中国红豆杉内生真菌在升发酵罐中产紫杉醇的工艺条件研究模板.doc

中国红豆杉内生真菌在20升发酵罐中产紫杉醇代谢规律研究 摘要 对1株分离自中国红豆杉内生真菌，在20升发酵罐中进行液体发酵并测定各时期紫杉醇含量改变。结果表明：该种内生真菌大量合成紫杉醇是在对数生长末期及稳定时，并在111时紫杉醇含量达成最高即可结束发酵。关键词 中国红豆杉；内生真菌；液体发酵；紫杉醇 引言红豆杉为红豆杉科( Taxaceae) 植物，属于裸子植物亚门古老树种，是冰川活动时期孑遗植物，为世界上公认濒临灭绝天然珍稀抗癌植物，在地球上已经有250万年历史。它生态环境独特，散生于常绿阔叶林或针阔叶混交林，分布虽广，但数量稀少，种群密度小，本身繁殖力弱，生长速度慢1；现在，全球红豆杉属植物仅存11种，中国有4种1变种。即东北红豆杉(Taxus . cuspidata. sieb.et . Zucc)、西藏红豆杉( Taxus ,wallichiana.Zucc)、云南红豆杉( Taxus. T unanensis. Cheng ef. L. K. Fu)、中国红豆杉( Taxus. chinensis. Re hd)、南方红豆杉(Taxus.chinensis. Var. Mairei)2 。红豆杉属植物在民间早有应用，如云南红豆杉种子，枝叶就被作为驱虫、通经、利尿草药应用3。美国国家癌症研究中心(NCL)在1958年开始抗癌植物筛选工作中发觉该属植物树皮提取物有较强抗肿瘤活性，1963年，E. Wall和M. C. Wani首先从太平洋红豆杉树皮和根部分离到抗癌活性较强纯化合物，随即经过X光衍射确定了其结构为一紫杉烷(Taxane)属萜类化合物，即紫杉醇(Taxol)。1971年，M. C. Wani发表了紫杉烷化学结构。而含有紫杉烷独特骨架衍生物及其生物碱类约有100个左右，其中多个成份具抗癌瘤作用，以紫杉醇作用最强4。紫杉醇(paclitaxel,商品名taxol)，分子式为C47H51O14N，分子量为853192 ,为一白色结晶体，熔点为213-216；微溶于水，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。紫杉醇分子在1位、2位和7位各有一个暴露羟基，除1位羟基因为在紫杉醇三维立体结构中位置被屏蔽而展现较不活泼惰性外，其它位置羟基全部很活泼，2位易被酰化，7位易发生氧化和异构化，10位上乙酰基轻易失去而形成去乙酰紫杉醇。紫杉醇13位上带有一长脂侧链，在一定条件下能分解，脱除脂侧链，形成 baccatin III，碱是紫杉醇脂侧链降解反应催化剂27，也就是说，紫杉醇分子结构很轻易发生改变。Schiff等以后证实紫杉醇含有独特抗癌机制，它作用于细胞微管（Microtuble），经过和微管蛋白N端第31位氨基酸和第217231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能和微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，造成有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖，它对黑色素瘤及妇女乳腺癌有较强抑制作用,已作为新型抗癌药用于临床。1992年12月29日，美国食品和药品管理局(FDA)正式同意了紫杉醇作为妇女卵巢癌患者抗癌药5。后又经多年研究和临床试验,使紫杉醇抗癌范围逐步在扩大,现在进行乳腺癌、肺癌、头颈部癌、软组织癌、白血病和胃肠道癌临床试验已取得很好效果，被认为是迄今为止人类发觉最有效抗癌药品6。另外，临床上还观察到它对其它疾病有一定应用潜力，比如，它含有抗类风湿性关节炎、抗疟作用，对中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病也有一定疗效。紫杉醇因为其独特抗癌机制，尤其是对一般抗癌药品无能为力一些晚期肿瘤全部有良好疗效。但因为原料和生产技术限制，全球紫杉醇产量严重不足，所以价格昂贵，紫杉醇市场已面临供求关系严重失衡。现在紫杉醇关键是从红豆杉树皮中提取，红豆杉资源在世界上很有限，红豆杉科植物生长缓慢，且树皮中紫杉醇含量又低（约万分之二）7。加之紫杉醇溶解性差，平均产量约0.015 %生产，即每提取lkg紫杉醇需要砍1000棵红豆杉树皮。据估测（1993年），紫杉醇正式利用于临床以后，全球每十二个月约需200kg以上。按现在提取率0.03%计算，每十二个月要搜集700吨红豆杉树皮来提取，即使将全部天然资源采伐，也只能满足短期需要。