陆地棉GhNCED3基因启动子克隆及其功能初步分析.pdf

新 疆 农 业 大 学 学 报 2 0 2 3,4 6(4):2 6 12 6 8 J o u r n a l o f X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yD O I:1 0.2 0 0 8 8/j.c n k i.j x a u.2 0 2 3.0 4.0 0 1陆地棉G h NC E D3基因启动子克隆及其功能初步分析张 淘1,代培红2,刘 壮1,郭一畅1,努尔阿米乃姆阿吉木1,阿依特古丽卡依合1,雷建峰1(1.新疆农业大学 农学院/棉花教育部工程研究中心,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2;2.新疆农业大学 生命科学学院,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2)摘 要:为 探 究 棉 花(G o s s y p i u m h i r s u t u m L.)G h NC E D3启 动 子 的 功 能,从 陆 地 棉 新 陆 早2 2号 中 克 隆G h N C E D3启动子。利用P l a n t C A R E在线软件分析G h NC E D3启动子上的顺式作用元件,构建P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0融合表达载体。采用浸花法转化野生型拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a),对转基因阳性植株筛选验证。为进一步探究G h NC E D3启动子的特性,在外源脱落酸处理下分析转P r o G h N C E D3GU S株系G U S基因表达量。同时对干旱胁迫处理前后的转基因株系进行GU S组织化学染色、G U S基因表达量检测及GU S酶活性测定。启动子序列分析结果表明,G h NC E D3启动子上含有参与脱落酸信号转导途径的A B R E元件和响应干旱胁迫的HD-b o x元件。在T0代转基因株系中扩增G h N C E D3启动子片段结果表明,G h N C E D3启动子已整合至拟南芥染色体中。T2代转基因株系GU S组织化学染色及G U S基因表达量检测结果表明,克隆的1 5 8 1 b p G h NC E D3启动子具有转录活性,能够驱动G U S基因在拟南芥中稳定遗传表达。在不同浓度脱落酸处理下,转基因株系中G U S基因表达量上调。干旱胁迫下G h NC E D3启动子转录活性鉴定结果表明,干旱处理后GU S染色区域、程度、G U S表达量及GU S酶活性均增加。表明1 5 8 1 b p G h N C E D3启动子的转录活性受脱落酸和干旱胁迫诱导。关键词:棉花;G h N C E D3启动子;转录活性;GU S染色中图分类号:S 5 6 2 文献标识码:A C l o n i n g a n d P r e l i m i n a r y F u n c t i o n a l A n a l y s i s o f G h N C E D3 G e n e P r o m o t e r i n G o s s y p i u m h i r s u t u m L.Z HAN G T a o1,D A I P e i-h o n g2,L I U Z h u a n g1,GUO Y i-c h a n g1,N u e r a m i n a i m u A j i m u1,A y i t e g u l i K a y i h e1,L E I J i a n-f e n g1(1.C o t t o n E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r o f M i n i s t r y o f E d u c a t i o n/C o l l e g e o f A g r o n o m y,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 2,C h i n a;2.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 2,C h i n a)A b s t r a c t:T h i s p r o j e c t a i m s t o i n v e s t i g a t e t h e f u n c t i o n o f t h e G h NC E D3 p r o m o t e r i n c o t t o n b y c l o n i n g t h e G h NC E D3 p r o m o t e r f r o m u p l a n d c o t t o n X i n l u z a o 2 2.T h e c i s-a c t i n g e l e m e n t s o n t h e G h NC E D3 p r o-m o t e r w e r e a n a l y z e d u s i n g P l a n t C A R E o n l i n e s o f t w a r e a n d t h e P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0 f u s i o n e x-p r e s s i o n v e c t o r w a s c o n s t r u c t e d.T h e w i l d-t y p e A r a b i d o p s i s t h a l i a n a w a s t r a n s f o r m e d b y f l o w e r-d i p p i n g m e t h o d a n d t h e t r a n s g e n i c-p o s i t i v e p l a n t s w e r e