DB45∕T 2482-2022 中密度纤维板霉变菌检测技术规范(广西壮族自治区).pdf

ICS 07.CCS B 7广Te2022-100.01 70 西壮中密esting sp-04-22 发壮族密度纤pecificat发布 广西壮族自纤维板tion for壮族自治区自治 板霉变 mildew 区市场监督区变菌检of mediu督管理局 地DB测技术um densi 发 布 45方标B45/T 248术规范ty fibre2022-0布 5 标准822022 范 eboard 05-25 实准 2 实施DB45/T 24822022 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由广西壮族自治区林业局提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区林业科学研究院。本文件主要起草人：宋贤冲、张照远、王军锋、陈文渊、唐健、黎小波、王会利、石媛媛、郭丽梅、邓小军、陈桂丹、黄家毅、覃祚玉、覃其云、潘波、梁杰培、陈文江。DB45/T 24822022 1 中密度纤维板霉变菌检测技术规范 1 范围 本文件规定了中密度纤维板霉变菌的术语和定义、检测方法、结果判定。本文件适用于中密度纤维板霉变过程中产生的脉孢菌属（Neurospora sp.）和木霉属（Trichoderma sp.）真菌的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 11718 中密度纤维板 NY/T 2811 橡胶树棒孢霉落叶病病原菌分子检测技术规范 3 术语和定义 GB/T 11718界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 霉变 molding 因真菌滋生繁殖而造成中密度纤维板材质和材色的变化。3.2 霉变菌 molding fungi 能够引起中密度纤维板材质与颜色变化的真菌总称。4 检测方法 4.1 原理 根据中密度纤维板霉变过程中霉变菌的菌落形态、显微形态特征，判断霉变菌是否属于脉孢菌属和木霉属（主要形态特征参见附录A）。4.2 仪器设备和材料 显微镜（放大倍数1 000倍以上，内置光源，强度可调，应具备数码照相功能，数码照相机的分辨率宜在300万像素以上）、目镜测微计（具有10倍的双目镜）、物镜（配备10倍、20倍、40倍、100倍）生物培养箱、冰箱、超净工作台、放大镜、酒精灯、接种钩针、玻璃刮刀、解剖针、滴瓶、刻度吸管、试管、三角瓶、载玻片、盖玻片、培养皿、镊子、高压蒸汽灭菌器（压力0.25 MPa，温度138）、手术刀、聚丙烯袋、低温保存箱、电炉等。DB45/T 24822022 2 4.3 培养基和试剂 PDA 培养基（按 NY/T 2811 的规定配制）、无菌水、75乙醇。4.4 取样 使用无菌手术刀切取中密度纤维板霉变部位，装入无菌聚丙烯袋中，保存在0 4 的低温保存箱中带回实验室备用，如不立即处理，则应放置于4 环境中保存。4.5 分离 4.5.1 稀释 将4.4中的样品（如样品过大则应切取约2 cm2 cm大小的样品）加入盛100 mL无菌水的500 mL三角瓶中，振荡10 min，使样品均匀地分散在稀释液中成为样品悬液；吸取1 mL样品悬液到9 mL无菌水中，按10倍法依次稀释，通常稀释到10-3。在每次吸取样品悬液时，所用的吸管在稀释液中反复吸入吹出悬液35次，使管壁吸附部分饱和以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。4.5.2 涂布 先于已灭菌培养皿中加入15 mL的PDA培养基，凝固后，用1 mL无菌吸管吸取一定稀释度的样品悬液，加0.05 mL于培养基表面，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种同一样品不同稀释度的悬液时，应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。4.5.3 培养 将接种了样品悬液的培养皿倒置，放入30 恒温培养箱中培养3 d5 d后取出。