对照组相比较出现较明显的上调表达，Dd-Hsp70-C基因和Dd-Hsp70-F基因的表达与对照组相比较无显著性差异（P<0.05）。由此推测Dd-Hsp70-A基因为诱导型，Dd-Hsp70-C基因和Dd-Hsp70-F基因为组成型。生物学特性研究结果表明，残留在土壤中的阿维菌素对马铃薯腐烂茎线虫的影响较小，而涕灭威药剂对马铃薯腐烂茎线虫的影响相对较大。结果为深入研究植物寄生线虫在低剂量杀线虫剂处理下的应对机制提供了基础资料。
关键词：马铃薯腐烂茎线虫，热激蛋白70，杀线虫剂，基因表达
Abstract
Heat shock protein 70 kDa (Hsp70s) is the most important proteins among of heat shock proteins，which are widely existsd in cell chamber and organs of both prokaryotes and eukaryotes with a highly conserved sequence．Potato rot stem nematode(Ditylenchus destructor) is one of important pathogens of sweet potato in China, and the enormous yield losses to agriculture is very great annually. After the nematicide application，rudimental nematicide exists mainly in the form of low-dose in soil.
In order to understand the effect of low does of nematicides on Hsp70s mRNA expression，three Hsp70 genes，Dd-Hsp70-A (GenBank accession No．KF792307)、Dd-Hsp70-C (GenBank accession No．JQ422276) and Dd-Hsp70-F (GenBank accession No．JQ422277)，were cloned from Ditylenchus destructor using RT-PCR and RACE techniques，and the mRNA expression levels of D.destructor treated by low dose (10、1、0.1、0.01、0.001µg/mL) of abamectin, profenofos and aldicarb were analyzed using Real-time PCR after 24 h．
The full-length cDNA of Dd-Hsp70-A was 2081 bp which with anopen reading frame (ORF) of 1938 bp and encoding 645 amino acids residues；the full-length cDNA of Dd-Hsp70-C was 2436 bp with an open reading frame (ORF) of 2019 bp encoding 672 amino acids residues； the full-length cDNA of Dd-Hsp70-F was 2092 bp，which with anopen reading frame (ORF) of 1959 bp encoding 652 amino acids residues．Homology analysis indicated that thosethree genes all contained a highly conserved sequence of Hsp70 family and were highly homologous to Hsp70genes in other nematodes．The structure of Dd-Hsp70-A,Dd-Hsp70-C and Dd-Hsp70-F genomic include 11 extonsand 10 introns，13 extonsand12 introns，11 extonsand 10 introns,respectively．The predicted protein structure showed that the three genes all had ATPase fragment at the N-terminal and developed substrate peptide and C-terminal domains near the C-terminal．