伴随该药品应用范围扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也给红豆杉资源带来严重威胁，直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，肯定严重威胁生态平衡，造成对森林和人类环境和生物多样性不可填补损失。而且伴随中国对野生红豆杉资源保护方法不停加强和对盗伐红豆杉不法行为严厉打击，利用野生资源生产紫杉醇已无可能，资源已经成为从红豆杉植物中提取紫杉醇“瓶颈”。在中国，紫杉醇需求量又十分巨大，虽有5个种，但分布量全部很少，所以红豆杉药用和资源保护形成了尖锐矛盾，寻求紫杉醇未来新生产路径已成为摆在人类面前一项重大研究课题8。多年来中国外关键从3个领域进行紫杉醇生产研究，即化学合成法植物细胞培养法微生物工程法9。多年来，中国外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养红豆杉细胞系已超出10个，其中大部分已证实产生紫杉醇，不过离体培养生产紫杉醇实现工业化生产关键问题难以突破，比如，培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，而且还需要保持细胞生长和生产特征稳定等等9。Christen首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后研究吸引了众多试验室跟进。ESC Agenefc:企业在1992年NCI主持第二次紫杉醇研讨会上宣告她们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮2一5倍。中国甘烦远11等发觉云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达成12g/L,紫杉醇含量为0.119%，约为成年树树皮中含量12倍，为栽培植株40倍。不过这项技术一样存在部分问题，即培养细胞褐化问题等，短期内成功应用可能性较小。现在大家普遍认为，微生物工程法生产紫杉醇是最具潜在能力、最具可能性一个方法10。植物内生真菌（endophyte）是指生活在植物组织内，对植物组织没有引发显著病症状菌，包含那些生活史中某一阶段营表面生腐生菌，对宿主临时没有伤害潜伏性病原菌（Latent pathogens）和菌根菌。植物内生真菌是一类应用前景很宽广资源微生物。植物内生菌研究始于19世纪中叶，De Bary（1986）首次提出植物内生菌一词“endophyte”，在其后几十年中，前后有几十种牧草中发觉了内生真菌，多年来研究表明，几乎全部植物中全部有内生菌存在，且其种类极为丰富。内生菌关键生长在植物皮下组织当中，而且植物内生菌长久生活在植物体内特殊环境中并和宿主协同进化，首先植物体为其提供生长必需能量和营养，其次，植物内生菌又可经过本身代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。植物内生菌生物学作用关键又固氮作用、进植物生长作用和增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等。而且植物内生菌能够产生多个全新活性物质，作为生物防治资源、外源基因载体和新药起源，在农业、医药卫生领域有这巨大应用潜力。伴随大家对微生物资源不停开发，微生物研究领域不停扩展，微生物研究方法不停创新和改善，内生菌研究越来越受科研工作者重视。利用内生真菌液体发酵方法含有以下六个优点：微生物作为工业生产源泉，可在发酵罐中进行，源源不尽进行生产；微生物发酵方法轻易扩大化，发酵成本相对较低，利于工业化生产；微生物生长仅需要常规培养技术，在搜集紫杉醇前，可经过优化发酵条件、改善技术来提升产量；微生物易于经过基因工程等方法筛选高产菌株，提升紫杉醇产量；内生真菌生长快速，易于培养，所用培养基相对较为经济；可望满足市场需求，降低紫杉醇价格11。1991年，美国蒙拿大植物病理学系Strobel研究小组从药用植物太平洋红豆杉（Taxus brevifolia）树皮中分离到1株含有合成和宿主相同抗癌药品紫杉醇内生真菌（Taxomyces andreanae）12,内生真菌研究逐步成为热点。1993年Gary A Strobel13等从短叶红豆杉分离筛选内生真菌，产率为2450g/L；1996年又从喜玛拉雅山红豆杉中分离出另一株产紫杉醇内生真菌，产率为6070g/L14；1995年，日本Nippon steel Cooporation15分离出产紫杉醇真菌，产率为40g/L；1996年，加拿大Novo Pharma企业16分离出一株产紫杉醇真菌，其产率高达116mg/L，为现在最高水平。