香菇多糖抗氧化增效剂的研究毕业论文.doc

青岛农业大学毕 业 论 文（设计） 2014年 6 月 6 日目录摘要IAbstractII1引 言11.1 立项背景及依据11.2 研究现状11.2.2抗氧化协同作用研究现状31.3 主要研究内容42材料与方法42.1 材料42.1.1 原料42.1.2 试剂42.1.3 仪器52.2 方法52.2.1 多糖、多肽、皂苷等活性物质的提取及制备52.2.2 四种提取物含量测定62.2.3 不同提取物抗氧化实验72.2.4提取物与香菇多糖配比增效实验72.2.5 最佳搭配物质与香菇多糖的抗氧化最佳配比实验83结果与讨论83.1四种提取物抗氧化能力的测定83.1.1 四种提取物还原能力测定83.1.2 四种提取物清除DPPH能力测定93.1.3四种提取物清除羟自由基活性结果93.2 三种提取物对香菇多糖的抗氧化增效实验113.2.1三种提取物与香菇多糖复配物还原能力测定结果113.2.2 三种提取物与香菇多糖复配物DPPH清除能力实验113.2.3三种提取物与香菇多糖复配物OH清除能力实验123.3 最佳增效剂与香菇多糖抗氧化配比实验133.3.1不同配比复合物还原能力的测定133.3.2不同配比复合物清除DPPH能力测定143.3.3不同配比复合物清除羟自由基能力测定144结论15致谢16参考文献17香菇多糖抗氧化增效剂的研究食品质量与安全专业 任嘉玮 指导教师 王凤舞摘要：本文研究了大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷对香菇多糖抗氧化能力的协同增效作用。采用复合酶法制备香菇多糖，微波辅助提取大枣多糖、碱溶酸沉协同酶解法制备大豆多肽、醇提法制备三七皂苷。将大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷与香菇多糖分别进行体外还原能力，清除OH和DPPH能力的测定。再按照一定的比例分别与香菇多糖复配后进行上述三种活性测定，得到最佳的协同抗氧化增效剂。结果表明，还原能力：三七皂苷香菇多糖大枣多糖大豆多肽，DPPH清除能力：香菇多糖三七皂苷大枣多糖大豆多肽，OH清除能力：三七皂苷香菇多糖大枣多糖大豆多肽。抗氧化协同实验结果表明：大枣多糖和三七皂苷对香菇多糖有协同增效作用，其中大枣多糖的增效作用最强，基本上能提高10%左右。在香菇多糖和大枣多糖的质量比为7: 3时协同抗氧化能力最强。综合分析，大枣多糖为三种物质中香菇多糖抗氧化能力的最佳增效剂。关键词：香菇多糖；大枣多糖；大豆多肽；三七皂苷；抗氧化；协同增效IEffects of Peptides, JDP and PNS on Antioxidant Activity of LentinanStudent majoring in Food Quality and Safety REN Jiawei Tutor WANG Fengwu Abstract:To know the synergistic effect of jujuba polysaccharide, soybean peptides and panax notoginseng saponins on antioxidant activity of Lentinan. Four antionxidant components were extracted to test the antioxidant activity (the reducing power, the ability of scavenging DPPH and OH) and compared these abilities of the mixture which are mixed with Lentinan, respectively. Then choose the best antioxidant mixture and adjust the proportion of them in antioxidant activity experiment. And Lentinan (Len) was obtained by composite enzymatic method, Jujuba polysaccharide (JDP) was extracted by