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猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究
摘要
猕猴桃叶介绍
试验内容
关键词

目录
第一章 文件综述
1.1 猕猴桃叶
1.1.1
1.1.2 中国外研究现实状况
1.2黄酮类化合物概述
1.2.1
1.3 黄酮类物质提取工艺研究进展
1.3.1
1.4 本文选题依据
第二章 试验部分
2.1 材料和试剂、仪器
2.1.1 材料
2.1.2 试剂和仪器
2.2 方法和步骤
2.2.1 猕猴桃叶中黄酮物质含量测定方法建立
2.2.2猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究
第三章 结果和分析
3.1 芦丁标准曲线制作结果
3.2 猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究
3.2.1 最好提取工艺确实定
3.2.2 最好工艺条件确实定
3.2.3 猕猴桃叶中黄酮物质粗品中总黄酮得率
第四章 讨论
4.1 猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺
4.2 提取工艺条件
第五章 结论
参考文件
致谢

第一章 文件综述
1.1
1.2 黄酮类化合物概述
黄酮类化合物（flavonoids）是指以2-苯基色原酮为基础结构衍生出来一系列化合物。在自然界中分布比较广泛，高等植物及羊齿类植物比较多，有些苔类中也有，在和我们日常生活亲密粮食、蔬菜和水果中含量也很大。
天然黄酮类化合物大多数和糖结合成苷，以苷形式存在，也有些以游离体（苷元）形式存在。其2-苯基色原酮母体结构上通常含有部分助色团：酚羟基、甲基、异戊烯基、甲氧基等，因为这些官能团存在，黄酮类化合物通常展现不一样颜色，一定条件下，黄酮类物质能够和特定试剂发生颜色反应（和酚羟基和γ-吡喃酮环相关系）。
依据黄酮类化合物结构特点，能够分为以下多个：黄酮类（flavone）和黄酮醇类（flavonol），异黄酮类（isoflavone）和二氢异黄酮类（dihydroisoflavone），二氢黄酮类（dihydroflavone）和二氢黄酮醇类（dihydroflavol），查尔酮类（chalcone）、橙酮类（aurones）、黄烷类（flavanes）、花色素类（anthocyanidins）等（姚新生：168）
黄酮类化合物含有酸性和碱性：γ-吡喃酮环上氧原子能和强无机酸结合，生成性质不稳定盐而展现弱碱性，因为酚羟基存在能够溶于碱性溶液展现酸性（姚新生：175）.
黄酮类化合物含有解肝毒、抗氧化，抗肿瘤（Stein CJ and Colditz GA ）、抗炎、抗菌及抗病毒等多个生理活性。
1.2.1 黄酮类化合物提取方法
（1）水提法
适适用于黄酮苷类物质提取。优点是：成本低、安全、设备简单，适适用于工业化大生产。缺点：提取率低，杂质较多（蛋白质、无机盐和糖类），后续分离麻烦，且易霉变，通常情况下不单一使用。
（2）碱性水或碱性烯醇提取法
黄酮类成份大多含有酚羟基，易溶于碱水（碳酸钠、石灰水、氢氧化钠）或碱性烯醇（50%乙醇），酸化后可沉淀析出。作用原理是碱性条件下，其苯基色原酮1，2碳之间碳氧键打开变成查耳酮性结构，这种结构能够溶于水，酸性条件下，查耳酮又会恢复为闭环状态。碱溶酸沉法在实际生产中用得比较广泛。石灰水浸出效果不如氢氧化钠水溶液，且有些黄酮类物质能和钙结合成不溶性物质不被溶出（李苑和张敏1999）。
此法提取纯化时应注意：避免使用强碱（以免强碱在加热是破坏黄酮）、强酸（预防酸化时生成盐影响提取率）。
（3）有机溶剂提取法
常见溶剂有乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮及部分极性较大混合溶剂（如甲醇：水=1：1）。
乙醇提取时常见方法之一，因为乙醇溶解性能比很好，通常水溶液大多数全部能在乙醇中溶解。毒性小，价廉，能够回收反复使用，醇提取不易霉变。
