4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响_岑小凤.pdf

2023，45（2）DOI：10.13836/j.jjau.2023040江西农业大学学报 Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp:/4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响岑小凤，李晶晶*（广西卫健委全生命周期健康与保健研究重点实验室/广西环境暴露组学与全生命周期健康重点实验室/桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林 541199）摘要：【目的】寻找防治福寿螺的天然杀螺剂并初步探寻其作用机制。【方法】以福寿螺死亡率，肝功能和头足运动能力相关酶活性为综合评价指标测定槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸4种天然产物对福寿螺的毒杀活性，并在此基础上优选出活性最佳的化合物进行RT-qPCR结果验证。【结果】槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸对福寿螺24 h的校正死亡率分别为45.0%、27.3%、23.5%和12.0%；与空白组相比，福寿螺肝脏中的ALT/GPT酶活性分别降低了 72.9%、58.9%、66.8%和 66.5%，肝脏中 AST/GOT 酶活性分别升高 115.5%、103.8%、70.5%和88.2%；福寿螺头足中 AChE 活性分别下降 43.9%、29.6%、24.8%和 42.2%，NOS 活性分别下降 55.9%、38.8%、37.9%和30.2%。研究发现，槲皮素的杀螺效果最好，并进一步对其进行RT-qPCR测定。在槲皮素胁迫下，福寿螺肝脏中SOD和CAT的mRNA表达量以及头足中SOD的mRNA表达量显著升高，肝脏中IDH的mRNA表达量和头足中TM的mRNA表达量显著下降（P0.05）。【结论】槲皮素通过影响福寿螺肝脏和头足的正常生理功能发挥杀螺效果，具有作为植物源杀螺剂先导化合物开发的潜力。关键词：福寿螺；天然产物；肝脏；头足；酶活性中图分类号：S482.3+9 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1000-2286（2023）02-0413-09Effects of Four Natural Products on Enzyme Activity in Liver and Head-foot of Pomacea canaliculataCEN Xiaofeng，LI Jingjing*（Guangxi Health Commission Key Laboratoryof Entire Lifecycle Health and Care/Guangxi Key Laboratory of Enviromental Exposomics and Entire Lifecycle Health/College of Public Health，Guilin Medical University，Guilin 541199，China）Abstract：Objective This study aims to search new natural molluscicide and explore their mechanism.Method The molluscicidal effect of quercetin，luteoloside，apigenin and vanillic acid against Pomacea canaliculata 收稿日期：20220723 修回日期：20220923基金项目：国家自然科学基金项目（31760530）和广西自然科学基金项目（2016GXNSFAA380031）Project supported by the National Natural Science Foundation of China（31760530）and Natural Science Foundation of Guangxi Province（2016GXNSFAA380031）作者简介：岑小凤，硕士生，orcid.org/0000-0002-7903-3125，；*通信作者：李晶晶，副教授，博士，主要从事植物化学及其生物学效应研究，orcid.org/0000-0001-5872-5766，。岑小凤，李晶晶.4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响 J.江西农业大学学报，2023，45（2）：413-421.CEN X F,LI J J.Effects of four natural products on enzyme activity in liver and head-foot of Pomacea canaliculataJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(2):413-421.江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷were determined by the comprehensive evaluation index including the mortality of Pomacea canaliculata，liver function and enzyme activity related to head and foot motor ability.The compound with the best activity was further verified byreal-time quantitative PCR（RT-qPCR）.Result The results showed that the corrected mortality rates of quercetin，luteoloside，apigenin and vanillic acid against P.canaliculata were 45.0%，27.3%，23.5%and 12.0%after 24 h，respectively.The activities of