s c r e e n e d a n d v e r i f i e d.T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e G h NC E D3 p r o m o t e r w a s f u r t h e r e x p l o r e d b y a n a l y z i n g G U S e x p r e s s i o n i n t r a n s-P r o G h NC E D3GU S l i n e s u n d e r e x o g e n o u s a b s c i s i c a c i d t r e a t m e n t.A t t h e s a m e t i m e,G U S h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g,G U S e x p r e s s i o n 收稿日期:2 0 2 3-0 6-1 2基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目(2 0 2 3 1 0 7 5 8 0 0 4)通讯作者:雷建峰,E-m a i l:k y l e i j i a n f e n g 1 6 3.c o m新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 a n d GU S e n z y m e a c t i v i t y d e t e c t e d w e r e p e r f o r m e d o n t h e t r a n s g e n i c l i n e s b e f o r e a n d a f t e r d r o u g h t s t r e s s t r e a t m e n t.T h e r e s u l t s o f p r o m o t e r s e q u e n c e a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e G h NC E D3 p r o m o t e r c o n t a i n e d A B R E e l e m e n t s i n v o l v e d i n a b s c i s i c a c i d s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y a n d HD-b o x e l e m e n t s i n r e s p o n s e t o d r o u g h t s t r e s s.Am p l i f i c a t i o n o f t h e G h NC E D3 p r o m o t e r f r a g m e n t i n t h e T0 t r a n s g e n i c l i n e s s h o w e d t h a t t h e G h NC E D3 p r o m o t e r w a s i n t e g r a t e d i n t o t h e A r a b i d o p s i s t h a l i a n a c h r o m o s o m e.T h e r e s u l t s o f GU S h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g a n d G U S e x p r e s s i o n d e t e c t i o n i n T2 t r a n s g e n i c l i n e s s h o w e d t h a t t h e c l o n e d 1 5 8 1 b p G h NC E D3 p r o m o t e r h a d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y a n d c o u l d d r i v e G U S s t a b l e g e n e t i c e x p r e s s i o n i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a.G U S e x p r e s s i o n w a s u p-r e g u l a t e d i n t r a n s g e n i c l i n e s u n d e r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a b s c i s i c a c i d t r e a t m e n t.T h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f G h NC E D3 p r o m o t e r u n d e r d r o u g h t s t r e s s s h o w e d t h a t GU S s t a i n i n g r e g i o n,d e g r e e,G U S e x p r e s s i o n a n d GU S e n z y m e a c t i v i t y i n c r e a s e d a f t e r d r o u g h t t r e a t m e n t,i n d i c a t i n g t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f 1 5 8 1 b p G h NC E D3 p r o m o t e r w a s i n d u c e d b y a b-s c i s i c a c i d a n d d r o u g h t s t r e s s.K e y w o r d s:c o t t o n;G h NC E D3 p r o m o t e r;t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y;GU S s t a i n i n g 干旱是影响棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m L.)