中国邱德有等从云南红豆杉（TYunnanensis）中分离出1株产紫杉醇内生真菌，但产率很低，每升产率只能以纳克计量；周东坡17等分离出了3株产紫杉醇内生真菌，产率也仅为51.06125.7g/L。陈建华18等从云南红豆杉中分离出230余株内生真菌，经检测有5株表现出产紫杉醇特征，其中2株产率较高，约为1mg/L,是中国现在研究较高水平。因为这些菌株产紫杉醇量极少，现在还未投入工业性发酵生产。通常来说，发酵产量水平要达成1mg/L左右才有工业生产价值19。但可经过培养基优化、菌株改良等方法提升产量实现紫杉醇工业化生产。内生真菌是一类应用前景宽广微生物资源，用微生物发酵方法生产紫杉醇，是处理药源问题有效路径20。本文经过对1株分离自陕西留坝中国红豆杉内生真菌在发酵罐中进行液体发酵，意在研究中国红豆杉内生真菌在20升发酵罐中产紫杉醇规律，为开发利用这一珍贵真菌资源提供参考依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试菌株 一株分离自中国红豆杉内生真菌，编号为K10A；由陕西省资源生物关键试验室食用药用菌菌种保藏中心提供。1.1.2 关键仪器设备 高效液相色谱仪（惠普HP-1100）、电子天平（FA1604型）、20L光照发酵罐（BIOTECH-3000上海保兴生物设备工程）、烘箱（LRH-250-GS）、人工气候箱（广东省医疗器械厂）、旋转蒸发仪（RE-52AAA，上海嘉鹏科技）、循环水多用真空泵（SHZ-95B，郑州杜浦仪器厂）、灭菌锅、超净工作台等。 1.1.3 培养基 母种培养基（马铃薯200.0g, 葡萄糖20.0 g, 琼脂20 .0g, H2O 1000.00mL , KH2PO3 5g、MgSO47H2O 3g、VB1 10mg、pH自然）；液体培养基（马铃薯200.0 g,葡萄糖40.0g, H2O 1000.0 mL , KH2PO3 2.0g、MgSO47H2O 0.5g、(NH4) 2SO4 3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏0.8g、VB110mg、pH自然）。1.2方法1.2.1 液体发酵 （1）菌种活化 在试管斜面接入母种，于28下活化培养57d，待菌丝充满斜面，放入4冰箱备用。（2）液体种制备 制备液体培养基，分装于三角瓶中, 装液量300mL500mL，于121.3灭菌30min，冷却后将已活化菌株接入液体培养基中，静置培养后转至振荡培养箱，在28，160r/min振荡培养，培养4d，待长出大量菌丝球后，置于4冰箱保留，备用。（3）液体发酵 设置搅拌轴转速120210r/min、空气流量1.2L/min、发酵罐内温度28、pH6.0；pH电极、溶氧电极及酸碱蠕动泵校准；制备液体培养基14L，由加料口加入发酵罐内，同时加入适量菜籽油作消泡剂；开启蒸汽发生器对发酵罐内发酵液实罐灭菌，待冷却后放置24h检验各参数确定灭菌是否根本；将液体种由接种口接入，至此发酵开始。 1.2.2 紫杉醇萃取 每3h抽取发酵液500mL；布什漏斗抽虑过滤发酵液，菌丝体水洗两遍，搜集置于烘箱（48）烘至恒重；取菌液于65旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积乙酸乙酯进行萃取，搜集萃取剂相；将菌丝体放入研钵研磨至菌丝体完全破碎，加入一定量乙酸乙酯超声波提取30 min 3次，搜集乙酸乙酯相。合并发酵液和菌丝体乙酸乙酯相，并于60 旋转蒸发至干，用少许甲醇溶解后定容至10ml，置4冰箱保留以备用。1.2.3 分析检测 利用HPLC建立紫杉醇标准曲线：称取紫杉醇标准品0.85mg，用乙醇溶解，定溶至10mL。高效液相色谱(HPLC) 测定，条件为：流动相，甲醇：水(v/ v) = 6535，C18柱(4.6 mm 150 mm , 5m) ，流速1mL/min，检测波长228nm.，进样量20L，单点绘制标准曲线。将上述已用乙醇溶解紫杉醇提取物经滤膜过滤后上高效液相进行检测。紫杉醇标准品HPLC色谱图（图2.1），紫杉醇物质出峰时间在11.001min。 