ALT/GPT in liver decreased by 72.9%，58.9%，66.8%and 66.5%，respectively，the activities of AST/GOT in liver increased by 115.5%，103.8%，70.5%and 88.2%，respectively；the activity of AchE and NOS in head-foot decreased by 43.9%，29.6%，24.8%and 42.2%，respectively，and the activity of NOS in head-foot decreased by 55.9%，38.8%，37.9%and 30.2%，respectively.Since quercetin exhibited the best molluscicidal effect，quercetin was selected to verify the results by RT-qPCR.The results showed that quercetin significantly increased the mRNA expression of SOD and CAT in the liver，and SOD in the head-foot，while significantly inhibited the mRNA expression of IDH in the liver and the mRNA expression of TM in the head-foot（P0.05）.Conclusion Quercetin could disturb hepatocellular and head-foot normal physiological function of P.canaliculata，indicating that quercetin would be considered as a potential leading compound of plant origin for control P.canaliculata.Keywords：Pomacea canaliculata；natural products；liver；head-foot；enzyme activity【研究意义】福寿螺（Pomacea canaliculata）隶属于瓶螺科（Ampullariidae）福寿螺属，原产于南美洲亚马逊河流域，是世界性恶性入侵物种1。在2003年被我国国家环保总局将其列入首批入侵我国的16种外来物种的“黑名单”2。福寿螺取食容易，导致田间水稻幼苗死亡，并因其繁殖快、繁殖量大等特点给水稻等农作物种植和生态环境带来严重危害和影响3-4。除此之外，福寿螺还是人类广州管圆虫（Angiostrongylus cantonensis）自然感染或实验室感染的中间宿主，该线虫的幼虫能侵犯人体中枢神经系统，引发嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎5-6。关于福寿螺的防治方法主要有物理防治、化学防治以及生物防治法7，化学防治仍是主要的防治手段，但缺乏安全性好、杀螺效果佳的防螺药物。虽有较多的文献报道植物提取物对福寿螺的杀灭效果，但较少研究涉及其有效成分对福寿螺的杀螺活性和作用机制的研究8。【前人研究进展】目前，对植物源杀螺剂的作用机理研究主要集中在酶活性方面，包括能量代谢相关酶、转氨酶、神经信号传导酶、磷酸酶以及氧化应激相关酶9-15。近年来，蛋白组学和转录组学技术被用于研究福寿螺的抗药机制和免疫保护机制。牟希东等16利用iTRAQ蛋白质组技术发现，杀螺剂四聚乙醛会引起氨基酸、赖氨酸等代谢紊乱、破坏细胞结构组成和肌肉收缩，引起免疫应答，造成细胞凋亡和神经毒性。Yu等17通过蛋白组学分析表明，齐墩果酸的胁迫导致福寿螺肝脏葡萄糖代谢、能量合成和蛋白质合成的中断，并触发了一系列分子通路，其中包含许多参与免疫过程的关键蛋白。Xiong等18-20利用转录组学技术分析发现，脂多糖干预后福寿螺氧化反应和解毒作用相关基因表达的显著上调。槲皮素（quercetin）、木犀草苷（luteoloside）、芹菜素（apigenin）和香草酸（vanillic acid）均为多酚类化合物，在植物中含量丰富。国内外对这4种化合物的生物活性研究主要在抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗菌、抗炎和抗氧化等药理活性21-24。【本研究切入点】在前期研究25中笔者首次报道了白肉榕叶乙醇提取物对福寿螺的毒杀活性，以及牛耳枫叶甲醇提取物的抑菌活性和杀虫活性，并从上述两种提取物中分离鉴定出包括香草酸、芹菜素、槲皮素和木犀草素26-27在内的10余种化合物。然而，除槲皮素外，这些化合物对福寿螺的毒杀作用至今未见研究报道，其杀螺作用机理仍不清楚。【拟解决的关键问题】本研究旨在研究槲皮素、木犀草苷（木犀草素衍生物）、芹菜素和香草酸胁迫对福寿螺的存活率，福寿螺肝脏中谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST/GOT）活性，福寿螺头足中乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、一氧化氮合酶（nitric oxide sythase，NOS）活性的影响，并通过RT-qPCR技术测定福寿螺肝脏和头足中相关基因的表达量，初步探讨其作用机理，以期从中寻找具有开发潜力的植物源杀螺剂先导化合物。414第 2 期岑小凤等:4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响1 材料与方法1.1试验材料供试福寿螺：采自广西农业科学院桂北分院桂林市农业科学院。采集的福寿螺用自来水清洗干净其表面后，投放入到装有去氯水的容器中，于室温（252），湿度（60%5%）条件下饲养7 d后，选用螺壳表面无损伤、大小一致的福寿螺用于试验研究。