正常生长发育导致减产的重要因素。脱落酸(A B A)在植物应对干旱胁迫的适应过程中起着重要的调节作用1-3。高等植物中9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(N C E D)是A B A 生物合成的关键酶,其含量的变化与A B A合成量有密切关系4。自第一个NC E D(V p 1 4)基因5在玉米(Z e a m a y s L.)中被鉴定 以 来,相 继 在 多 种 植 物 中 克 隆 了NC E D基因4,6-9。拟 南 芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)的A t NC E D3基因除了参与侧根生长、调控种子胚成熟和休眠等功能外,还通过增加植株内源A B A水平增强抗旱性1,1 0,1 1。在拟南芥和水稻(O r y z a s a-t i v a L.)中超表达水稻O s NC E D3基因也可以提高拟南芥和水稻A B A含量,抗旱性较野生型和R NA i植株显著提高7,1 2。超表达N t NC E D3的转基因烟草(N i c o t i a n a t a b a c u m L.)具有发达的根系,干旱胁迫下A B A含量增加,抗旱性增强6。与R NA i植株相比超表达NC E D3的毛果杨(P o p u l u s t r i c h-o c a r p a)对 干 旱 胁 迫 的 耐 受 性 更 强1 3。表 明NC E D3基因可能是A B A生物合成的关键基因,在不同的物种中具有一定的功能保守性。目前对于棉花G h NC E D3的研究大多是作为抗性反应发生的标志基因1 4-1 6。启动子是调控基因转录的开关,G h NC E D3启动子上存在具有特殊功能 的 顺 式 作 用 元 件 是 解 析 转 录 因 子 调 控G h NC E D3基因表达的重要桥梁。研究表明,拟南芥NGATHA 1和WRKY5 7转录因子可以直接与A t NC E D3启动子上的N B E和W-b o x顺式元件结合激活A t NC E D3的表达,增强了转基因拟南芥的抗旱 性1 7,1 8。拟 南 芥AT A F 1转 录 因 子 通 过 与A t NC E D3启动子上T T G C G T A顺式元件结合,调节A B A的合成1 9。在苹果(M a l u s p u m i l a M i l l.)中,M d MY B 8 8作 为 转 录 激 活 因 子 直 接 与Md NC E D3启 动 子 中 的AG C C G元 件 结 合 激 活Md NC E D3表达,导致A B A含量增高,介导了转基因苹果植株的抗旱性2 0。克隆并分析G h NC E D3启动子的特性是阐明G h NC E D3基因在干旱胁迫下信号转导途径的关键步骤。本研究从陆地棉新陆早2 2号 中 克 隆 了G h NC E D3启 动 子,并 构 建 了G h NC E D3启动子驱动G U S基因表达的融合表达载体。通 过遗传转化 获 得 了 转P r o G h NC E D3GU S拟南芥,在A B A诱导下分析转基因株系中G U S基因表达量。同时在干旱胁迫下对转基因株系进行GU S染色、G U S表达量分析及GU S酶活性测定,研究分析棉花G h NC E D3启动子的特性。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 植物材料敏 旱 性 陆 地 棉 品 种 新 陆 早2 2号 用 于G h NC E D3启动子克隆,野生型拟南芥C o l-0用于P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0表达载体的遗传转化和转录活性分析。以上植物材料均由新疆农业大学农学院农业生物技术重点实验室保存。1.1.2 菌株与载体大肠 杆 菌 菌 株DH 5、农 杆 菌 菌 株G V 3 1 0 1、G h U 6-5 PG U S-S K载体2 1、植物表达载体p C AM-B I A 1 3 0 0均由新疆农业大学农学院农业生物技术重点实验室保存。1.1.3 试 剂植物R NA提取试剂盒、反转录试剂盒、植物基因组D NA提 取 试 剂 盒、荧 光 定 量P C R试 剂 盒、262 第4期张 淘,等:陆地棉G h NC E D3基因启动子克隆及其功能初步分析T a q D NA聚合酶、B l u n t Z e r o平端克隆载体、胶回收试剂盒、T 4 D N A连接酶、D N A分子量M a r k e r均购自北京全式金生物技术有限公司。P h u s i o n 超保真D NA聚合酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。各类限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。其他生化试剂均为国产分析纯。引物合成及测序均由上海生工生物技术有限公司完成。1.2 方 法1.2.1 棉花G h NC E D3启动子克隆基于拟南芥A t NC E D3(A t 3 g 1 4 4 4 0)氨基酸序列在棉花基因组数据库(h t t p s:/p h y t o z o m e-n e x t.j g i.d o e.g o v/)中检索G h NC E D3基因全长的C D S序列,并确定G h NC E D3起始密码子AT G上游约1 6 0 0 b p的启动子序列。以新陆早2 2号叶片基因组D NA为模板,设计G h NC E D3启动子克隆引物。