After treated by heat shock and low dose emanectinbenzoate，profenofos and aldicarb，the expression levels of Dd-Hsp70-A increased significantly compared with control，while Dd-Hsp70-C and Dd-Hsp70-F showed no significant difference（P<0.05）．It is speculated that Dd-Hsp70-A is inducible，Dd-Hsp70-C and Dd-Hsp70-F are constitutive．The results presumed that emamectin benzoate which residues in soil has less effects on D. destructor, aldicarb has more effects on D. destructor.The results provide useful information for further research mechanisms of nematodes response to low dose of nematicides．
Keyword：Ditylenchus destructor，Hsp70s，nematicide，gene expression
目 录
第一章 文献综述 1
1 马铃薯腐烂茎线虫研究进展 1
1.1 马铃薯腐烂茎线虫简介 1
1.2 传播途径及症状特点 1
1.3 化学防治 2
2 热激蛋白70基因研究进展 2
2.1 Hsp70的分类 3
2.2 Hsp70的结构及生化特点 3
2.3 胁迫因子 4
2.4 Hsp70在生物胁迫生境中的适应性作用 4
3 本研究的目的和意义 5
第二章 马铃薯腐烂茎线虫三个热激蛋白基因的克隆与序列分析 7
1 材料和方法 7
1.1 供试线虫 7
1.2 主要试剂和仪器 7
1.3 方法 8
1.4 序列分析 21
2 结果与分析 21
2.1 马铃薯腐烂茎线虫Hsp70基因的克隆 21
2.2 马铃薯腐烂茎线虫Hsp70基因的序列分析 25
2.3 系统发育树分析 28
3 讨论 29
第三章 不同药剂处理的马铃薯腐烂茎线虫Hsp70基因表达差异分析 31
1 材料和方法 31
1.1 供试线虫及药剂 31
1.2 实验仪器 31
1.3 主要试剂 31
1.4 线虫的处理 31
1.5 RNA提取及第一链cDNA的合成 32
1.6 荧光定量PCR引物设计 33
1.7 荧光定量PCR 33
2 结果与分析 34
2.1 熔解曲线和标准曲线分析 34
2.2 热激处理后表达量分析 35
2.3 低剂量杀线虫剂处理后表达量分析 36
3 讨论 37
第四章 不同药剂处理的马铃薯腐烂茎线虫生物学特性分析 39
1 材料和方法 39
1.1 供试线虫及药剂 39
1.2 实验仪器 39
1.3 主要试剂 39
1.4 种子催芽 40
1.5 根系染色 40
1.6 线虫的处理 40
1.7 侵染试验的设计 40
2 结果与分析 41
3 讨论 44
第五章 论文总结 45
参考文献 47
英文缩略表 53
致 谢 54
作者简介 55
V
第一章 文献综述
1 马铃薯腐烂茎线虫研究进展
植物寄生线虫是引起植物病害的主要病原物之一，据报道，植物寄生线虫每年对全世界农作物造成的损失约1 250亿美元（Chitwood D J et al.,2003）。其中，根结线虫、孢囊线虫以及茎线虫对农作物造成的危害最严重，是最具经济严重性的植物寄生线虫（Davis E L et al.,2004）。马铃薯腐烂茎线虫在我国的农业生产尤其是甘薯生产中造成了巨大危害，现已列为我国重要的植物检疫性有害生物（中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007）。
