Connexin_43-膜...途径参与房颤发生的机制研究_王婷.pdf

基金项目:陕西省人民医院拔尖人才项目(2021BJ 03)作者简介:王婷，女，1990 04 生，在读硕士，主治医师，E-mail:874029140 qq com收稿日期:2022 11 09Connexin 43 膜纳米管 Ca2+信号途径参与房颤发生的机制研究王婷1，刘洁2，胡苏3，赵娜1，王军奎1，李博涛1*(1西安医学院附属陕西省人民医院心内一科，西安710068;2蒲城县医院心内科;3西安医学院第二附属医院心内科;*通讯作者，E-mail:1842954208 qq com)摘要:目的探讨膜纳米管(membrane nanotubes，MNTs)参与心房颤动(atrial fibrillation，AF)发生的作用机制。方法8 周龄雄性 SD 大鼠随机分为电刺激组和假手术组，每组 10 只。电刺激组经食道高频心房起搏进行电刺激诱导建立大鼠 AF 模型，假手术组不予心房起搏电刺激。分离两组大鼠心房肌细胞建立细胞水平电刺激组与假手术组，在此基础上，给予电刺激组心房肌细胞 MNTs 结构抑制剂 Cyto D 建立细胞水平电刺激+Cyto D 组。利用免疫荧光染色评估心房肌细胞之间的 MNTs变化;应用细胞内钙离子(calcium ion，Ca2+)荧光钙探针标记心肌细胞中 Ca2+，随后利用流式细胞术检测荧光探针标记的Ca2+变化;采用蛋白免疫印迹法检测缝隙连接蛋白 43(Connexin 43)的蛋白水平表达。结果应用经食道高频心房起搏电刺激成功建立大鼠 AF 模型。与假手术组相比，电刺激组心房肌细胞之间 MNTs 连接增多增粗，钙信号显著增强(P 0 01)。与电刺激组相比，电刺激+Cyto D 组 MNTs 减少变细，钙信号显著减低(P 0 05)，Connexin 43 蛋白表达水平显著下调(P 0 01)。结论Connexin 43 参与 MNTs 诱发钙信号增加触发晚后除极诱发 AF 发生。关键词:房颤;膜纳米管;钙离子;缝隙连接蛋白 43;大鼠;电刺激中图分类号:54175文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0454 05DOI:1013753/j issn1007 66112023 04 007Mechanism of Connexin 43-membrane nanotubes-Ca2+signaling pathway involving in atrial fibrillationWANG Ting1，LIU Jie2，HU Su3，ZHAO Na1，WANG Junkui1，LI Botao1*(1First Department of Cardiology，Shaanxi ProvincialPeople s Hospital Affiliated to Xi an Medical University，Xi an 710068，China;2Department of Cardiology，Pucheng County Hospital;3Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital of Xi an Medical University;*Corresponding author，E-mail:1842954208 qq com)Abstract:ObjectiveTo explore the action mechanism of membrane nanotubes(MNTs)involved in atrial fibrillation(AF)MethodsEight-week-old male SD rats were randomly divided into electric stimulation group and sham operation group，with 10 rats in eachgroup The AF model of rats was established through high frequency atrial pacing of esophagus in electric stimulation group，while therats in sham operation group were not stimulated by atrial pacing Atrial myocytes were isolated from the rats in two groups，respectively，namely electrical stimulation group and sham-operation group，and the atrial myocytes after electrical stimulation were treated with CytoD(MNTs structural inhibitor)in electrostimulation+Cyto D group Changes of MNTs between atrial myocytes were evaluated by immu-nofluorescence staining Intracellular calcium ion(Ca2+)fluorescent calcium probes were used to label Ca2+in cardiomyopathy，andflow