引物序列:P r o G h N C E D 3 F:5 -GAT C C T C C C C AT-C AT C C AAA-3 和P r o G h N C E D 3 R:5 -C AT T G T T-G G T GAT T GAAAAT G T AAGA-3。按照P h u s i o n超保真D NA聚合酶说明书配置P C R反应体系。反应结束后,回收纯化扩增产物与平端克隆载体B l u n t-Z e r o连接转化大肠杆菌感受态细胞,对候选的阳性克隆提质粒,酶切鉴定。选酶切大小正确质粒测序,测序正确质粒命名为:P r o G h NC E D3。1.2.2 G h NC E D3启动子顺式作用分析利用在线工具P l a n t C A R E(h t t p s:/b i o i n f o r-m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l/)对克隆的G h NC E D3启动子区域存在的顺式作用元件进行分析。1.2.3 P r o G h NC E D3GU S融合表达载体构建以实验室已构建好的G h U 6-5 PGU S-S K2 1质粒为受体模板,测序正确的P r o G h NC E D3质粒为供体模板进行T r a n s f e r P C R扩增,其目的是在受体 质 粒 模 板 上 将G h U 6-5 P启 动 子 替 换 为G h NC E D3启动子,且不引入任何无关序列。引物序列:T-P r o G h N C E D 3 F:5 -C C G C C AG T G T G C T-G GAAT T G C C C T T AAGAT C C T C C C C AT C AT C-C AAA-3 和T-P r o G h N C E D 3 R:5 -G G G T T T C T A-C AG GA C G T AA C AT GAAGA C C C C AT T G T T G-G T GAT T GAAAAT G T AAGA-3(下 划 线 为 受 体质粒上的接头碱基序列)。T r a n s f e r P C R反应程序及操作流程参照雷建峰等2 2方法。反应结束后,用D p n3 7 酶切消化7 L P C R产物3 h以上,并将1 0 L酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞。对候选的阳性克隆进行酶切鉴定、测序,正确的克隆命名为P r o G h NC E D3GU S。用B a mH和P s t酶切P r o G h NC E D3GU S质粒,回收P r o G h NC E D3GU S片段,连接同样经B a mH和P s t酶切的p C AMB I A 1 3 0 0载 体 生 成P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0终载体,转入农杆菌感受态GV 3 1 0 1。1.2.4 拟南芥遗传转化及转基因阳性植株鉴定将P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0终载体通过浸花法2 3转化生长4 5 d左右野生型拟南芥C o l-0,种子成熟后在含有3 0 g/m L潮霉素的1/2 M S培养基上 筛 选T0代 转 基 因 阳 性 苗。以 野 生 型 和 转P r o G h NC E D3GU S拟南芥基因组D NA为模板,参照T a q D NA聚合酶说明书配置P C R反应体系扩增G h NC E D3启动子部分序列。引物序列为:G h N C E D 3 P F:5 -C C A C T AG C G GAT T GA C A C-AT-3 和G h N C E D 3 P R:5 -T C AA C T T T AG C T A-G C AA C C G-3。P C R检测为阳性的植株收获T1代种子,再经过潮霉素筛选,获得T2代抗性植株用于G h NC E D3启动子转录活性鉴定。1.2.5 GU S染色及G U S基因表达量检测将生长2 5 d T2代转基因拟南芥植株完全浸泡在GU S染液2 1中,3 7 孵育1 2 h。彻底去除GU S染液后,用7 0%乙醇进行脱色,期间更换7 0%乙醇34次,直至所有组织基本完全褪去绿色。在体式显微镜下观察拍照。另外,选取同批种植生长2 5 d未处理的植株叶片提取R NA,反转录成c D NA。以野生 型 和 转P r o G h NC E D3GU S拟 南 芥 叶 片c D NA为模板,选择A t A c t i n2基因为内参,引物序列:A t A c t i n 2 F:5 -G C A C C C T G T T C T T C T T A C-C G-3 和A t A c t i n 2 R:5 -AA C C C T C G T AGAT T G-G C A C A-3。按照q R T-P C R说明书配置P C R反应体系,引物序 列:GU S F:5 -G GAAAG C G C G T T A-C AAGAAA-3 和GU S R:5 -G T GA C AT C G G C T-T C AAAT G G-3,每个样本设置3次技术重复。反应结束后,利用2-C T方法2 4计算编 号为#1、#2、#3、#4、#5,共5株转基因株系及野生型拟南芥WT株G U S基因表达量。1.2.6 外源A B A处理下G U S表达量分析为探究外源A B A处理对G h NC E D3启动子转录 活 性 的 影 响,对 生 长2 5 d的T2代 转P r o G h NC E D3 GU S拟 南 芥 莲 座 叶 分 别 喷 施1 0 m o l/L(处 理1)、5 0 m o l/L(处 理2)和1 0 0 m o l/L(处理3)的A B A溶液,以喷施蒸馏水的处理作为对照。期间重复操作3次,处理2 4 h后采样。参照上述q R T-P C R方法检测不同处理中G U S362新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 基因表达量。