通常见90%-95%乙醇提取苷元，60%左右乙醇提取苷类。石油醚、乙酸乙酯等提取黄酮苷元部分。
常见提取方法有：冷浸法、渗漉法和回流法。这三种提取方法各有优缺点：冷浸法提取时间长、效率低，通常见于提取热敏性成份：渗漉法提取效率高杂质较少，不过费时长、溶剂用量大；回流效率最高，但杂质含量相对较高，含有受热易被破坏成份药材不适用。
（4）超声提取法
超声波提取技术是利用超声波空化效应加速有效成份浸出，能效低，效率高，不破坏有效成份。空化效应、热效应和机械作用是超声技术在中药提取中三大理论依据（王昌利等1993）。
（5）微波辅助萃取法（microwave assisted extraction,MAE）
微波辅助萃取是利用物质吸收微波能力差异，选择性加热，从而是被提取物质分离进入提取剂中（王艳和张铁军 ）。而且微波产生电磁场能够加速被萃取成份向萃取溶液界面扩散，使有效成份在相对较低温度下以最快速度被萃取，从而最大程度确保萃取质量。选择性高、易控制、得率高、无污染（李巧玲 ）。
（6）酶解法
传统溶剂提取法是利用提取溶剂中有效成份浓度梯度，经过扩散作用促进被提取成份逐步分散到提取试剂中达成分离目标。不过因为植物细胞壁中纤维组织阻碍，往往提取时间长，溶剂用量大，效率大。近几年，研究者利用纤维素酶、果胶酶等分解细胞壁及细胞间纤维素和果胶，迫使细胞壁软化甚至瓦解，从而改变细胞壁通透性，降低有效成份溶出阻力，提升提取率，降低提取成本。
（7）双水相萃取分离法
双水相萃取是依据物质在两相间选择性分配，提取有效成份。在双水相体系中，因为表面性质、电荷作用和多种力（氢键和离子键等）存在，物质在两相间中浓度不一样。针对被分离物质，研究者选择适宜体系，控制合适条件就能够达成分离目标（徐长波和王巍杰 ）。和传统溶剂法相比较，提取过程中不使用有毒、易燃有机溶剂，生产环境安全，也降低了有效成份变性几率。这种方法在蛋白质分类提取中使用比较多，黄酮类物质分离纯化中使用相对较少。
（8）超临界流体萃取技术（SFE）
SFE是经过超临界流体溶解能力和密度（和液体相近）关系进行提取。超临界性质特殊，其渗透性和溶解能力很好。经过调整提取温度和压力能够控制其溶解力，进行有效性溶解，然后改变提取压力和温度，取得目标提取物（葛云初和黎阳 ）。
最常见超临界流体为CO₂，CO₂性质稳定，无毒，廉价易得，临界压力不高。因为CO₂是非极性，所以依据相同相容原理对极性较大物质溶解能了肯定不够，所以实际操作中通常加入另外物质来改变CO₂极性，提升溶解能力。
CO₂-SPE技术提取分离黄酮类化合物和传统方法比较，最大优点是产品中没有残留有机溶剂。
（9）其它
大孔吸附树脂在中药提取中应用也较多，是传统中药制剂质量控制和现代化有效手段，改善了中国传统中药药丸“黑、大、粗”外观形象，操作简单，污染小。
另外，还有半仿生提取和膜提取等方法。
1.4 本文选题依据
中华猕猴桃是中国特有藤本果种，属于猕猴桃科猕猴桃属，陕西省西安市周至县和毗邻宝鸡市眉县盛产猕猴桃。中华猕猴桃果实营养丰富，被誉为维C之王，另外还有显著药效作用，其枝、叶、根、藤全部是很好中药材。伴随消费水平提升，大家越来越重视提升生活质量，保健食品日益受到大家关注。在众多天然活性成份中黄酮类化合物是极有应用潜力资源之一。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中取得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，所以多年来各国科学家全部主动关注从植物体中提取纯度高、活性强天然黄酮成份，并深入加工成含有抗癌、抗衰老、调整内分泌等特异功效保健食品。
现在对猕猴桃果实和根全部有较深研究，然而却鲜有对猕猴桃叶化学活性成份研究。长久以来，猕猴桃叶只是被直接用作田间肥料，动物饲料或直接焚烧。为了充足利用每十二个月产生大量猕猴桃叶，同时避免由此而造成环境污染，本项目将经过对中华猕猴桃叶中化学成份初步分析，研究中华猕猴桃叶中黄酮类物质提取工艺，以期为猕猴桃叶深入开发利用提供方法参考，对猕猴桃叶资源综合利用和医疗保健有主动作用。