1.1 马铃薯腐烂茎线虫简介
马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor Thorne，又称马铃薯茎线虫、甘薯茎线虫，于1945年作为一个单独的种从起绒草茎线虫Ditylenchus diPsaci中分离（Thorne，1945）。
D.destructor属于线虫门（Nematoda）、线虫纲（Nematoda）、垫刃目（Tylenchida）、垫刃总科（Tvlenchoidea）、粒线虫科（Anguinidae）、粒亚科（Anguininae）、茎线虫属（Ditylenchus）（FiliPjev，1936）（谢辉，2005)。
雌虫：虫体为线形，侧线6条，热激杀死后虫体略向腹面弯曲。头部低平、略缢缩，口针有显著的基部球，中食道有瓣，呈纺锤形，后食道腺短，覆盖肠的背面，偶尔缢缩。前伸性单卵巢，有的可伸达食道区，后阴子宫囊较长，是肛阴距离的40%-98%。尾端呈圆锥形，通常向腹部弯曲，端圆。
雄虫：虫体的头部和尾部形态与雌虫相似。其交合剡伞可伸到尾部的50-90%，交合刺长24-27 μm。
现在，马铃薯腐烂茎线虫病己成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，由其是近年来，己上升成为北方薯区最严重的病害，一般发病地块可减产20%-50%，重病地块甚至基本绝产（周忠等，2003），因此马铃薯腐烂茎线虫的防治和抗性研究迫在眉睫。
1.2传播途径及症状特点
马铃薯腐烂茎线虫主要通过被侵染的植物的地下器官如根茎、鳞茎、块茎等以及粘附在这些器官上的土壤进行传播，在田间还通常通过农事操作和水流进行传播。
马铃薯腐烂茎线虫一般为害寄主植物的地下部分。马铃薯遭受虫害后，其薯块表皮下会形成白色的小斑点，随时间推移，斑点的颜色会逐渐扩大并变成淡褐色，组织也逐渐软化以致中心变空，虫害严重时，表皮会裂开并皱缩，内部组织颜色变为灰色、暗褐色至黑色，呈干粉状。甘薯遭受虫害时，在苗期，苗茎基部出现白色斑点，后逐渐变为黑色，髓部呈紫红色或褐色，地上部分苗稀、矮黄；茎蔓受害则会出现髓部变白发糠，严重时表皮破裂，褐色干腐，蔓短、叶黄，甚至主蔓枯死。薯块发病通常表现为糠心或（和）糠皮。马铃薯腐烂茎线虫对花卉侵染的一般是从基部开始的，向上蔓延到肉质鳞片处，引起组织由灰色到黑色坏死，根部变黑，叶片生长不良，叶尖枯黄。
1.3 化学防治
线虫的综合防治除了增强进出口及国内物种流动的检疫工作外，还包括农业防治如轮作、种植抗性品种、调节作物播种期以及土壤改良、田间清洁等；物理防治如筛选、热处理、灌溉及射线或超声波处理等；生物及天敌防治。目前，化学药剂的防治仍旧是综合防治工作中最重要的手段之一。用于防治植物寄生线虫的化学药剂主要为非熏蒸类，如氨基甲酸酯类、有机磷类、大环内酯等化合物。如氨基甲酸醋类有克百威、涕灭威等，有机磷类有丙溴磷、丙线磷、甲基异柳磷等，大环内醋类有阿维菌素等。线虫一般分布于土层，非熏蒸类药剂的施用主要有根苗浸渍、拌种、沟施和灌根等方法，未降解的药剂主要残留在土壤中，化学农药的长期施用对线虫也将产生一定的影响，产生抗药性便是其中的一个方面，2007年丁中等发现，河北涿州、抚宁和卢龙三地的马铃薯腐烂茎线虫对涕灭威的抗性倍数分别为4.0、3.7和3.5倍，对灭线磷的抗性倍数分别为3.8、1.6和2.1倍(丁中等,2007)。
目前，杀线虫剂对线虫的毒理学研究主要在高剂量或常量处理下进行研究，然而，由于其施用方法主要为土壤处理，这就使得大部分杀线虫剂残留在土壤环境中。通常药剂施用量的20%-70%可以在土壤中形成结合残留，农药残留物与土壤结合会暂时降低其毒性，但随着田间的重复施用，结合残留量逐步增加，在一定条件下便会释放出来，由结合态转化为游离态。因此，土壤环境中具有生物活性的农药往往是以低剂量的形式存在的，对低剂量效应的研究更贴切真实环境。
2 热激蛋白70基因研究进展
在自然环境，所有生物都必须应对环境和生理的压力。因此，为了生存，生物体就必须拥有一系列的保护机制来适应这些压力胁迫，诱导合成热激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）就是其中之一。