1.2.7 干旱胁迫下G h NC E D3启动子转录活性鉴定选择T2代转基因株系进行干旱胁迫处理,干旱处理前,每个盆中定量称取1 0 0 g营养土,并将株高相近的拟南芥幼苗移栽至营养土中。在生长过程中等量补水一次(1 0 0 m L),其他环境参数保持一致。对生长2 5 d的植株进行自然土壤干旱胁迫处理,选取干旱处理前和干旱胁迫1 4 d后的同株植株叶片进行GU S组织化学染色、G U S基因表达量检测及GU S酶活性测定。GU S染色及G U S基因表达量检测方法同上,GU S酶活性的测定采用GU S荧光分析法,具体操作参照于月华等2 5方法,每个株系进行3次生物学重复。2 结果与分析2.1 棉花G h NC E D3启动子克隆以新陆早2 2号叶片基因组D NA为模板,P C R扩增获得大小约1 5 8 1 b p的G h NC E D3启动子片段(图1)。测 序 及 序 列 比 对 结 果 表 明,克 隆 的G h NC E D3启 动 子 序 列 与 棉 花 数 据 库 中 公 布 的G h NC E D3启动子理论序列相似性为9 8.4%,成功克隆获得G h NC E D3启动子。1M1581bp2000bp1500bp1.G h NC E D3启动子P C R扩增产物;M.1 k b P l u s D NA标准分子量图1 G h N C E D3启动子克隆F i g.1 C l o n i n g o f G h N C E D3 p r o m o t e r2.2 棉花G h NC E D3启动子顺式作用分析分析表明,1 5 8 1 b p G h NC E D3启动子上除含有转录起始所必需元件外,9 5 7 b p和1 3 5 9 b p位置上含有2个与脱落酸信号转导相关的A B R E(序列:A C G T G)顺式作用元件;6 7 8 b p和1 0 0 9 b p位置上含 有2个 响 应 干 旱 胁 迫 的HD-b o x2 6(序 列:T T T AAT C A)顺式作用元件。2.3 P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0融合表达载体构建利用T r a n s f e r P C R成功将受体质粒G h U 6-5 P GU S-S K中 的G h U 6-5 P启 动 子 替 换 为G h NC E D3启 动 子,同 时 也 初 步 获 得 了P r o G h NC E D3GU S-S K融合表达载体。对候选的阳性克隆进行酶切鉴定,经B a mH和P s t双酶切 后 产 生 了3 0 0 0 b p(S K载 体)和3 7 2 4 b p(P r o G h NC E D3GU S:P r o G h NC E D3 1 5 8 1 b p和G U S 2 1 4 3 b p)2条带,酶切结果与预期酶切片段大小一致(图2)。将测序正确的P r o G h NC E D3GU S片段重组到植物表达载体p C AMB I A 1 3 0 0上。重组质粒经B a mH和P s t双酶切后产生了3 7 2 4 b p(P r o G h NC E D3 GU S)和9 0 0 0 b p(p C AMB I A 1 3 0 0载体)2条带,酶切结果与预期酶切片 段 大 小 相 符,表 明 终 载 体P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0已构建成功(图3)。1M3724 bp3000 bp4000 bp3000 bp1.P r o G h NC E D3GU S-S K载体酶切产物;M.1 k b P l u s D NA 标准分子量图2 P r o G h NC E D3GU S-S K载体酶切鉴定F i g.2 I d e n t i f i c a t i o n o f P r o G h N C E D3G U S-S K v e c t o r b y e n z y m e d i g e s t i o nM110000 bp8000 bp4000 bp3000 bp9000 bp3724 bpM.1 k b P l u s D NA 标准分子量;1.P r o G h N C E D3GU S-p 1 3 0 0载体酶切产物图3 P r o G h NC E D3GU S-p 1 3 0 0载体酶切鉴定F i g.3 I d e n t i f i c a t i o n o f P r o G h N C E D3G U S-p 1 3 0 0 v e c t o r b y e n z y m e d i g e s t i o n2.4 转基因拟南芥阳性植株鉴定经潮霉素筛选获得大量T0代转基因阳性苗(图4)。提取生长2 0 d T0代转基因植株(1 1株)基因组D NA,P C R扩增G h NC E D3启动子部分序列。结果显示,转P r o G h NC E D3GU S拟南芥均能扩增出2 7 0 b p的G h NC E D3启 动 子 片 段,说 明462 第4期张 淘,等:陆地棉G h NC E D3基因启动子克隆及其功能初步分析G h NC E D3启动子已整合至拟南芥的染色体中,在野生型拟南芥中并未扩增出目的条带(图5)。收获植株编号#1、#2、#3、#4、#5的转基因种子继续扩繁 至T2代 用 于G h NC E D3启 动 子 转 录 活 性分析。7mm红色箭头指向阳性植株图4 潮霉素筛选T0代转基因阳性苗F i g.4 H y g r o m y c i n s e l e c t i o n o f T0 g e n e r a t i o n t r a n s g e n i c p o s i-t i v e s e e d l i n g sWT12345M678910 11270 bp500 bp250 bpWT.野生型拟南芥;11 1.