the microwave method, soybean peptides was made by acid precipitation and the composite enzymatic method, panax notoginseng saponins (PNS) was extracted by alcohol precipitation method. The results demonstrated that the reducing power: PNSLenJDPpeptides; the ability of scavenging DPPH: LenPNSJDPpeptides; the ability of scavenging OH: PNS Len JDP peptides. The synergistic effect experiments demonstrated that JDP and PNS both have good synergistic effect, but JDP uncommonly increased the Lens antioxidant activity, basically increased by 10%. Therefore, JDP has the best synergistic effect of antioxidant activity in the three extracts. The best antioxidant ratio of PNS to JDP is 7: 3.Key words:Lentinan(Len); Jujuba polysaccharide(JDP); soybean peptides; panax notoginseng saponins(PNS); antioxidant activity; synergistic effect II青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究1引 言1.1 立项背景及依据 多糖具有广泛的药理作用，如作为免疫调节剂，促进细胞因子生成，活化补体；抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性溃疡、抗氧化、防衰老、降血糖血脂等，而且毒性相对较低。香菇（Lentinus edodes）是侧耳科（Pleara taco）的担子菌，含有多种有效药用成分，其中香菇多糖（Lentinan，LNT）是目前研究很热门的话题。研究表明，香菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、抗氧化和刺激干扰素形成等功能并且对正常细胞不产生毒副作用1。大豆多肽是大豆蛋白经酶促水解后制得的一定分子量范围的多肽混合物，以 36 个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸等成分2。不仅能为人体提供生长发育所需的氨基酸、能量等，还具有防病治病和提高人体免疫力的功效。大枣为鼠李科植物的成熟果实，可药食两用。大枣富含糖类、纤维素、维生素、氨基酸、蛋白质、矿物质等营养成分，特别是含有多糖、芦丁、环磷酸腺苷(c-AMP)等活性成分，这些成分使红枣具有多种生物保健功能。大枣中的多糖成分具有多种生物活性，能提高机体的免疫能力，且对正常细胞无毒副作用，是理想的免疫增强剂3。三七（Panax notoginseng）为五加科人参属植物， 以干燥的根入药，是我国特有的名贵中药材，也是我国最早的药食同源植物之一。三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七的活性成分。据现代化学和药理学研究发现在抗氧化损伤、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷，对脑血管缺血缺氧损伤、脑缺血再灌注损伤有保护作用，对脑神经细胞凋亡有抑制作用4。 衡量某一物质的抗氧化效果，采用体外抗氧化体系时，由于抗氧化作用机制不同，有可能产生的结果也不一致，所以一般要求至少采用两种方法来衡量样品的抗氧化活性。