Hsps广泛存在于原核和真核生物体中，其种类繁多。大多数Hsps分类法都是根据分子量来划分的，现在应用最广泛的是森本的划分方法，主要将Hsp分为4大家族：Hsp90家族（分子量约83～100 kDa）、Hsp70家族（分子量约66～78 kDa）、Hsp60家族和小分子量（sm HSP）家族（分子量约12～43 kDa），其中Hsp70家族是生物体内最保守也是最重要的热激蛋白家族（Graham et a1．，2007），在几乎所有生物的应激细胞中均能被高度诱导。
2.1 Hsp70的分类
依据划分的标准不同，对Hsp70家族的分类也不尽相同，大致可分为以下4类：第1类是Hsp70，也被称作Hsp72，它在正常细胞中通常并不表达或表达量很少，在热应激或其它胁迫因子的作用下，其表达快速增加，属于诱导型Hsp70；第2类是Hsc70（heat shock cognate 70，热应激同源蛋白70），也被称作Hsp73，属于细胞内的结构蛋白，一般在所有的细胞内均能表达，但它不受热诱导，属于结构型Hsp70，与第1类Hsp70具有高度的序列同源性和相近的生物化学特性；第3类是GRP78（glucose regulated protein78，葡萄糖调节蛋白78），这种蛋白主要存在于内质网腔内（Volkeretal．，2008）；第4类是GRP75，一般位于线粒体内，它和GRP78在应激胁迫时稍有表达（林钟婷等，2007）。
2.2 Hsp70的结构及生化特点
Hsp70具有两个主要的结构域：第一个是位于N端高度保守的44kD结构域，它也是ATP的结合区，第二个是位于C端的25kD的肽链识别结合区。其中，位于C末端的结构域又可划分成一个保守的15kD的多肽结合功能域和一个相对不保守的近C端10kD的可变区功能域（有研究认为它可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关，但结构尚不明确 （陈劲松，2001）），以及位于C端最末端的保守基序（Motif），研究表明不同类型的Hsp70成员的保守基序是特异性的，定位于细胞质中的Hsp70的保守基序序列为EEVD，定位于内质网中的保守基序序列为KDEL/HDEL，定位于线粒体中的为PEAEYEEAKK（Guy et aL，1998）。同时，氨基酸序列的一个保守基序GDAW，该基序是线粒体和变形细菌特有的，也可将它作为线粒体Hsp70的标志。
Rezaie 研究表明，大多数生物的诱导型HSP70均不含内含子的，转录后也不需要经过剪切加工，在应激条件下可优先表达，起着保护机体的分子伴侣作用（Rezaie et al.2000）。也有研究表明真核生物细胞质HSP70在近C端具有一段简并重复的4肽序列GGMP，且该重复序列的存在与否亦可用于区分HSP70的诱导型和组成型。同时，HSP70家族存在三段签名序列：IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPK（Ravaux J el a1．，2007），这些研究依据均可用于Hsp70的确定。
Hsp70具有以下三种生化特性：（1）它们的氨基端存在弱的ATPase活性；（2）当ATPase被激活时，它们可与伸展的多肽进行结合；（3）它们亦可保护各种酶免受热激破坏，使聚合的蛋白质解聚（Daugaard el a1．，2007）。
2.3 胁迫因子
在自然界，所有生物均不可避免地遭受各种胁迫因子的影响。胁迫（stress）在生物学意义上是指环境对生物的一种逼迫和压力状态；胁迫因子则是指那些超出正常变动范围的生态因子。它们通常作为限制因素影响生物的生长发育、生存和生理功能，从一定程度上形成了生物有机体的选择压力和进化动力。
表1-1 诱导Hsp70表达的相关因子
Table 1-1 Ecological relevant inducers of Hsp70
相关来源
参考文献
环境因子
温度
(Jenkins et al.,1997；Goto et al.,1998；Sonna et al.,2002)
重金属离子
(Werner,Nagel 1997；Tedengren et al.,1999)
杀虫剂
(Yang et al.,2002；Nazir et al.,2003)
辐射（UV）
(Trautinger et al.,1996；Kiriyama et al.,2001)
含氧量
(Ma,Haddad 1997)
密度
(Sorensen,Loeschcke 2001)
盐度
(Diamant et al.,2001；Drew et al.,2001；Spees et al.,2002)