转基因植株编号;M.2 k b P l u s D NA 标准分子量图5 转G h NC E D3启动子拟南芥P C R检测F i g.5 P C R d e t e c t i o n o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a t r a n s f o r m e d w i t h G h N C E D3 p r o m o t e r2.5 转P r o G h NC E D3GU S拟南芥GU S染色及G U S表达量分析通 过GU S组 织 化 学 染 色 分 析 转P r o G h NC E D3GU S拟南芥中GU S蛋白活性,结果显示,克隆的G h NC E D3启动子能驱动G U S基因在拟南芥中稳定遗传表达,在转基因拟南芥根、茎、叶中可看到明显的GU S染色(图6),说明本研究克隆的1 5 8 1 b p G h NC E D3启动子具有转录活性。进一 步 分 析 转 基 因 株 系G U S基 因 表 达 量,q R T-P C R结果显示,除#4号植株G U S基因表达量相对较低,其余植株G U S基因表达量都相对较高(图7)。2.6 外源A B A处理下G U S表达量分析对转P r o G h NC E D3GU S拟南芥莲座叶喷施1 0 m o l/L和5 0 m o l/L的A B A溶液时,G U S基因表达量与对照组相比略有增高,但不存在显著差异。当A B A溶液为1 0 0 m o l/L时,G U S基因表达量显著高于对照组(图8),GU S染色程度及区域明显高于对照组(图9)。?7cm3cm图6 转P r o G h N C E D3GU S拟南芥GU S染色分析F i g.6 G U S s t a i n i n g a n a l y s i s o f t r a n s g e n i c P r o G h N C E D3G U S A r a b i d o p s i s t h a l i a n a?2.01.51.00.50.0?#1#2#3#4#5WTAAABAC不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图7 q R T-P C R分析转基因植株中G U S基因表达量F i g.7 q R T-P C R a n a l y s i s o f G U S g e n e e x p r e s s i o n i n t r a n s-g e n i c p l a n t s543210?1?2?3BBBA不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图8 A B A处理下转P r o G h N C E D3GU S拟南芥中G U S基因表达量检测F i g.8 D e t e c t i o n o f G U S g e n e e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c P r o G h N C E D3G U S A r a b i d o p s i s t h a l i a n a u n d e r A B A t r e a t m e n t2.7 干旱胁迫下G h NC E D3启动子转录活性分析对T2代转基因株系进行干旱胁迫处理,并进行GU S组织化学染色。结果显示,干旱处理前转562新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 P r o G h NC E D3GU S拟南芥叶片有微弱的GU S染色。干旱胁迫后,整个叶片都出现了蓝色,染色程度及区域明显高于干旱处理前(图1 0)。进一步检测干旱处理前后转基因株系中G U S基因表达量和GU S酶活性,结果显示,干旱胁迫后G U S基因表达量明显增强(图1 1)。GU S酶活性显著高于对照组(图1 2),与GU S组织化学染色和G U S基因表达结果一致。3cm?3cm图9 A B A处理 下 转P r o G h N C E D3GU S拟 南 芥GU S染色F i g.9 G U S h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g i n t r a n s g e n i c P r o G h N C E D3G U S A r a b i d o p s i s t h a l i a n a u n d e r A B A t r e a t m e n t3cm?3cm图1 0 干旱胁迫下转P r o G h NC E D3GU S拟南芥GU S染色F i g.1 0 G U S h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g i n t r a n s g e n i c P r o G h N C E D3G U S A r a b i d o p s i s t h a l i a n a u n d e r d r o u g h t s t r e s s543210?BA不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图1 1 干旱胁迫下转P r o G h NC E D3GU S拟南芥中G U S基因表达量检测F i g.1 1 D e t e c t i o n o f G U S g e n e e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c P r o G h N C E D3G U S A r a b i d o p s i s t h a l i a n a u n d e r d r o u g h t s t r e s s75604530150GUS?mol/(min mg)?BA不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图1 2 干旱胁迫下转P r o G h N C E D3GU S拟南芥中GU S酶活性测定F i g.1 2 D e t e c t i o n o f G U S e n z y m e a c t i v i t y i n t r a n s g e n i c P r o G h N C