cytometry was utilized to detect Ca2+changes The protein level of Connexin 43 was observed by Western blotesultsThe ratmodel of AF was successfully established by high frequency atrial pacing Compared with sham operation group，MNTs connectionbetween atrial myocytes in electrical stimulation group was increased and became thicker，and the calcium signal was significantlyenhanced(P001)Compared with electrical stimulation group，the MNTs were decreased and became thinner in electrostimulation+Cyto D group，the calcium signal was significantly decreased(P0 05)，and the expression level of Connexin 43 protein was signifi-cantly down-regulated(P 0 01)ConclusionConnexin 43 is involved in AF induced by MNTs-induced calcium signal increasetriggering late afterdepolarizationKey words:atrial fibrillation;membrane nanotubes;Ca2+;Connexin 43;rats;electric stimulation心房颤动(atrial fibrillation，AF)简称“房颤”，是临床上最常见的心律失常，据全球疾病负担(globalburden of disease，GBD)数据库统计，截止 2017 年，全球约有3 760万人口罹患 AF，AF 导致的危害主要包括脑卒中、心力衰竭及体循环栓塞，伴随致残及致死风险增高1。迄今为止，关于 AF 发生的机制研究尚未完全明了。心房异位局灶兴奋触发电活动是 AF 发生的重要机制之一2。触发活动包括两种类型:早后除极(early afterdepolarization，EAD)及晚后除极(delayedafterdepolarization，DAD)。触发活动发生于动作电位时程(action potential duration，APD)结束之后，即动作电位(action potential，AP)静息 4 相时，肌浆网释放钙离子(calciumion，Ca2+)增加，钠钙交换体454J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4(Na-Ca exchanger，NCX)将细胞外 Na+泵入细胞内，将细胞内 Ca2+泵出细胞外，产生瞬时内向除极电流(transient inward current，Iti)，即形成 DAD，DAD 诱发的心肌细胞电活动参与 AF 的发生已被证实3，4。膜纳米管(membrane nanotubes，MNTs)是一种直径 50 200 nm、延续于 2 个完整细胞膜、连接 2个细胞之间的生物学结构，与细胞膜结构一致，包含脂质双分子层和肌动蛋白5。MNTs 具备运输如Ca2+、内质网、线粒体、溶酶体等各种信号分子及各种细胞器的生物学作用6，7。目前没有相关 MNTs参与 AF 发生机制的具体研究，因此，本研究通过利用免疫荧光染色评估心房肌细胞之间的 MNTs 变化来探讨心房肌细胞 MNTs 是否参与 AF 的发生，进一步探究其在 AF 发生中具体的调控机制。1材料与方法1 1AF 大鼠模型制作及实验对照处理将20 只8 周龄雄性 SD 大鼠(SPF 级，西安交通大学动物实验中心，体质量(180 83 6 32)g，随机分为电刺激组和假手术组，每组 10 只。采用经食道高频电刺激快速心房起搏诱导大鼠 AF 发作建立AF 大鼠模型8，9，设为电刺激组。实验过程中，AF大鼠采用戊巴比妥(50 mg/kg，腹腔内注射)进行麻醉;取仰卧位固定，四肢皮下描记大鼠标准导联心电图记录;备皮，沿正中线切开皮肤，暴露气管，利用自制气管插管行气管插管术维持大鼠呼吸，同时连接小动物呼吸机辅助呼吸;经大鼠口腔插入至心房后方食道内起搏电极(苏州电子仪器厂，规格:头端2 个直径 2 mm 的环状电极，电极间隔 2 mm)，深度约为 7 cm，保持起搏电极前端自然弯曲紧贴左心房，根据心房心电图捕获情况适时调整电极深度，电极尾端连接生理药理电子刺激仪，经高频电刺激实现食道快速心房起搏诱发大鼠 AF 发作。刺激参数具体如下:刺激波形为方形波，连续波输出;脉冲宽度6 ms，间隙 20 ms;刺激频率约 1 200 次/min;电压20 V，电流2 mA;刺激时间:第1 天，30 s/次，间隔 5 min，每天行 1 组刺激(每组 5 次)，间隔 4 d行第 2 组刺激;大鼠 AF 稳定发作 7 d 以上。假手术组除不进行心房起搏电刺激外，其余步骤同电刺激组。大鼠 AF 稳定发作，判读 AF 发作时心电图标准为:正常心房 P 波消失，f 波出现，中间无等电位线。