湿度
(Alamillo et al.,1995；Tammariello et al.,1999)
寄生
(Rinehart et al.,2002)
氧化胁迫
(Ropp et al.,1983；Gophna,Ron 2003)
遗传因子
衰老
(Wheeler et al.,1999)
近交
(Kristensen et al.,2002)
突变
(Sherman,Goldberg 2001；Zhao et al.,2002)
2.4 Hsp70在生物胁迫生境中的适应性作用
Hsp70作为分子伴侣其分子和生理功能在生物学的许多领域得到了广泛研究（Parsell & Lindquist，1993；Pockley，2003；Morimoto et al．，1999）。现在，更多的学者开始从生态角度分析Hsps在生物胁迫生境中的适应进化作用。
2.4.1 Hsp70与生物抗胁迫能力有关
当生物在环境中受到胁迫时，往往会产生Hsp70来抵抗胁迫逆境。研究表明，果蝇幼虫在太阳照射下体内Hsp70大量诱导表达时，可以抵抗40℃的高温胁迫（Feder et al．，1997）；Hsp70的诱导表达也能增加生物对杀虫剂的抵抗（Yang et al．，2002；Nazir et al．，2003）。
2.4.1 Hsp70的表达丰度代表生物对胁迫的反应强度
大量研究都希望通过应用Hsp70的表达情况来建立环境和生物变量间的联系，以寻找生物适应进化的依据，而大都结果也都证明Hsp70的表达确实与环境胁迫梯度存在关联。因此，Hsp70被用作为一种生物指示因子，用于对生物造成胁迫的环境因子的监测，这在土壤和海洋生物中得到了大量的研究与应用（Sanders，1993；Dyer，1994）。
2.4.2 Hsp70的表达需要代价
除非环境条件突然变得残酷起来，否则生物是不表达Hsp70的，随时都会出现的环境波动也不能诱导Hsp70的表达，因为生物在应对胁迫生境时体内Hsp70的表达累积是需要付出细胞生长和繁殖为代价的（Feder et al．，1992；Krebs & Loeschcke，1994）。已有研究发现：热激蛋白的合成是一个能量消耗过程（Koehn and Bayne，1989；Hoffmann，1995），并且，往往的结果是以降低其他蛋白的合成作为代价的（Parsell and Lindquist，1993；Morimoto et al．，1994）。形生Hsp70以提高自身的耐胁迫能力，同时又产生生长发育等方面适应性的降低，生物体在这两者的均衡间适应和进化。
3 本研究的目的和意义
线虫是土壤中广泛存在的无脊椎动物，它在土壤生态系统中发挥着重要功能。土壤线虫对生存环境的变化具有很高的敏感性，具有对环境的各种变化包括低剂量化合物能做出较迅速的应对反应等特点。化学药剂的防治目前仍然是植物寄生线虫综合防治中重要的手段之一。用于防治植物线虫的化学药剂主要是非熏蒸类，如大环内酯的阿维菌素、有机磷类的丙溴磷、氨基甲酸酯类的涕灭威等几类化合物。由于非熏蒸类杀线虫剂的施用方法主要是土壤处理，使得大部分杀线虫剂残留在土壤环境中，在土壤环境中具有生物活性的农药往往以低剂量形式存在。已有大量的杀虫剂相关文献报道，低剂量杀虫剂可提高害虫对环境的适合度包括生活力和繁殖力，引起害虫生物学、生态学行为的改变等，从而诱导害虫再猖撅。同时低剂量杀线虫剂可能会对线虫产生胁迫，从而诱导Hsp70的表达，而Hsp70的表达丰度与生物对胁迫的反应强度相关联。因此，本课题克隆了3个马铃薯腐烂茎线虫Hsp70基因的全长，并比较研究了三个基因在阿维菌素、丙溴磷和涕灭威这三种药剂低剂量作用下的表达差异，同时通过胡萝卜根系侵染试验了解了线虫在低剂量杀线虫剂处理后的生物学特性影响，以期为进一步理解植物寄生线虫在低剂量杀线虫剂胁迫生境中的适应性以及为合理使用杀线虫剂提供科学依据。
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第二章 马铃薯腐烂茎线虫三个热激蛋白基因的克隆与序列分析
自然环境中，所有的生物都必须面对环境和生理的压力胁迫。因此，为了生存，生物体就需要生成一系列的保护机制来适应这些压力，诱导蛋白质（如Hsp70）的合成就是应对机制之一，大量研究结果已证实Hsp70在生物体获得热激忍受力中起了重要作用（Lansing et a1．，2000；Krebs，1999； Denlinger et a1．，2001；Sorensen et a1．，2003）。因此，克隆分析马铃薯腐烂茎线虫Hsp70基因以及研究该类基因受温度、化学农药胁迫后表达量的变化情况，不但为深入开展马铃薯腐烂茎线虫抗逆适应性机制研究奠定理论基础，而且可以为该线虫的综合治理提供帮助。
