金鱼Caspase-8多克隆抗体的制备.pdf

第 47 卷第 2 期浙江师范大学学报(自然科学版)Vol.47,No.22024 年 5 月 Journal of Zhejiang Normal University(Nat.Sci.)May 2024 DOI:10.16218/j.issn.1001-5051.2024.013金鱼 Caspase-8 多克隆抗体的制备吴玉青,罗 鑫,王鑫莹,曹诣斌(浙江师范大学 生命科学学院,浙江 金华 321004)摘 要:为研究环境压力对金鱼细胞凋亡外在途径的影响,设计特异性引物扩增 Caspase-8 基因片段(编码第305763 位氨基酸),然后进行原核表达,并通过动物免疫实验制备 Caspase-8 多克隆抗体,检测其效价、金鱼不同组织表达水平和相关蛋白互作.结果表明:制备的 Caspase-8 多克隆抗体与抗原结合的最大稀释倍数为1 256 000,显示出良好的免疫原性;Caspase-8 在金鱼不同组织中有不同程度表达;Caspase-8 与 E3 泛素连接酶 cullin3 存在相互作用.综上,制备的 Caspase-8 多克隆抗体有望应用于金鱼细胞凋亡蛋白 Caspase-8 表达水平及相关蛋白互作的研究中.关键词:金鱼;Caspase-8;多克隆抗体;细胞凋亡;组织表达中图分类号:S965.8 文献标识码:A 文章编号:1001-5051(2024)02-0196-08Preparation of polyclonal antibody against Caspase-8 in goldfish(Carassius auratus)WU Yuqing,LUO Xin,WANG Xinying,CAO Yibin(College of Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China)Abstract:To investigate the effect underlying the response of goldfish cells to the extrinsic pathway of apopto-sis under environmental stress conditions,specific primers,amplified Caspase-8 gene fragment(encoding 305763 amino acids)were designed,and prokaryotically expressed,leading to the production of a Caspase-8 polyclonal antibody via animal immunization experiments.The efficacy,expression level in goldfish tissues,and related protein interactions were then examined.The results revealed that the maximum dilution of the pre-pared Caspase-8 polyclonal antibody bound to antigen was 1 256 000,indicated a high immunogenicity.Fur-thermore,Caspase-8 showed varying degrees of expression across different goldfish tissues,and an interaction between Caspase-8 and E3 ligases cullin3 was observed.Therefore,the prepared Caspase-8 polyclonal anti-body would hold promise for studying the expression levels of Caspase-8 and its interactions with proteins asso-ciated with the extrinsic path way of apoptosis in goldfish cells.Key words:goldfish;Caspase-8;polyclonal antibody;apoptosis;tissue expression收文日期:2023-08-05;修订日期:2023-10-25基金项目:国家自然科学基金面上资助项目(31371209)作者简介:吴玉青(1998),女,江西宜春人,硕士研究生.