1 2大鼠心房肌细胞分离深度麻醉，开胸取出电刺激组及假手术组大鼠心脏，参考既往文献分离大鼠心房肌细胞10:分离大鼠心房肌组织，弃去其他组织，生理盐水洗净后置于 4 D-Hanks 平衡盐溶液中反复冲洗 3 次;将心房肌组织用眼科剪剪成 1 mm3大小组织块，置入胰蛋白酶溶液，37 水浴 8 min，弃去上层混悬液;胶原酶溶液(015 ml，质量分数1%)37 水浴并搅拌 35 min，吸取上层混悬液，置于预冷 10%达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco s minimumessential medium，DMEM)中终止反应;所得沉淀物加入胶原酶溶液(0 15 ml，质量分数 1%)37 水浴并搅拌 35 min，吸取全部液体，终止反应;所得混悬液用 300 目滤网滤过除去未消化组织，室温下800 r/min 离心3 5 min，弃去上清液，于沉淀中加入培养液2 ml 混匀，所得心房肌细胞留待备用。1 3免疫荧光染色评估心房肌细胞间的 MNTs 结构在培养板中的心房肌细胞玻片用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗 3 次，每次3 min;用 4%的多聚甲醛固定玻片 15 min，PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min;每张玻片滴加足够量的稀释好的麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)染色液并放入湿盒，37 孵育 60 min;孵育完成然后用含吐温20 的磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffer solution tween20，PBST)浸洗玻片 3 次，每次3 min;复染核:滴加 4，6 二脒基 2 苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避 光 孵 育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min 4 次洗去多余的 DAPI;用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，应用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FV1000)获取图像，利用免疫荧光染色评估心房肌细胞之间的 MNTs 结构。1 4流式细胞仪检测心肌细胞中 Ca2+将取出的各组大鼠心房肌分离后剪碎，使用025%胰酶消化2 h，过筛网，PBS 重悬制备心房肌组织单细胞悬液。加入 Fluo 4-Am 至终浓度为 5 mol/L，置 37、5%CO2培养箱，避光孵育 30 min;无钙PBS 洗涤2 次;无钙 PBS 重悬至500 l;流式细胞仪上机检测，应用细胞内钙离子荧光钙探针标记心肌细胞中 Ca2+。1 5MNTs 结构抑制剂 Cyto D 对心肌细胞中 Ca2+及 Connexin 43 的影响将成功分离心房肌细胞后的电刺激组心房肌细胞给予 MNTs 结构抑制剂 Cyto D 设为电刺激+CytoD 组，对其进行自身前后对照，观察电刺激+Cyto D组与电刺激组间纳米管结构、流式细胞图片及 Con-nexin 43 表达水平。554山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期1 6蛋白免疫印迹法检测缝隙连接蛋白 43(Con-nexin 43)蛋白水平表达应用放射免疫沉淀法缓冲液(radioimmuno-precipitation assay，IPA)，添加苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)1 mmol/L 提取组织或细胞总蛋白;蛋白浓度定量采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量法;样品应用 100 g/L 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)分离，转移至硝酸纤维素膜，在 50 g/L 脱脂牛奶中封闭1 h，应用抗 Connexin 43(1 500，0651，上海，中国)抗体孵育，4 过夜;洗膜后，室温下，采用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 1 h。采用化学发光法使条带显影，显影图像利用吸光度法定量。1 7统计学分析实验数据均采用 SPSS 16 0 进行统计学分析，计数资料以均数 标准差表示，根据情况选 Student-t或单因素方差分析并 Bonferroni 后检验。P 0 05为差异具有统计学意义。2结果2 1AF 大鼠模型的成功建立成功建立经食道高频心房起搏进行电刺激的大鼠 AF 模型(电刺激组)及假手术模型，假手术组大鼠均为窦性心律心电图，电刺激组均出现典型 AF心电图:P 波消失，出现 f 波，间期不等(见图1);成功分离大鼠心房肌细胞，1 000 倍显微镜下观察可见假手术组呈圆形，无横纹，电刺激组呈杆状，横纹清晰，菱角分明(见图 1)。