本实验以香菇多糖为主要研究对象，采用3种抗氧化活性检测方法（还原能力测定，清除OH和DPPH能力测定）研究大豆多肽、大枣多糖及三七皂苷对香菇多糖抗氧化的协同作用，以期为食品资源的开发利用提供更多的理论依据。1.2 研究现状 1.2.1 多糖、皂苷和多肽抗氧化性质研究现状1.2.1.1抗氧化多糖多糖的抗氧化研究较多，主要集中在真菌及有功效的植物中。黄磊5测定三种不同多糖组分在邻苯三酚自氧化体系和Fenton体系中清除自由基的能力，得到抗氧化能力由强到弱依次为Len-40Len-60Len-80。张全斌等6采用体外实验研究海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH的清除作用以及对H2O2诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保护作用。结果表明海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，IC50为20.3g/mL。其对羟自由基的清除作用较弱，对DPPH的作用很弱。滕利荣等7研究了热水法及复合酶法提取百合多糖(LBP)的最佳条件，发现复合酶法提取的多糖在体外的抗氧化活性均显著高于热水法提取的多糖，对超氧阴离子及羟自由基有抑制作用。冯义莉等8对香菇发酵液中多糖成分进行研究，得到其抗氧化活性。徐桂兰等9提取香菇和鸡腿菇中的多糖，测定多糖抗食用油脂的氧化作用。利用Fenton反应检测其对羟自由基的清除作用，对超氧阴离子自由基的清除作用以及在模拟胃液条件下清除NO2-的作用。结果表明：两种多糖提取物都具有体外抗氧化性能，香菇多糖提取物的抗活性氧自由基能力和清除NO2-的能力优于鸡腿菇多糖提取物。亓树艳等10通过设计正交试验优化水浸、超声和微波等方法提取大枣多糖的工艺，并通过体外抗氧化研究得到在多糖提取率以及抗氧化作用效率。其中微波法提取大枣多糖效果最佳。0.0750.135 mg/mL大枣多糖对羟自由基最大清除率为48.5（微波法）。1.2.1.2抗氧化皂苷 周琳，曾英等11通过正交实验得到提取三七总皂苷的最佳方法为超声复合酶法。提取液中总皂苷含量为10.33%，提取物得率为35.17%。王步江等12以苦瓜皂苷对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率作为考查指标，确定了苦瓜皂苷的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比l:15，温度55，提取时间2.5h。0.4mg/mL苦瓜皂苷对超氧阴离子自由基的清除率达到92.5%，对羟基自由基(OH)的清除率达到78.9%。李鹏，李绍平13等以三七总皂苷、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1含量为指标，得到以甲醇为溶剂，药材粒径为0.30.45mm，提取温度150，提取压力6.895MPa，提取15min，提取1次时，能高效提取三七皂苷类成分。1.2.1.3抗氧化多肽 植物抗氧化肽的研究很多，主要集中在豆类、玉米等。大豆蛋白是目前研究地最多的植物抗氧化肽原料。刘秀红等14以大豆为原料，利用木瓜蛋白酶进行水解，制备了大豆抗氧化肽。吴永沛等15也以大豆为原料，采用固态发酵法获得活性较强的抗氧化肽。包怡红等16以山核桃为原料，采用混合的风味蛋白酶，制备出具有较强清除自由基能力的山核桃肽。程云辉等17以麦胚为原料，通过碱性蛋白酶水解，发现其蛋白水解液具有很强的超氧阴离子自由基清除能力。刘宇等18以鹰嘴豆为原料，利用碱性蛋白酶水解，制得了抗氧化能力强于鹰嘴豆蛋白和大豆蛋白的鹰嘴豆肽。1.2.2抗氧化协同作用研究现状 阮征等19研究菜籽多酚、Vc、菜籽多酚与Vc混合物在化学模拟体系中清除超氧阴离子自由基与羟自由基的能力。结果表明菜籽多酚、Vc、菜籽多酚与Vc的混合物清除O2-、OH都不呈剂量-效应关系。当总浓度为0.25mg/mL时，菜籽多酚与Vc的混合物没有协同增加清除的作用；菜籽多酚与Vc按7: 3、8: 2两种比例混合，在清除OH时有协同增效作用，协同增效的最佳比例为7:3，最大清除率达78.78%。严奉伟等20以过氧化值（POV）与酸价（AV）为指标，采用Schaal烘箱法研究菜籽多酚在菜籽油中的抗氧化效果，及其与BHA在菜籽油中的抗氧化协同增效作用。