4.6 纯化 于已灭菌培养皿中倾注15 mL的PDA培养基，凝固后，用沾有少量4.5培养物的接种环在已凝固培养基表面轻轻划线（以不划破琼脂为度）。将划线的培养皿倒置，放入30 恒温培养箱中培养3 d5 d后取出，挑取单个菌落转接于新的含PDA培养基的培养皿中，于4 条件下保存备用。4.7 接种培养 4.7.1 培养基制备 将熔化培养基在超净工作台中加入直径9 cm的培养皿中，每个培养皿注入15 mL，凝固后备用。4.7.2 接种 将接种针经火焰灭菌并冷却后，从4.6的转接培养皿中蘸取极少量孢子，点植于4.7.1的培养基上，一般点植成三角形的三点。4.7.3 培养 将接完种的培养皿倒置，放入30 恒温培养箱中培养6 d。DB45/T 24822022 3 4.8 菌落观察 取出培养皿，用肉眼或放大镜观察菌落的生长或发育速度、菌落的颜色、菌落表面质地、菌落边缘、培养基颜色变化等，并记录在附录B中。4.9 显微观察 取一片洁净的载玻片，在中央滴一滴无菌水。用接种针或解剖针从培养皿的纯化菌落上挑取少许含有子实体的菌体，放入载玻片的液滴中，并将菌丝体挑开。用镊子取盖玻片，从一边轻轻加盖，避免产生气泡，如果有气泡，可在酒精灯上短时加热除去。用显微镜观测载玻片标本中菌丝、子实体、孢子等的特征，并记录在附录B中。5 结果判定 将4.8和4.9的观察结果与附录A和附录C进行对照，确定菌属。DB45/T 24822022 4 A A 附录A （资料性）脉孢菌属和木霉属的主要形态特征 A.1 脉孢菌属 Neurospora sp.子囊菌亚门、子囊菌纲、粪壳霉目、粪壳霉科的一属。菌落生长迅速，菌丝蔓延生长、无色、有横隔、多核，生孢子的气生菌丝无规律地向空中生长，呈双叉式分枝。分生孢子球形或近似球形、成链、单细胞。子囊壳簇生或散生，光滑或具有松散菌丝，呈无毛或有毛状，壁亚革质或炭质，褐色或褐黑色。顶部突起处生孔口乳头状或短嘴状。子囊壳内最初充满具分隔的侧丝，当形成子囊时侧丝消失，继后子囊发育充满子囊壳。子囊圆筒形，含48个孢子。子囊孢子椭圆形，初期无色，成熟时变为黑色或墨绿色，单细胞，带有纵的纹饰故称脉孢霉。菌落最初白色、粉粒状，很快变为淡黄色、绒毛状，成熟时上层覆盖成团块的分生孢子。主要根据子囊壳、子囊和子囊孢子的大小进行分类。A.2 木霉属 Trichoderma sp.半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科的一属。菌落生长迅速，棉絮状或致密如毡，产孢丛束区常排列成同心轮纹，表面为不同程度绿色，反面无色或有色，气味有或无。主要特征为菌丝有隔，分枝繁复。分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，还可有二级、三级分枝，呈锐角或近似直角，似松柏树枝状。分枝末端为束生、对生、互生或单生瓶状小梗。分生孢子在小梗顶端靠粘液聚成球形或近球形的孢子头，有时几个孢子头汇成一个大的孢子头，分生孢子近球形或椭圆形、圆筒形、倒卵形等，壁光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。一些种有厚垣孢子，间生于菌丝中或顶生于菌丝短侧分枝上，球形、椭圆形，无色，壁光滑。分生孢子梗的分枝形式是鉴定木霉的重要形态指标。木霉的有性阶段一般发现为肉座菌属（Hypocrea）。DB45/T 24822022 5 B B 附录B （规范性）菌落观察和显微观察记录表 B.1 菌落观察记录表 将菌落观察结果记录在表B.1中。表B.1 菌落观察记录表 菌落特征 观察结果 生长速度 菌落颜色 菌落表面质地 菌落边缘规则度 培养基颜色变化 B.2 显微观察记录表 将显微观察结果记录在表B.2中。表B.2 显微观察记录表 显微观察特征 观察结果 有无子囊壳 子囊孢子形状 子囊孢子数量 分生孢子形状 分生孢子梗的分枝形式 菌丝有隔/无隔 DB45/T 2486 见图C.822022 1图C.2。常见脉孢 附孢菌属和木霉图C.1图C.2 C C 附录C （资料性）霉属菌落图和 脉孢菌属脉孢菌属显和显微形态特菌落 微特征 特征图 图图C.图C.3 木霉属.4 木霉属显属菌落 显微特征 DB45/T 248220227 2