图1.0 紫杉醇标准品HPLC色谱图Figure 1.0 Fermentation extracts of Tax-2 HPLC2 结果和分析2.1 产紫杉醇动力学曲线2.1.1 pH随时间改变关系 在发酵过程中，K10A菌代谢产酸，须配置碱液用以维持发酵环境在5.86.2适宜范围； 图2.1 PH随时间改变关系 由图2.1表明，前二十四小时停留在延滞期，pH下降不显著；到第39h时，pH快速下降，说明菌丝体进入对数期；第48h，因为菌丝体代谢产酸，pH低于5.8, 碱液自动加入，pH快速在第57h恢复到6.2。由此可见，加入碱液能够使pH维持在一个有利于菌丝体生长代谢以取得紫杉醇最高积累量范围。2.1.2 溶氧随时间改变关系图2.2 溶氧和发酵时间关系 图2.2表明，伴随发酵进行，发酵液中溶氧呈下降趋势。从接种到发酵进行到第二十四小时， 溶氧基础维持在70%左右，说明K10A内生真菌进入一个新环境处于生长延滞期并一直延续到第36h；从第36h60h可见溶氧曲线快速下降，说明K10A内生真菌已经完全适应了新环境并快速繁殖进入对数期，此时菌丝体浓度逐步达成最大，大量菌丝体需消耗大量溶氧，使发酵液中溶氧快速降低；当发酵进行到第66小时时候，发酵液中溶氧仅为3.4%，提升转速及空气流量溶氧提升效果不显著，观察发酵液，菌丝体密度很大，发酵液粘度阻力变大，致使空气气泡不能最大程度和发酵液接触传输氧气。从第69h开始，K10A内生真菌进入稳定时，溶氧继续小幅度下降，其原因是：(1)高密度菌丝体需要消耗大量氧气；（2）高密度菌丝体增大了发酵液流动阻力使空气不能充足和发酵液混合接触；(3)发酵液中次生代谢产物如多糖产生增加了发酵液黏度，阻碍了氧在发酵液中传输。2.1.3 紫杉醇积累和时间关系 图2.3 紫杉醇和发酵时间关系 由图2.3能够看出，紫杉醇积累量和溶氧消耗菌丝体生长呈一定线性关系；结合溶氧图，延滞期（036h）和对数生长前中期（3657h）全部没有紫杉醇产生积累；但在对数生长久后期紫杉醇开始大量合成，在稳定时（6090h）合成速度达成最快；能够判定，K10A内生真菌进入稳定时后才会大量合成紫杉醇等次生代谢产物；但紫杉醇合成会对本身细胞产生某种程度生理毒性，而抑制菌丝体生长21；伴随细胞内紫杉醇浓度升高，也会阻遏紫杉醇深入合成（102108h）；发酵至111h时，紫杉醇含量不再增加；所以能够确定，K10A内生真菌发酵罐液体发酵在111h时能够结束发酵。3小结 利用内生真菌来合成紫杉醇是多年来开展紫杉醇资源研究方法之一，尚处研究初级阶段。本试验是经过对中国红豆杉内生真菌进行实罐连续发酵来确定发酵过程中紫杉醇含量积累改变规律；最终确定该种内生真菌大量合成紫杉醇是在对数生长末期及稳定时，并在111h时紫杉醇积累达成顶峰结束发酵。本试验使用20L发酵罐进行实罐发酵，发酵环境比三角瓶摇床培养更靠近于工厂大规模发酵罐实罐发酵；利用内生真菌来发酵生产紫杉醇是多年来处理紫杉醇资源短缺一条潜在路径。 总而言之 能为中国红豆杉内生真菌在工业发酵放大生产中提供理论依据。参考文件1 中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编写组.菌种保藏手册M.北京:科学出版社,1980 ,114.2 田成国,吴键.红豆杉抗癌有效成份研究J.贵州师范大学学报,1999,17(4):1921.3 张炯炯.红豆杉植物资源开发利用J.生物学杂志,8(4):3031.4 周东坡,平文祥,孙剑秋等.紫杉醇产生菌分离研究J.微生物学杂志,3(21):1819.5 王润玲,陈涓.紫杉醇研究及应用进展.中药学,1997,28(增刊):57.6 Kingston D G I,Molinero A A,Rimoldi J M.The taxane diterpenoidsA.In:Herz W,Kirby G W,Moore R E,etal,eds.Progress in the chemistry of organic natural praoducts C,New York:Spiringer Verlag,1993,61:3160.7 方起程,方唯硕.紫杉醇研究进展J.中草药,1997,28(增刊):15.8 王海燕,李运曼,刘国卿.紫杉醇抗癌机制研究进展J.药学进展,1999,23(4):209.9 王正平.天然抗癌药品紫杉醇J.应用科技,31(1):5658.10 丁如贤,王昊.红豆杉生物工程研究进展J.药学实践杂志,18(5):274276.11 林福呈,刘小红,王洪凯等.紫杉醇及其产生菌研究现实状况和展望J.微生物学报,43(4):534538.12 Stierle A , Strobei G, Stierle D. 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