A SD 大鼠心电图表现及心电图检查示意图B 假手术组和电刺激组成功分离的心房肌细胞图 1建立 AF 大鼠模型并分离大鼠心房肌细胞Figure 1Establishment of AF rat model and isolation of atrial myocytes in rats2 2AF 大鼠心房肌细胞 MNTs 丰富增粗伴钙信号增强与假手术组相比，电刺激组大鼠心房肌细胞中MNTs 管增多增粗;与假手术组相比，电刺激组大鼠心房肌细胞钙信号增强，差异具有统计学意义(P 0 01，见图 2，3)。2 3MNTs 通过 Connexin 43 参与 AF 模型中钙信号诱发与电刺激组相比，电刺激+Cyto D 组中 MNTs显著减少变细(见图 4A)。与电刺激组相比，电刺激+Cyto D 组钙信号减低(P 0 05，见图 4B)。与电刺激组相比，电刺激+Cyto D 组 Connexin 43 表达下调(P 0 01，见图 4C)。图 2AF 大鼠心房肌细胞 MNTs(白色箭头)(免疫荧光染色，1 000)Figure 2MNTs(white arrows)in atrial myocytes of AF rats(immunofluorescence staining，1 000)654J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4图 3AF 大鼠心房肌细胞 Ca2+流式细胞单参数直方图及 Ca2+信号强度Figure 3Flow cytometry results and signal intensity of Ca2+in atrial myocytes of AF ratsC 蛋白免疫印迹法检测 Connexin 43 蛋白表达与电刺激组相比，*P0 05，P0 01图 4MNTs 结构抑制剂 Cyto D 对 Connexin 43 表达及钙信号强度的影响Figure 4Effect of MNTs structural inhibitor Cyto D on Connexin 43 expression and calcium signal intensity754山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期3讨论AF 具有高致死率及致残率，为社会带来高昂的医疗成本及经济负担11。Ca2+参与 DAD 诱发的肺静脉异位电活动是目前公认的 AF 发生重要机制之一3，4，但其参与诱发的具体机制尚未完全清楚。MNTs 是一种连接两个距离较远细胞的线状膜性管道，能够介导多种成分和信号的传输 12，已有研究表明 MNTs 存在于成鼠及乳大鼠心肌细胞中，参与心肌细胞细胞器及信号转运 13。本研究中通过食道高频电刺激建立大鼠 AF 模型设为电刺激组并设立假手术组为对照，结果提示:大鼠 AF 模型及对照模型成功构建，与假手术组比较，电刺激组大鼠心电图检测呈典型 AF 节律，心房肌细胞呈杆状，横纹清晰，菱角分明;实验发现 AF 大鼠心房肌细胞 MNTs 增多、增粗，钙信号增强，进一步给予 AF 大鼠心房肌细胞 MNTs 结构抑制剂 Cyto D 后，AF 大鼠心房肌细胞钙信号减低。结合既往研究表明 MNTs 能在细胞间运输重要的信号分子 Ca2+14，且参与细胞间电信号的传递 15。本研究进一步验证了 MNTs 存在于心房肌细胞间，同时Ca2+的转运依赖于 MNTs，并参与了 AF 的发生机制。Connexin 43 是连接蛋白家族的一员，是心房表达的主要连接蛋白之一，在维持心房肌细胞正常节律、电信号通信和传递中起着重要作用16。既往研究表明，Connexin 43 具有降低 AF 发生的易感性，它的下调介导了 AF 的发生与维持17，18。本研究在AF大鼠心房肌细胞中给予MNTs结构抑制剂Cyto D后，AF 大鼠心房肌细胞钙信号减低，同时我们发现上述过程中伴随 Connexin 43 表达的下调。因此，我们提出 Connexin 43 参与 MNTs 转运钙信号过程。综上所述，本研究提出 Connexin 43 参与 MNTs诱发钙信号增加触发晚后除极诱发 AF 发生的可能机制(见图 5)。未来将进一步明确 MNTs 是否系Connexin 43的直接调控靶蛋白，并致力于进一步探图 5Ca2+通过 MNTs 传递后诱发心房肌细胞 DAD 触发AF 的模式图Figure 5Ideogram of atrial fibrillation triggered by late de-polarization of atrial myocytes induced by calciumion transfer through membrane nanotubes究 MNTs 参与诱发 AF 的其他相关上下游信号通路，为揭示 AF 发生的病理生理机制及药物防治提供新的理论线索。参考文献:1黄从新，张澍，黄德嘉，等 心房颤动:目前的认识和治疗的建议 2018J 中国心脏起搏与心电生理杂志，2018，32(4):315 368 2Andrade J，Khairy P，Dobrev D，et al The clinical profile andpathophysiology of atrial fibrillation:relationships among clinicalfeatures，epidemiology，and mechanismsJ Circ es，2014，114(9):1453 1468 3Bgeholz N，Pauls P，Kaese S，et al Triggered activity 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