试剂及仪器：芹菜素、香草酸、槲皮素和木犀草苷标准品，纯度均98%，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；茶皂素原粉（60%），中国农科院茶叶研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型），碧云天生物技术有限公司；ALT/GPT试剂盒、AST/GOT试剂盒、AChE试剂盒、NOS试剂盒购于南京建成生物工程中心；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）以及原肌球蛋白（tropomyosin，TM）引物，广州维伯鑫生物科技有限公司；Trizol Reagent，美国 ambion 公司；Thermo RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit、ABI PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix，美国Thermo Fisher Scientific公司；其余试剂为国产分析纯。101A-1E型电热恒温鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司；L600台式低速自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Varioskan LUX User Manual Chinese酶标仪、NanoDrop 2000、实时荧光定量PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，上海精科天美科学仪器有限公司。1.2方法1.2.14种天然产物溶液的配置分别准确称取一定量的槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸，用适量甲醇溶解后加入去氯水配制成100 mg/L的溶液（甲醇含量不超过2%），以相同含量的甲醇去氯水做空白对照。1.2.2福寿螺室内毒杀活性测定参照WHO室内药剂浸泡法28，选择口径大小相近的福寿螺，随机分为6组，分别为空白组、茶皂素组（对照药剂）、槲皮素组、木犀草苷组、芹菜素组和香草酸组。用烧杯盛放500 mL药液，每杯放入20头幼螺，放入菜叶作为其食物，杯口用纱布封口以防其逃逸。施药后24 h观察和记录福寿螺死亡情况。实验开始时首先挑选出已经明显开口死亡的福寿螺个体，对于一直都紧闭螺壳的福寿螺个体，可以选择洗去表面药物后放于清水中，浮上水面或者悬浮于水中30 min后，用镊子尖端轻轻插进厣甲与螺壳间隙无任何反应的则为死螺28。观察后及时记录福寿螺的死亡个数，并计算福寿螺的校正死亡率。死亡率=死螺数/供试总螺数100%（1）校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）100%（2）1.2.3福寿螺肝脏和头足酶活性的测定在药剂处理24 h后随机取6只活福寿螺，去壳后取出福寿螺的肝脏和头足部分，用滤纸吸干福寿螺组织表面的水分，存置于-80 储存备用。分别称取0.5 g福寿螺肝脏和头足组织，按福寿螺组织质量1 9的比例，加入0.9%的生理盐水，肝脏组织用微量电动匀浆器于4 匀浆，头足组织采用20 mL玻璃器研磨，将两者待测组织匀浆离心分离（4，3 500 r/min，15 min），然后取上清液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定福寿螺肝脏和头足中蛋白质浓度，参照试剂盒说明书分别测定福寿螺肝脏中的ALT/GPT、AST/GOT的酶活性，以及头足中AChE、NOS的酶活性。1.2.4福寿螺肝脏和头足中基因相对表达量的测定参照 Trizol 操作说明书提取福寿螺组织中的RNA，然后用NanoDrop 2000测定RNA的浓度和纯度，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，作为RT-qPCR模板。设计特异性引物，选择a-tubulin 作为内参基因，每个样品的内参及目的基因做3个复孔。RT-qPCR反应体系为：1 L cDNA模板，上下游引物各0.5 L（10 mol/L），SYBR Green Master Mix 12.5 L，dd水10.5 L，总体积25 L。PCR反应程序：50 初始变性2 min，95 变性2 min，95 15 s，60 15 s，72 1 min，共40个循环。相对定量采用2-Ct法，其中Ct（Ct目的基因，槲皮素组-Ct内参基因，槲皮素组）-（Ct目的基因，空白组-Ct内参基因，空白组）。415江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷1.3数据分析采用Excel 2010和SPSS 25.0进行数据处理和统计分析。计量资料使用“平均数标准差”表示。多组间采用One-Way ANOVA进行差异分析，方差检验齐性用LSD法，方差不齐性用Games-Howell法检验；两组间采用独立样本T检验。以P0.05表示有统计学意义。2 结果与分析2.14种化合物对福寿螺的毒杀作用槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸处理后的福寿螺死亡情况见表2。在100 mg/L 浓度下，处理24 h后，槲皮素的杀螺活性最好，福寿螺死亡率达到45%，其次为木犀草苷27.3%和芹菜素23.5%，最后为香草酸12.0%。2.24种化合物对福寿螺肝脏两种转氨酶活性的影响如图1所示，与空白相比，槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸处理后，福寿螺肝脏中的ALT/GPT酶活性均显著下降（P0.05），分别降低了72.9%、58.9%、66.8%、66.5%。而福寿螺肝脏中AST/GOT酶活性均显著高于空白组（P0.05），分别升高了115.5%、103.8%、70.5%和88.2%。2.34种化合物对福寿螺头足两种酶活性的影响槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸处理后，与空白相比，福寿螺头足中 AChE酶活性分别下降了43.9%、29.6%、24.8%和 42.2%，均显著低于空白组（P0.05）。福寿螺头足中 NOS酶活性显著下降（P0.05），分别比空白组降低了55.9%、38.8%、37.9%和30.2%（图2）。