结果表明菜籽多酚在菜籽油中抗氧化与维持低酸价的最佳添加量为0.02%。菜籽多酚与BHA在菜籽油中具有抗氧化协同增效作用，菜籽多酚与BHA按0.008%：0.012%使用时，菜籽油的POV与AV值达到最低。王莹21实验研究证明：作为增效剂，有机酸、-胡萝卜素等能够增强茶多酚的抗氧化性能；壳聚糖、食盐等能够增强茶多酚的抑菌活性，维生素类既能够增强茶多酚的抗氧化性能又能增强其抑菌作用。莫树平等22以热带水果荔枝、龙眼、芒果为研究对象，选取叔丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHO)、二丁基羟基甲苯(BHT)及茶多酚等作为抗氧化剂，柠檬酸、苹果酸、磷酸、葡萄糖酸钙、EDTA等作为抗氧化增效剂，进行单体和复合抗氧化剂抗氧化试验。得到各种增效剂均可明显增加TBHQ的抗氧化能力，不同增效剂对不同抗氧化剂的增效作用不同。综合比较，TBHQ加入柠檬酸及EDTA增效后对荔枝、芒果原果汁的抗氧化效果理想，VC保存率均达到85%以上。李书国等23以易氧化酸败的核桃油为试验原料，取等量的9组样品，将抗氧化剂TBHQ、PG、BHT、VE及增效剂柠檬酸、抗坏血酸（VC）分别以不同的组合方式和配比添加到上述9组样品中，然后与空白样一起利用Schall烘箱法每隔24 h测一次过氧化值（POV），比较它们的氧化稳定性，得到最佳条件。张燕平等24从紫苏茎叶中提取抗氧化活性成分，并与茶多酚、维生素E比较。实验得到在乙醇与碱水体积比为8:2混合提取时提取物达到最佳抗氧化效果，柠檬酸对其有很好的增效作用。初步鉴定其活性成分为酚类，黄酮类化合物。1.3 主要研究内容（1）香菇多糖、大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷的抗氧化性质；（2）大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷对香菇多糖的抗氧化增效作用；（3）最佳香菇抗氧化增效剂的配比。2材料与方法2.1 材料2.1.1 原料 香菇、大豆粉、和田大枣，均购自青岛城阳大润发超市；三七，购自青岛城阳中药店。2.1.2 试剂木瓜蛋白酶酶活2000U/mg杰辉生物技术有限公司纤维素酶酶活15U/mg上海博奥生物科技有限公司无水乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司抗坏血酸（Vc）分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司盐酸分析纯莱阳康德化工有限公司冰乙酸分析纯莱阳康德化工有限公司高氯酸分析纯莱阳康德化工有限公司DPPH（二苯代苦味酰基自由基）分析纯美国Sigma公司铁氰化钾分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司邻二氮菲-亚铁分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸亚铁分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司双氧水分析纯洛阳市昊华化学试剂有限公司磷酸二氢钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司Tris分析纯瑞士Roche公司EDTA分析纯瑞士Roche公司邻苯三酚分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司二硫苏糖醇（DTT）分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司三氯乙酸（TCA）分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司苯酚分析纯天津市天力化学试剂有限公司2.1.3 仪器AR1140电子分析天平美国奥豪斯电子天平公司电热恒温水浴锅龙口市先科仪器公司SHA-B型恒温振荡器常州国华电器有限公司UV-2000紫外可见分光光度计上海尤尼柯电器有限公司DU-800紫外-可见分光光度计美国贝克曼库尔特有限公司FD-ID-80冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司868型pH计上海奥立龙电器有限公司RE-6000旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂GBOF20CN1L-DG(WO)型微波炉Galanz有限公司TGL-16M高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司2.2 方法2.2.1 多糖、多肽、皂苷等活性物质的提取及制备2.2.1.1 香菇多糖提取（超声波协同复合酶法） 新鲜香菇切碎，在60下干燥至恒重， 粉碎后过60目筛。