研究方向:生物化学与分子生物学.通信作者:曹诣斌.E-mail:sky109 0 引 言细胞凋亡对维持多细胞生物体的生存至关重要,可通过内在和外在 2 条途径激活凋亡蛋白家族Caspase 级联反应1,清除受损或感染的细胞.Caspase-8 是半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶,在进化上高度保守,在细胞凋亡外在途径中扮演着起始者的角色2-3.当受到凋亡信号刺激时,位于胞膜上的死亡受体如 Fas,DR4/5(death receptor 4/5,DR4/5)等会通过各自的死亡域招募并结合接头蛋白 Fas 相关死亡结构域(Fas-associated death domain,FADD),募集 Caspase-8 酶原形成死亡诱导信号复合物(death-in-ducing signaling complex,DISC)4,继而放大下游凋亡级联反应,导致细胞解体和死亡5.除了触发死亡受体介导的细胞凋亡、细胞坏死外6,Caspase-8 还可充当支架蛋白,参与抗原受体激活、诱导细胞因子产生等过程7-8.金鱼(Carassius auratus)属于鲤科,是世界各地饲养的观赏鱼类.从驯化至今,至少产生了 180 种变体,有着丰富的表型,其中某些表型与一些人类疾病相似9.此外,金鱼对低氧、盐碱和高氨等逆境也具有很强的耐受能力10-12,可作为模式动物研究 Caspase-8 在逆境生理中的作用机制.金鱼全基因组序列组装的最新进展为这些表型的遗传分析提供了强有力的工具.如今,全球观赏鱼养殖业中,金鱼养殖的数量正在增加,提高金鱼存活率、扩大养殖规模是养殖户及相关科研工作者等密切关注的问题13.影响金鱼生存的环境因子众多,包括水体温度、氨氮浓度和溶氧量等14,极端环境的出现将使得金鱼正常生长和繁殖活动受到影响.金鱼将在此种情形下主动争取一种“死亡过程”,即细胞凋亡,以更好地适应生存环境.关于哺乳动物 Caspase-8 结构和功能的研究已经比较丰富,而在鱼类中的研究还较为缺乏15,过去有限的研究聚焦于信号通路中上游配体对金鱼细胞凋亡的影响16.此外,鱼类和哺乳动物的 Caspase-8在结构和功能上相似,但在生物进化过程中的凋亡调控机制又有所区别17-18.与哺乳动物较为明显的差别体现在 Caspase-8 与其他 Caspases 的基因分布情况,Caspase-8 与 Caspase-10 分别定位在不同的染色体连锁群,而在人类染色体上,二者成簇存在.这种染色体上的分布差异可能是造成鱼类外在凋亡途径核心组分与哺乳动物不同的原因之一.目前,鱼类 Caspase-8 的研究主要集中于分子克隆和功能表达研究,Caspase-8 在斑马鱼、武昌鱼、海鲈鱼、紫红鲤鱼等鱼类的体内都已被克隆17,19-20.此外,鱼类凋亡信号通路中一些关键组分与哺乳动物存在差异,如缺乏具有死亡域的 FADD 的 C 端区域21.因此,现有的Caspase-8 凋亡机制还不足以解释在鱼类中的作用模式.由于鱼类的 Caspase-8 编码序列与人类或其他模式生物存在差异,相关研究也较少,获取其序列也较为困难.基因与蛋白功能研究中缺乏特异性蛋白和抗体,导致体内和体外模型建立困难,以及蛋白检测效果不够准确,制约其相关功能的深入研究.因此,制备特异性 Caspase-8 多克隆抗体,有助于深入开展金鱼细胞外在凋亡信号通路的研究,也会增加相关联的其他关键蛋白或信号因子的发现概率,并促进特异性拮抗剂和激动剂的开发.