研究表明，线虫mRNA的5′ 端普遍存在剪切引导序列（Trans-spliced leader，SL1）（Blaxter and Lius,1996），在秀丽小杆线虫（Bektesh et al.，1998）、马来丝虫（Takacs，1988）、马铃薯金线虫（ Jones et.al., 2004）和马铃薯腐烂茎线虫（丁中等，2007，2008）中均存在SL1序列。本文采用SL1序列扩增抗氧化酶基因5′ 端，结合RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫Dd-Hsp70-A、Dd-Hsp70-C和Dd-Hsp70-F基因。
1 材料和方法
1.1 供试线虫
马铃薯腐烂茎线虫为本实验室用半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)在25℃条件下进行纯培养(徐进军等，2004；丁中等，2008)。
1.2 主要试剂和仪器
TRIzol、Kiit Dynbeads® mRNA DIRECTTM Kit购自美国Invitrogen公司；蛋白酶K购自德国Roche公司；pGEM-Teasy载体购于美国Promega公司；RNA PCR Kit（AMV）、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase、pMD®18-T载体、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、EX Taq DNA聚合酶、SYBR Premir EX Taq以及DNA Marker购于大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞以及琼脂糖胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他生化试剂购于美国Sigma公司或国产分析纯。
LB培养基：酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L），胰蛋白胨（10 g/L），用1 mol/L 的NaOH调节PH值至7.0。
PDA培养基(L)：马铃薯去皮，切片，称取200 g蒸馏水煮沸20 min，用沙漏过滤，滤液中加入15 g琼脂、18 g葡萄糖，再用蒸馏水定容至I L，锥形瓶分装后高压蒸汽灭菌，备用。
DEPC处理水：将2 L的锥形瓶浸泡于含0.1 % DEPC的蒸馏水中过夜处理，然后高压蒸汽灭菌；向锥形瓶中加入1.5 L的蒸馏水和1.5 mL DEPC，摇匀后高压蒸汽灭菌，备用。
X-Gal（20 mg/ml）：称取 100 mg X-Gal置于50 ml容量瓶中，加入二甲基甲酰胺( N,N-dimethylformmide)定容至50 ml，充分溶解混匀后，用0.22 µM 无菌滤膜过滤灭菌，分装后于-20℃ 保存备用。
IPTG (20 mg/ml)：称取 100 mg IPTG 置于5 ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至5 ml，用0.22 µM无菌滤膜过滤灭菌，分装后于-20℃ 保存备用。
氨苄青霉素（Ampcillin）（100 mg/ml）：称取 1 g Ampcillin 于10 ml容量瓶中，加入去离子水定容至10 ml，待充分溶解混匀后，用0.22 µm 无菌膜过滤灭菌，分装后于-20℃ 保存备用。
蛋白酶 K（600 mg / ml）：称取 30 mg 蛋白酶 K置于50 ml容量瓶中，加入去离子水定容至50 ml；使用0.22 µM 无菌滤膜过滤，于-20℃保存备用。
LB / Ampicillin液体培养基(1 L)：按质量体积比1:1000的比例将Ampicillin(100 mg / mL)加入已灭菌的LB液体培养基中，常温备用。
LB / Ampicillin / IPTG / X-Gal平板：将高压蒸汽灭菌后的LB培养基常温冷却至60℃左右时(超过60℃Ampicillin会失效)，在超净工作台中将0.1% IPTG (20 mg/ml)、0.1% Ampicillin（100 mg / ml）和0.2% X-Gal（20 mg/ml）加入到LB培养基中，溶解混匀后倒平板于灭菌的培养皿中，4℃倒置避光保存备用。