取香菇粉2.0g，按料液比1：20加蒸馏水。超声提取温度60，时间40min，调节pH值至6.5。称取适量复合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1），加入5mL蒸馏水溶解。香菇溶液预热至55，加入酶液，恒温振荡。反应结束后过滤，将滤液灭酶10min。冷却至室温后4000r/min离心，取上清液，醇沉，离心后取沉淀物。冷冻干燥得香菇多糖粉末，低温保藏。2.2.1.2 大枣多糖提取（微波辅助法） 干大枣切碎，在60鼓风干燥箱中干燥至恒重， 粉碎后过60目筛。取烘干粉碎的大枣粉1.5g，以1: 30的料液比加蒸馏水水浸80分钟，微波400w加热4分钟，冷却，静置。4000r/min离心10分钟，取上清液，醇沉，离心，取沉淀物。冷冻干燥得大枣多糖粉末，低温保藏待用。 2.2.1.3 三七皂苷粗提物提取（醇提法） 将三七放置在烧杯中，用蒸馏水浸泡48小时，粉碎成细小块状，过滤，滤渣放置烘箱中烘干，将滤液蒸发浓缩。取三七样品2.0g，加20mL 60%的乙醇连续浸提两次，每次1.5h，过滤，除去滤渣。合并提取液，在50下蒸发浓缩。浓缩液干燥至恒重，密封保存备用。2.2.1.4 大豆多肽的制备（碱溶酸沉协同酶解法） 取5.0g大豆粉，按料液比1: 10加入蒸馏水，用NaOH调pH值为9.0，水浴50振荡30min，冷却，离心。取沉淀物按照上述方法重复处理，将两次上清液合并，调节其pH值为4.5，静置20min。离心后所得沉淀物即为大豆蛋白。真空冷冻干燥，低温保存。采用考马斯亮蓝法测蛋白含量25 测得浓度为34g/mL，取料液比1: 30，调pH至7.5，温度60，加入1.2%的木瓜蛋白酶水解2h，100，5min 终止水解。5000r/min离心，取上清液，冷冻干燥备用。 2.2.2 四种提取物含量测定2.2.2.1 多糖含量测定香菇多糖及大枣多糖提取液经淀粉-KI试验无颜色变化，采用硫酸-苯酚法26 测定其多糖含量。2.2.2.2 皂苷含量测定 比色法测定总皂苷含量27。标准曲线的绘制：准确称取5mg人参皂苷对照品，加乙醇定容至5mL，配置成1mg/mL皂苷溶液。分别吸取40、60、80、100、120、140、160、180L标准液于具塞试管中，水浴挥发溶剂，加入新配置的5%的香草醛冰乙酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，于60水浴中加热15min，流水冷却后加入5mL冰乙酸，摇匀，放置15分钟，以相应试剂做空白对照，用紫外分光光度计在560nm处测得吸光值，绘制标准曲线。标准曲线方程为：A=0.0033x0.0021(r2=0.9991）。含量测定：吸取样品溶液0.5mL，依照标准曲线操作步骤测定。2.2.2.3 多肽含量测定 大豆多肽提取液采用BCA法测定肽含量28。 取20L肽液于离心管中，加蒸馏水至2mL，混匀，得100倍稀释液。取20L稀释液，加200LBCA摇匀，平行三组，一组空白对照，37下静置1h。在562nm处测定吸光值。根据标准曲线测肽含量。2.2.3 不同提取物抗氧化实验 体外抗氧化实验分别测定香菇多糖、三七皂苷、大枣多糖、大豆多肽四种提取物的还原能力、DPPH和羟自由基（OH）清除能力，分别得到清除率曲线并计算出四种物质的IC50值，比较它们抗氧化能力的大小。具体方法如下：2.2.3.1 还原能力的测定铁氰化钾还原法292.2.3.2 清除DPPH自由基能力改进的Nagai法30 DPPH（二苯代苦味酰基自由基）是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈现深紫色，在517nm处有最大吸收峰。