本研究从细胞凋亡关键蛋白 Caspase-8 入手,制备金鱼 Caspase-8 的特异性多克隆抗体,并通过免疫印迹法(western blot,WB)和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)等22-24实验技术检测了该蛋白在金鱼各组织中的表达情况,以及与下游蛋白 cullin3 的相互作用,为后续研究 Caspase-8 在金鱼处于逆境时细胞凋亡外在途径的作用机制奠定基础.1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 活体金鱼及免疫动物金鱼(长 10 cm 左右,体质量 15 20 g),购自金华花鸟市场;免疫动物新西兰白兔(体质量约2.5 kg),由杭州华安生物技术有限公司提供.1.1.2 实验试剂791 第 2 期 吴玉青,等:金鱼 Caspase-8 多克隆抗体的制备Taq 酶、BamH、XhoI、T4 DNA 连接酶、Trizol(北京宝日医生物公司);异丙基硫代-半乳糖苷(Iso-propyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)(北京索莱宝生物科技有限公司);克隆载体试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司);彩色预染蛋白 Marker、蛋白定量试剂盒、泛素抗体(赛默飞世尔科技(中国)科技有限公司);山羊抗兔二抗(杭州华安生物技术有限公司);鼠抗 cullin3、配套二抗(上海圣克鲁斯生物科技有限公司);裂解液、蛋白酶抑制剂、脱脂奶粉/吐温-20/山羊抗鼠二抗(上海生工生物工程股份有限公司,以下简称上海生工);protein G、化学发光液(常州天地人和生物科技有限公司).1.2 方 法1.2.1 引物设计与合成参照斑马鱼 Caspase-8 基因全序列(GenBank 登录号:NP_571585.2)设计引物,引物序列从 53.F:CGGCATCCATGGAGCA;R:CCCGCAGCAGCC,引物由上海生工合成.1.2.2 PCR(polymerase chain reaction,PCR)扩增及克隆采用 Trizol 试剂提取金鱼鳃组织的总 RNA,ReverTra Ace Qpcr RT Kit 反转录为 cDNA,以此作为模板进行 PCR 扩增,PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,割胶回收,并与 pSC 载体于 16 连接过夜,次日转化于大肠杆菌 DH5 感受态细胞,涂布于含氨苄抗性的培养基上,挑取含正确连接的质粒(pSC-Caspase-8)的阳性克隆送往上海生工进行测序.1.2.3 重组原核表达载体的构建采用限制性内切酶 BamH和 XhoI 对 pSC-Caspase-8 重组质粒及空载体 pET-28a(+)(RC)进行双酶切,T4 DNA 连接酶将 Caspase-8 片段连入空载体 pET-28a(+)(RC),转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞,挑取含 pET-28a(+)(RC)-Caspase-8 质粒的单克隆菌落测序验证.1.2.4 Caspase-8 蛋白的表达和纯化将重组质粒转化 BL21(DE3)感受态细胞培养,加入 IPTG 至终浓度为 1 mmolL-1,37 诱导培养4 h,菌体经超声破碎后离心,收集沉淀,用无咪唑的 8 mmolL-1尿素溶液重悬分散沉淀,再次超声离心,镍柱纯化.电泳鉴定后,将含有目的蛋白的洗脱液进行透析复性和超滤浓缩,最终获得纯化的重组蛋白.1.2.5 Caspase-8 蛋白兔源多克隆抗体的制备选择体质量 2.5 kg 左右、2 月龄的健康新西兰白兔,预养 2 周,做好标记.按需抽取完全混匀的抗原,首免抗原质量浓度为 1 mgmL-1,每只兔子的注射剂量为 0.5 mL,二免到四免抗原量减半,再按佐剂和抗原 1 1 的体积比抽取佐剂.首免采用完全佐剂,二免到四免采用不完全佐剂.2 个注射器用针筒连接管对接后进行完全乳化.采用多点皮下注射,每点为 0.2 mL.免疫时间:首免后第 14 天进行二免,二免到三免间隔时间为 7 d.兔子三免后第 7 天进行耳中动脉采小样血清检测,检测合格 7 d 后加免,加免完 7 d 后可采集全血.采血前按照每千克静脉注射 1 mL 3%戊巴比妥钠麻醉.取血完成后将血液进行 37 水浴 30 min,冷却后待血液自动分层,将上清液转移并加入硫柳汞钠溶液,并使后者最终体积分数为 0.02%以防止微生物污染,混匀,-20 保存.1.2.6 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测(间接法)用碳酸盐包被缓冲液将已纯化浓缩的 Caspase-8 蛋白稀释至 1 gmL-1,在聚苯乙烯板反应孔中各加 50 L,4 过夜,次日用磷酸盐缓冲液洗涤之后加 1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭,置 37 孵育 1 h,再加 50 L 蛋白样品于反应孔.