50×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：100 ml 去离子水中加入3.72 g Na2EDTA·2H2O ，24.2 g Tris 碱和5.71 ml 冰醋酸，充分溶解混匀后灭菌备用。
1.3 方法
1.3.1 马铃薯腐烂茎线虫总RNA的提取
线虫总RNA的提取采用TRIzol法，步骤如下：
（1）将皿盖上分离下的马铃薯腐烂茎线虫用灭菌水洗涤3次，加入无RNAase的1.5 ml Eppendorf离心管中，立即加入1 ml TRIzol溶液，反复摇匀；
（2）将离心管在液氮和37℃水浴中交替放置30s，反复冻融6-7次；
（3）将上述离心管在室温下静置5 min，再使用高速冷冻离心机4 ℃ 12000 rpm离心10 min；
（4）将上述所得上清液小心吸取转入另一新离心管中，再加入0.2 ml氯仿，反复振荡摇匀，室温下静置10 min；
（5）将上述离心管放入高速冷冻离心机中，4 ℃ 12 000 rpm离心15 min；
（6）用移液枪小心吸取上层水相置于新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，轻轻混匀，室温下静置10 min；
（7）上述离心管置于高速冷冻离心机4 ℃ 12 000 rpm离心10 min后弃上清，沉淀用1 ml DEPC水处理过的75%无水乙醇漂洗两次。
（8）上述离心管7500转，离心5min后弃上清，将沉淀的RNA在室温下自然干燥，使得乙醇完全蒸发；
（9）最后加入22 µl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，于-80℃备用；
1.3.2 马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA的提取
马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA的提取采用DNA提取试剂盒（QIAGEN）进行，操作方法依照说明书进行，具体步骤如下：
（1）收集皿盖上新鲜的马铃薯腐烂茎线虫，灭菌水洗涤3次，液氮中充分研磨成粉末后转入到2 ml tube离心管中；
（2）加入180 µl Buffer GL、10 µl RNase A（10 mg/ml）和20 µl 蛋白酶K至离心管中，56 ℃水浴2-3 h，期间颠倒混匀数次，确保虫体充分裂解；
（3）上述裂解液中加入200 µl Buffer GB，充分吸打混匀；
（4）将上述溶液移至Spin Column中，于12000 rpm离心2分钟后弃滤液；
（5）所得沉淀中加入500 µl Buffer WA，再12000 rpm离心1分钟，弃滤液；
（6）再加入500 µl Buffer WB（Buffer WB中已加入指定体积的无水乙醇），12000 rpm离心1分钟，弃滤液；
（7）重负操作6
（8）将上述Spin Column置于Collection Tube上，12000 rpm离心2分钟；
（9）将离心后的Spin Column取出置于新的1.5 ml离心管上，加入50-100 µl的Elution Buffer，室温下静置5分钟；
（10）将离心管12000 rpm离心2分钟用以洗脱DNA，重复洗脱一次可增大DNA产量。
1.3.3 马铃薯腐烂茎线虫第一链cDNA的合成
1.3.3.1 第一链cDNA的合成
采用RNA PCR Kit（AMV）扩增试剂盒方法对1.3.1提取的马铃薯腐烂茎线虫总RNA进行反转录，合成cDNA第一链。PCR反应体系和条件如下：
PCR反应体系：
MgCl2 2 µl
10 ×RT Buffer 1 µl
dNTP Mixture 1 µl
RNase Inhibitor 0.25 µl
Reverse transcriptase M-MLV 0. 5 µl
Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 µl
Total RNA (500 μg/µl)
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