当有自由基清除剂（AE）存在时其单电子被结合而使其颜色减退，在最大吸收波长处吸光值最小，减小的程度与清除剂的清除能力及数量成定量关系。2.2.3.3清除羟自由基的活性31 采用邻二氮菲-亚铁法。过氧化氢与亚铁体系通过Fenton反应产生OH，亚铁离子可被OH氧化成铁离子，邻二氮菲-亚铁在536nm处的最大吸收峰随之消失。2.2.4提取物与香菇多糖配比增效实验 根据还原能力实验和自由基清除率实验结果，得到具有相同还原能力和相同DPPH和OH清除能力下不同提取物的浓度。按照相应的浓度将大豆多肽、三七皂苷和大枣多糖分别与香菇多糖按体积比1:1搭配起来。测定混合物的还原能力、DPPH清除能力及羟自由基清除能力大小，研究其增效作用。 2.2.5 最佳搭配物质与香菇多糖的抗氧化最佳配比实验 根据提取物与香菇多糖的抗氧化配比增效实验，得到大豆多肽、三七皂苷和大枣多糖三种代表提取物中的最佳香菇抗氧化增效剂。按照最佳的增效剂和香菇多糖的质量比1:9，2:5，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1进行还原能力、清除DPPH能力和OH能力实验，综合得到最佳配比。3结果与讨论3.1四种提取物抗氧化能力的测定3.1.1 四种提取物还原能力测定 香菇多糖、三七皂苷、大枣多糖、大豆多肽的还原能力测定结果见图1。图1 还原力曲线Fig. 1 Curve of reducing power 还原能力以测得的吸光值A700大小表征其大小，吸光值越大，测得样品的还原能力越强。由图1可知，四种提取物的还原能力在一定浓度范围均与其浓度呈正相关。在相同的还原能力下，选定A700为1.0时，各提取物浓度如下：大豆多肽12mg/mL，大枣多糖6mg/mL，香菇多糖1mg/mL，三七皂苷为1.2mg/mL。结果表明：在A700为0.51.0的范围内，在同一吸光值下所需各提取物浓度按三七皂苷、香菇多糖、大枣多糖、大豆多肽的顺序递增；在A700为其他浓度时，四种提取物物也近似呈现类似变化趋势。故在一定浓度范围内，四种提取物还原能力大小为：三七皂苷香菇多糖大枣多糖大豆多肽。3.1.2 四种提取物清除DPPH能力测定 香菇多糖、三七皂苷粗提物、大枣多糖和大豆多肽的DPPH清除率测定结果如图2所示。图2 四种提取物对DPPH的清除能力Fig.2 Ability of scavenging DPPH of extracts 结果可知四种提取物的DPPH清除能力均随浓度的增大而增大。香菇多糖在4mg/mL时清除率即可达到80%。大枣多糖和三七皂苷DPPH清除率随浓度的增加而增加的幅度比香菇的小，大豆多肽在浓度027mg/mL范围内DPPH清除率随浓度的增加变化缓慢，在25mg/mL时清除率达到61%。根据4种提取物的DPPH清除率曲线的回归方程可计算出这4种物质DPPH 清除率的IC50值，结果见表1。表1 四种提取物DPPH 清除能力IC50值Table 1 IC50 values of scavenging DPPH of all extracts种类回归曲线方程IC50/(mg/mL)香菇多糖y=-5.7767x2+42.122x+4.4481 R2=0.99831.32大豆多肽y=2.4001x+1.4264 R2=0.974420.45大枣多糖y=8.5246x+5.9670 R2=0.99225.23三七皂苷y=-3.1487x2+28.555x+1.8343 R2=0.97442.32 据图2及表1分析得四种物质IC50值大小为：香菇多糖三七皂苷大枣多糖三七皂苷大枣多糖大豆多肽。其中大豆多肽的DPPH 清除能力较差。3.1.3四种提取物清除羟自由基活性结果 香菇多糖、三七皂苷粗提物、大枣多糖和大豆多肽的OH清除率测定结果如图3所示。图3 香菇多糖、大枣多糖、三七皂苷对羟自由基的清除能力Fig.3 Ability of scavenging OH of Len, JDP and PNS 由图3可知香菇多糖、大枣多糖、三七皂苷均具有较好的OH清除能力，而大豆多肽不具有该活性。三种提取物的OH清除能力均随溶液浓度的增大而增大，三七皂苷在浓度0.3mg/mL时OH清除率即达到70%，清除效果最明显。香菇多糖及大枣多糖的OH清除率随浓度变化得较缓慢，其中香菇多糖的清除效果比大枣多糖的稍好。