同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(BSA).置 37 孵育 1 h,之后弃封闭液,用磷酸盐缓冲液洗涤 2 次.将新鲜稀释的二抗-HRP(1 5 000,用 1%BSA 进行稀释)加入反应孔中,37 孵育 45 min,之后用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次.加入 3,3,5,5-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)底物溶液,37 反应 5 min 后,加入 2 mgmL-1硫酸(每孔90 L)以终止反应,借助酶标仪(450 nm)进行读数并保存数据,进行分析,并用 GraphPad Prism 8.0 软891浙江师范大学学报(自然科学版)第 47 卷件作图.1.2.7 WB 法从金鱼机体分离不同组织,研磨之后进行蛋白裂解及提取,加入蛋白上样缓冲液后煮沸 10 min,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据实验所需检测蛋白分子量大小,调整电泳时间,获取目的条带之后进行半干转膜 1.5 h,电压为 12 V,然后将转有蛋白的聚偏二氟乙烯印迹膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)放入质量分数为 5%的脱脂奶粉封闭液中,置于水平摇床上封闭 2 h;封闭结束后,将封闭好的 PVDF 膜从封闭液中取出,在含吐温-20 的磷酸盐缓冲液中浸泡 1 min,去除多余的脱脂奶粉溶液;将条带放入孵育盒内,吸取适量与目的蛋白相对应的抗体,滴加到目的蛋白条带上,盖上盖子,防止抗体挥发,置于 4 冰箱,孵育过夜;孵育结束后,将 PVDF 膜浸泡在含吐温-20 的磷酸盐缓冲液中,在摇床上清洗 3 次,每次8 min;清洗结束后,将条带放入孵育盒中继续孵育二抗,在室温条件下孵育 1 h;室温孵育结束后清洗二抗,重复上述清洗步骤;最后利用化学发光液检测结果.1.2.8 Co-IP 法依照实验需求取约 30 mg 金鱼鳃组织,进行裂解取上清;用移液器吸取 20 L protein G 加到蛋白样品中,4 孵育 30 min,除去能与 protein G 非特异性结合的蛋白,向离心管中加入 1 L Caspase-8 多克隆抗体,4 孵育 1216 h,再吸取 20 L protein G 加到前述样品中,并孵育 35 h,之后用新鲜配制的洗涤液对结合有目的蛋白的 protein G 进行清洗;最后每管加入 25 L 蛋白上样缓冲液进行金属浴变性,WB 检测目的蛋白.本研究涉及的 Co-IP 实验具体方法为:裂解液与蛋白酶抑制剂按照 100 1 的体积比混合,并加入鳃组织样品,用研磨器进行研磨、裂解得到细胞裂解液,对 Caspase-8 进行免疫共沉淀,并在变性条件下进行 IB 分析.2 实验结果2.1 金鱼 Caspase-8 重组蛋白的诱导表达与纯化构建金鱼 Caspase-8 重组原核表达载体并鉴定,将重组正确的质粒进行转化,用于后续的诱导表达及纯化,具体见图 1.将菌液分别接种于 5 mL LB 液体培养基中,37 震荡培养过夜.对照组不加诱导a:小量诱导表达结果;b:大量诱导表达与纯化结果;c:透析结果图 1 金鱼 Caspase-8(第 305763 位氨基酸)重组蛋白的诱导表达与纯化991 第 2 期 吴玉青,等:金鱼 Caspase-8 多克隆抗体的制备剂,实验组加入 IPTG(浓度为 1 mmolL-1),继续培养 4 h.菌液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后结果显示,重组蛋白有明显表达(见图 1a).小量诱导表达成功后,接种 3 mL 菌液至 300 mL 含氨苄青霉素的LB 培养基中,诱导方法同上,进行大量表达和镍柱纯化,结果显示,获得纯度较高的目的蛋白(见图1b).