第二章 试验部分
2.1 材料和试剂、仪器
2.1.1 材料
2.1.1.1 猕猴桃叶
年10月采自杨凌北边猕猴桃园，为绿色并伴有微黄。将其用清水漂洗，除去材料中泥沙，木枝等杂质。洗净后阴干，粉碎备用。
2.1.1.2 大孔树脂（D-101）
将大孔吸附树脂先用蒸馏水搅拌清除杂质，将蒸馏水濞出，加酒精（6：4）搅拌浸泡48h。
2.1.2 仪器和试剂
Xxx型紫外可见分光光度计（xxx分析仪器总厂）；xxx型电子天平（xx光学仪器厂）；离心机；全部试剂全部是国产分析纯。
2.2 方法和步骤
2.2.1．用大孔吸附树脂吸附洗脱黄酮
1将活化大孔树脂进行装柱，离柱上端留10cm空柱。
2 装好柱后，将离心得到澄清液加入柱中（树脂颗粒是棕色），加完后，流出黄色溶液可作50%乙醇液洗涤时用（约80ml），使之充足吸附
3．分别用蒸馏水，10%乙醇溶液，20%乙醇溶液，30%，40%，50%，60%，70%乙醇溶液
各200ml洗脱树脂柱，前三组洗出液为浅黄色。
搜集后5组流脱液，从第4组开始，洗脱液变深黄发微红色，洗至70%乙醇液时，洗脱液基础只略带黄色，用完70%乙醇液停止洗涤。
搜集洗脱液约950ml，共用时6.5h
2.2.2浓缩洗脱液
1.浓缩洗脱液 在60℃下，用旋转薄膜蒸发仪浓缩洗脱液
950ml浓缩至约15ml
浓缩液为褐红色，冷却后有混浊，共用时4.5h
2.将浓缩液放入玻璃皿中干燥
玻璃皿洗净干燥1h，称量m0=35.157g
浓缩液干燥后+玻璃皿 m1=36.0180g
得m=0.8608g
产率η1=0.8608/（10.04+10.05）×100%=4.2826%
工艺评价
1． 试验提取时间长，提取充足。
2． 提取所包含方法步骤简单，易操作。
3． 分离所用树脂不易选择，需做独立试验专门选择合适大孔树脂。
4． 分离效果不好，产物（干燥）泛红，嗅有微甜，含有糖类物质。
2.2.3猕猴桃叶中总黄酮提取工艺（二）
酮类萃取法
1. 稀丙酮提取。用7.5倍切碎洁净液重60%丙酮，在58℃下回流浸渍二次，每次30min，合并2次滤液，减压回收丙酮至固形物为30%~40%，丙酮含量＜5%，向其中加入2倍水稀释，搅拌，冷却（12℃）。
2. 丁酮：丙酮（6:4）萃取
上清液加入（NH4）2SO4，再加丁酮：丙酮混合试剂萃取2次，合并萃取液，分离水相和有机相（Ⅰ）
3. 丁醇，环己烷萃取
上述水相加水稀释，再加丁酮萃取，得有机相（Ⅱ），弃去水相。
有机相（Ⅰ）加压浓缩，回收溶剂至固形物为50%~70%，加水稀释至固形物为10%，再用丁醇萃取，弃去水相，得有机相（Ⅲ）。
合并有机相（Ⅱ，Ⅲ），减压浓缩，再用水和乙醇（95%）稀释至乙醇含量为50%，固形物10%，以环己烷萃取，弃去环己烷相，水相减压浓缩，60~80℃下干燥。
4.稀丙酮提取
1.称取猕猴桃叶10.26g，10.34g两组，分装两个烧瓶中。
2.量取60%丙酮80ml，在58℃下回流浸提2次，
每次半小时，合并两次滤液（绿色）
3对两次液体减压浓缩，出现固形物质。
4对浓缩后溶液加水稀释，搅拌，在12水浴锅中静置1h，离心（4000r/min）半小时，取上清液。
丁酮：丙酮萃取
1. 取上清液于烧杯中，加入足量（NH4）2SO4，使溶液达成饱和。
2. 转入分液漏斗中，加入丁酮：丙酮（6:4）混合溶剂萃取2次。分液漏斗内，上层为红色有机相（Ⅰ），下层为黄色水相。
3. 将上述水相和有机相分离，水相加水稀释，加正丁酮萃取，得有机相（Ⅱ），上述有机相（Ⅰ）减压浓缩至固形物为50%左右，加五倍量蒸馏水稀释，再用丁醇萃取，得有机相（Ⅲ）。
4. 合并有机相（Ⅱ，Ⅲ），减压浓缩，用水和乙醇（95%，1:1配比）溶液，稀释浓缩液是固形物约为10%，以环己烷萃取，上层为乳白色混浊，下层为黄色澄清液，取水相减压浓缩，60℃干燥得黄色产物。
玻璃皿重：34.2861g
玻璃皿+产物：34.5556g
产物：η=0.2695/（10.26+10.34）×100%=1.308%