大枣多糖在4mg/mL后OH清除率变化不大。 根据四种提取物羟自由基清除能力曲线得到回归曲线方程，计算出四种提取物OH清除能力的IC50值见表2。表2 四种物质清除羟自由基能力IC50值Table 2 IC50 values of scavenging OH of all extracts种类回归曲线方程IC50/(mg/mL)香菇多糖y=-8.5746x2+55.285x-13.869 R2=0.99071.50三七皂苷Y=-701.67x2+494.81x-17.556 R2=0.96260.20大枣多糖y=-2.2664x2+24.704x+2.9940 R2=0.99052.50大豆多肽无无清除能力 据图3及表2分析得三种物质IC50值大小为：三七皂苷香菇多糖香菇多糖大枣多糖大豆多肽。其中大豆多肽的OH清除能力较差。综合以上还原能力、DPPH清除能力和OH清除能力实验结果，可以看出四种提取物均具有抗氧化能力。香菇多糖和三七粗皂苷在三种抗氧化实验中均有较好的抗氧化能力，且后者在OH清除率和还原能力上高于前者。大枣多糖的抗氧化能力比香菇多糖稍低，大豆多肽的抗氧化能力在四种提取物中最低。3.2 三种提取物对香菇多糖的抗氧化增效实验3.2.1三种提取物与香菇多糖复配物还原能力测定结果 将大豆多肽、大枣多糖、三七粗皂苷和香菇多糖分别配制成还原能力为1.0时的浓度溶液，后按照体积比1:1将前3种物质分别与香菇多糖复配。以香菇多糖为对照，比较三种提取物对香菇多糖还原能力的协同增效作用。结果如图4所示。图4 大豆多肽、三七皂苷、大枣多糖与香菇多糖的复配物还原能力Fig. 4 Reducing power of the mixture of Len with peptides, PNS and JDP注：采用Duncans multiple range test方法分析，不同字母表示差异显著（P三七皂苷大枣多糖。3.2.2 三种提取物与香菇多糖复配物DPPH清除能力实验 分别将大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷和香菇多糖配制成清除DPPH达到IC50值时的浓度溶液，再按照体积比1:1将3种物质分别与香菇多糖复配。以香菇多糖为对照，比较三种提取物对香菇多糖DPPH清除能力的协同增效作用。结果见图5。图 5 大枣多糖、大豆多肽、三七皂苷与香菇多糖的复配物对 DPPH 的清除能力Fig. 5 Ability of scavenging DPPH of the mixture of Len with peptides, JDP and PNS 注：采用Duncans multiple range test方法分析，不同字母表示差异显著（P0.05， n=3） 由图5可知，大枣多糖与香菇多糖协同抗氧化的增效作用最为明显，可以提高10%左右；三七皂苷其次，能够增效4%。而大豆多肽对香菇多糖的DPPH清除能力上没有协同增效作用，有减效作用。三组测试结果与香菇多糖之间DPPH清除能力之间均有显著差异性。但差异性大小由大枣多糖、三七皂苷、大豆多肽依次递减。这可能是由于大枣多糖与香菇多糖的复配物相互作用增强了DPPH的清除能力。3.2.3三种提取物与香菇多糖复配物OH清除能力实验 因为大豆多肽不具有羟自由基清除的能力，因而不进行下一步的配比实验。按照清除OH的IC50值的浓度分别配制大枣多糖、三七皂苷和香菇多糖溶液，后按照体积比1:1将2种物质分别与香菇多糖复配。以香菇多糖为对照，比较两种提取物对香菇多糖OH清除能力的协同增效作用。结果如图6所示，图6 大枣多糖、三七皂苷与香菇多糖的混合物对羟自由基清除能力Fig. 6 Ability of scavenging OH of the mixture of Len with JDP and PNS 注：采用Duncans multiple range test方法分析，不同字母表示差异显著（P0.05， n=3）如图6，可以看出大枣多糖对香菇多糖清除OH的效果提高了约10%，由SPSS软件分析知大枣多糖对香菇多糖的OH清除能力有显著差异，而三七皂苷没有显著性差异。推测可能是三七皂苷的结构对香菇多糖的结构在清除OH上没有明显帮助，而大枣多糖的结构与香菇多糖配合可以有效清除OH。