透析结果如图 1c.2.2 金鱼 Caspase-8 抗体血清 ELISA 检测将从不同实验兔中获得的纯化浓缩的金鱼 Caspase-8 抗体用包被缓冲液稀释至 1 gmL-1,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50 L 孵育过夜,包被 ELISA 板,结果如图2 所示,当稀释倍数为1 256 000时,样品与阴性对照的 OD450比值大于 2.1,判断为阳性;当稀释倍数调整为 1 1 024 000 时,样品与阴性对照的 OD450比值小于 2.1.据此确定样品的最大稀释倍数即该抗体效价为 1 256 000.图 2 金鱼 Caspase-8 多克隆抗体稀释度检测2.3 Caspase-8 多克隆抗体在金鱼不同组织中的表达与分布利用金鱼 Caspase-8 多克隆抗体进行蛋白质免疫印记分析,检测 Caspase-8 蛋白在金鱼组织中的表达和分布,结果如图 3 所示,Caspase-8 蛋白在金鱼的肝脏、鳃、肌肉、肾脏和脑组织中均有不同程度表达,且在检测的 5 种组织中,鳃组织的表达最为丰富.图 3 金鱼不同组织中 Caspase-8 的表达水平2.4 金鱼 Caspase-8 与 cullin3 蛋白互作分析利用 Caspase-8 多克隆抗体进行 Co-IP 分析,结果如图 4 所示,金鱼鳃组织中 E3 泛素连接酶 cullin3与 Caspase-8 存在相互作用,推测 cullin3 可以促进后者的泛素化,有利于自身的激活以起始细胞凋亡级联反应.3 讨 论细胞内在凋亡途径是细胞在内部信号因子如一些蛋白激酶、生长因子的刺激下,通过线粒体释放凋亡因子激活 Caspase 级联反应,几乎在所有后生动物中都是保守的;而外在凋亡途径是细胞在胞外信号因子如肿瘤坏死因子的刺激下,激活细胞内 Caspase 级联反应,较内在凋亡途径出现更晚,且进化不完002浙江师范大学学报(自然科学版)第 47 卷图 4 金鱼鳃组织 Caspase-8 与 cullin3 的蛋白互作分析全保守.例如在果蝇中,其 Caspase-8 同源基因与 FADD 似乎并不参与外在途径25.在硬骨鱼中,Eimon等26鉴定了斑马鱼中型、型死亡配体及各自的受体和 Caspase-8 等细胞凋亡外在途径中的其他组分,发现与哺乳动物中的相关基因高度对应,并能够在斑马鱼胚胎发育过程中与内在途径共同触发细胞凋亡.在金鱼集约化养殖过程中,缺氧、病毒性感染、重金属暴露等不利环境因子都可能会触发 Caspase-8 的激活及其下游反应27,例如:巨石斑鱼神经坏死病毒(greasy grouper nervous necrosis virus,GGNNV)感染能使海鲈鱼(Lateolabrax japonicas)细胞系的 Caspase-8 酶活升高28,缺氧能引起大口鲈鱼(Microp-terus salmoides)体内 Caspase-8 的基因表达水平上调29;铜、镉离子及其联合暴露使得稀有鮈鲫(Gobio-cyprisrarus)体内 Caspase-8,Caspase-3,Caspase-9 等细胞凋亡相关基因表达上调30,表明 Caspase-8 在鱼类的生长发育和环境应答过程中发挥重要作用.目前硬骨鱼中对 Caspase-8 的分析,主要通过检测Caspase-8 的 mRNA 水平或者酶活水平来实现,本研究则通过制备 Caspase-8 多克隆抗体,通过 WB 和Co-IP 等识别金鱼体内 Caspase-8 蛋白,可以直接准确地反映逆境中金鱼机体内 Caspase-8 的蛋白水平.本研究通过构建原核表达载体和动物免疫制备了 Caspase-8 多克隆抗体.通过间接 ELISA 法测得所制备多克隆抗体的最大稀释倍数为 1 256 000,具有良好的免疫反应性,能应用于后续 WB 检测蛋白表达研究.目前,为迎合特定实验需求、或产生一种全新抗体,利用原核表达系统获得重组蛋白并制备高效价多克隆抗体在分子生物学研究领域已得到广泛运用.例如,朱若林等31制备了结构蛋白-基质蛋白,其效价为 1 102 400;李沛轩等32制备了双峰驼 FcR 多克隆抗体,该抗体效价为 1 64 000;白宇彤等33制备了牛支原体蛋白多克隆抗体,其效价为 1 51 200.用 WB 检测金鱼体内不同组织 Caspase-8 的表达情况,结果显示,Caspase-8 在金鱼的肝脏、鳃、肌肉、肾脏、脑组织中均有表达,且鳃组织表达水平最高,这和武昌鱼(Megalobrama amblycephala)中肝脏 Caspase-8 表达水平最高的模式有所差异20,这可能是由于物种及环境因子的差异造成的.鳃是鱼重要的呼吸器官,金鱼和武昌鱼都能发生鳃形态重塑以改变鳃的表面积,以增加或减少对水环境中溶解氧的吸收来应对环境中氧浓度的变化,这一过程与鳃组织中鳃小片间细胞的细胞凋亡密切相关34.金鱼对低氧的耐受性极强,而武昌鱼对低氧相对敏感,因此,推测金鱼鳃组织中较高的Caspase-8 水平可能与二者在低氧环境中发生鳃形态重塑的程度不同有关,具体机制还有待后续进一步的研究.目前还没有应用鱼类 Caspase-8 抗体研究蛋白互作的报道.文章首次采用制备的金鱼 Caspase-8 抗体,通过 Co-IP 实验确认金鱼鳃组织中 Caspase-8 能与 E3 泛素连接酶 cullin3 相互作用,表明所制备的金鱼 Caspase-8 多克隆抗体可应用于金鱼细胞凋亡过程中 Caspase-8 的蛋白互作研究,为进一步了解鱼类Caspase-8 的功能与作用模式提供有效手段.Sakamaki 等35采用特定标签抗体的 Co-IP 实验,已经证明102 第 2 期 吴玉青,等:金鱼 Caspase-8 多克隆抗体的制备斑马鱼 Caspase-8 能够与 FADD 发生互作.在哺乳动物中,结合于 FADD 的 Caspase-8 可进一步通过 cull-in3 进行泛素化修饰,从而促进 Caspase-8 的活化36.实验结果表明,这一分子机制在鱼类到哺乳动物的进化过程中保守.如今,国内外的金鱼养殖规模正在扩大,密集养殖、商业化养殖给金鱼带来了更大的生存挑战,鉴于不同环境因子暴露下 Caspase-8 对金鱼生长发育、稳态维持的重要作用,制备的金鱼 Caspase-8 多克隆抗体能够为研究 Caspase-8 在金鱼细胞凋亡外在途径中的作用机制提供有效工具.研究结果可为探明Caspase-8 在金鱼细胞凋亡外在途径中的作用机制提供有效手段,并帮助金鱼抵御极端环境,在实际生产中提高存活率37.4 总 结综上,本研究通过采用全基因合成法获得编码金鱼 Caspase-8 第 305763 位氨基酸的 DNA 片段,原核表达并采用纯化后的蛋白作为免疫原进行后续的多克隆抗体制备.制备的抗体效价较高,能应用于WB 和 Co-IP 实验,并分别检测了逆境中金鱼不同组织 Caspase-8 的表达水平变化,以及该蛋白与 cullin3蛋白的相互作用,可为进一步研究 Caspase-8 在金鱼细胞凋亡外在途径中的分子功能和作用机制提供有效手段,并提高金鱼的养殖管理水平.参考文献:1KASHYAP D,GARG V K,GOEL N.Intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis:role in cancer development and prognosisJ.Adv Protein Chem Struct Biol,2021,125:73-120.2DARCY M S.Cell death:a review of the major forms of apoptosis,necrosis and autophagyJ.Cell Biol Int,2019,43(6):582-592.3KESAVARDHANA S,MALIREDDI R K S,KANNEGANTI T D.Caspases in cell death,inflammation,and pyroptosisJ.Annu Rev Immunol,2020,38:567-595.4CREAGH E M.Caspase crosstalk:integration of apoptotic and innate immune signalling pathwaysJ.Trends Immunol,2014,35(12):631-640.5PARRISH A B,FREEL C D,KORNBLUTH S.Cellular mechanisms controlling Caspase activation and functionJ.Cold Spring Harb Perspect 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