综合以上三种抗氧化增效实验，得到大枣多糖与香菇多糖在DPPH清除实验和OH清除实验中均有较好的协同抗氧化作用，且高于三七皂苷对香菇多糖的抗氧化协同增效作用。而大豆多肽仅在还原能力上对香菇多糖增效，在OH和DPPH清除实验中对香菇多糖有抗氧化拮抗作用或无清除能力，推测可能是大豆多肽的加入反而稀释了香菇多糖的浓度，减弱了其清除自由基能力。由筛选实验得到大枣多糖为三者中对香菇多糖抗氧化的最佳增效剂。3.3 最佳增效剂与香菇多糖抗氧化配比实验3.3.1不同配比复合物还原能力的测定还原能力测定结果如图7所示。图7 香菇多糖和大枣多糖复配物的还原能力Fig. 7 Reducing powerof compounds of LNT and JDP 还原能力的大小与其吸光值成正比。如图可知，在大枣：香菇质量比为3:7时，出现吸光值的峰值，此时复合物的还原能力最大。随大枣、香菇的配比增大，复合物的吸光值先增加后逐渐减小。以香菇多糖为对照组，可看出混合物在配比为3:7和4:6时还原能力高于香菇对照组。说明此时大枣搭配香菇可明显提高香菇多糖的还原能力。3.3.2不同配比复合物清除DPPH能力测定 不同配比的香菇与大枣多糖混合物清除DPPH能力见图8所示。图8 香菇多糖和大枣多糖复配物清除DPPH的能力Fig. 8 Ability of scavenging DPPH of compounding LNT and JDP 如图8可知DPPH清除率的峰值在3:7处，清除率为84.4%，其清除率按照两者配比中香菇多糖占有量的减少，呈先升后降的趋势，并且配比后每组的清除率都比香菇多糖对照组高，说明大枣多糖作为增效剂明显提高香菇多糖清除DPPH的能力。3.3.3不同配比复合物清除羟自由基能力测定 不同配比的香菇与大枣多糖混合物清除羟自由基能力见图9所示。图9 香菇多糖和大枣多糖复配物清除羟自由基能力Fig. 9 Ability of scavenging OH of LNT and JDP compounds 如图9可知，在大枣：香菇质量比为3:7时，羟自由基清除率最高55.5%，测定的数值具有波动性没有明显的趋势，但还是能发现大枣多糖可以在一定程度上提高香菇多糖的清除羟自由基的效果。 综合以上三种抗氧化指标的测定，可知在还原能力，DPPH清除能力和OH清除能力实验中，大枣：香菇多糖质量比=3: 7时比其他组均具有较好的抗氧化能力。4结论 本研究表明，四种提取物皆具有一定的抗氧化能力。其中香菇多糖，三七皂苷粗提物和大枣多糖皆具有较高的还原力和清除DPPH和OH的能力，而大豆多肽还原能力和DPPH清除的能力较差，用量多，且没有清除羟自由基的能力。在增效实验中，大枣多糖的增效效果比较明显，尤其是在DPPH和OH清除能力上，在还原能力上增效结果显著但效果不如大豆多肽。综合考虑，大枣多糖是三种物质中对香菇多糖的最佳抗氧化增效物质，且增效显著。在后期进一步的配比实验验证中得到最佳抗氧化质量配比为大枣：香菇多糖=3: 7。致谢 本论文是在王凤舞副教授的悉心指导下完成的。从论文的立题、设计、实施、修改到定稿等方面，都凝聚着老师和同学的心血。该毕业论文隶属于第六届创新立项成果的一部分，在长达一年的实验及形成成果发表论文的过程中，王老师陪着我们小组，陪着我一起成长，让我学到了很多。王老师渊博的学识、踏实严谨的治学态度、宽以待人的儒雅风范、诲人不倦的热情和崇高的敬业精神永远是我学习的楷模和奋发向上的动力。特别是实验探索中出现的一个个未知问题都在王老师的耐心指导下得以解决。我们也在其中得以发挥自己的主观能动性，科研能力得到大大提升。 在实验及论文的完成中，感谢实验室的秦云师姐、郭芳言师姐、王玉荣师姐、谢丽蒙师姐、贾晨师姐和张丛丛师姐提供的无私的的帮助和指导，给我的关心和支持，谢谢你们！特别是秦云师姐对我的实验的帮助和带领，对我的关心，非常感谢！ 同时，感谢我的家人。他们在我求学路上给我很大的支持和鼓励，创造一切条件使我安心实验，学习，完成学业。 最后感谢青岛农业大学，感谢食品科学与工程学院，感谢每一位老师对我的辛勤教导，感谢每一位同学、朋友对我的真诚帮助。我将用这份人生中最宝贵的经历和财富去创造更加美好的明天！参考文献1 付海田, 徐静静, 邓超, 胡明华, 徐晓飞, 陈敬华. 一种真菌复合多糖提取及体外抗氧化活性的研究J. 食品与生物技术学报, 2013, 03:313-317.2 周利亘, 王君虹, 陈新峰, 王春辉, 陈坚, 袁亚, 谢磊.