表1用于福寿螺基因转录分析的基因特异性引物序列Tab.1Gene-specific primer sequences used for P.canaliculatagene transcriptional analysis基因名称Gene namea-tubulin超氧化物歧化酶（SOD）过氧化氢酶（CAT）异柠檬酸脱氢酶（IDH）原肌球蛋白（TM）引物序列Primer-Forward（5-3）Primer-reverse（5-3）F：CCGTCCCTTTGGTGACTCTGR：GGATGTGGTAGCCGTTTCTCF：AGAACCAGAACCGAAAGGGGR：ATAGCCAAGCCAACCCCATCF：GTGACCCGCTACAACACTGAR：CACGGTTCCCAAACTCAGGAF：TTTGGCCTCAAGCAGGAAGTR：GGACCTACTCCATCCCCTGTF：CTGAGGTTGAAGGCATTGAGGR：ACCTCCTCTTGGATATTGCTCC基因长度Gene length130193130118表24种化合物对福寿螺死亡率的影响Tab.2Effects of four compounds on the mortality rate of P.canaliculata组别Group空白组 Control茶皂素 Tea saponin槲皮素 Quercetin木犀草苷 Luteoloside芹菜素 Apigenin香草酸 Vanillic acid浓度/（mgL-1）Concentration10010010010010024 h校正死亡率/%Corrected mortality0.00.00c100.00.00a45.04.41b27.33.03b23.51.96b12.01.54c表中数据为平均数标准差。不同小写字母表示经One-Way ANOVA检验法检验在P0.05水平差异显著。Data are meanSD.Different lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level by One-Way ANOVA test.416第 2 期岑小凤等:4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响2.4槲皮素处理后福寿螺肝脏SOD、CAT、IDH的mRNA相对表达量如图3所示，与空白组相比，槲皮素处理下福寿螺肝脏中SOD、CAT的相对表达量显著升高（P0.05），而IDH的相对表达量显著降低（P0.05）。图中数据为平均数标准差。不同小写字母表示经One-Way ANOVA检验法检验在P0.05水平差异显著。Data are meanSD.Different lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level by One-Way ANOVA test.图14种化合物对福寿螺肝脏ALT/GPT（A）、AST/GOT（B）酶活性的影响Fig.1Effects of four compounds on the activities of ALT/GPT（A）and AST/GOT（B）in the liver of P.canaliculata图中数据为平均数标准差。不同小写字母表示经One-Way ANOVA检验法检验在P0.05水平差异显著。Data are meanSD.Different lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level by One-Way ANOVA test.图24种化合物对福寿螺头足AChE（A）、NOS（B）酶活性的影响Fig.2Effects of four compounds on the enzyme activities of AChE（A）and NOS（B）in the head-foot of P.canaliculata图中数据为平均数标准差。不同小写字母表示经独立样本T检验法检验在P0.05水平差异显著。Data are meanSD.Different lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level by independent-samples T test.图3槲皮素对福寿螺肝脏SOD、CAT、IDH相对表达量的影响Fig.3Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and IDH in the liver of P.canaliculata 417江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷2.5槲皮素处理后福寿螺头足SOD、CAT、TM的mRNA相对表达量图4可见，槲皮素处理后，与空白组相比，福寿螺头足中SOD的相对表达量显著升高（P0.05），而TM的相对表达量显著降低（P0.05）。3 讨论与结论肝脏是福寿螺解毒的重要器官，其解毒过程涉及到ALT/GPT和AST/GOT这两种重要的转氨酶，这两种转氨酶与蛋白质代谢密切相关29。其中ALT/GPT还涉及能量产生的相关途径，尤其是三羧酸循环，AST/GOT酶活性的高低与肝细胞损伤严重程度呈正相关30。本研究中经槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸4种天然产物处理后，福寿螺肝脏中ALT/GPT酶活性均显著降低，而福寿螺肝脏中AST/GOT活性均显著升高。其趋势与鱼腥草生物碱31、白头翁皂苷32和槟榔碱33对钉螺的杀螺实验结果一致。说明4种化合物可能通过影响福寿螺肝脏的蛋白质和能量代谢而致其死亡。福寿螺头足位于螺体的前端，集中着大量的神经元，是最先接触到药液的组织，也是受损最严重的部位。乙酰胆碱是生物体中重要的神经递质，AChE作为水解乙酰胆碱的一种酶，在头足表皮分布较多7，主要参与神经递质传递和物质代谢，是神经细胞功能和性质的重要指标。在银杏叶提取物33、槟榔碱34，以及氯硝柳胺35、灭螺酯36等化学杀螺剂处理钉螺后，观察到AChE活性下降。本研究发现，经过4种天然产物处理后，福寿螺头足的AChE活性明显降低，而AChE活性降低将会导致水解乙酰胆碱的速度减慢，乙酰胆碱在突触间隙堆积，此时突触后膜会持续性兴奋，导致福寿螺的头足麻痹，外周神经和以神经为主的腺体生理功能紊乱，最终造成螺的死亡14,37。NO是一种新型神经递质，可作为信号分子参与软体动物的运动调节，是生物体内常见的第二信使35,38，而NOS是催化NO生物合成的唯一限速酶，研究表明39，当NOS活性降低时，NO合成受阻，神经传递受到抑制。本研究结果显示，经过4种天然产物处理后，福寿螺头足中NOS活性下降，与李洪军40等使用氯硝柳胺悬浮剂对钉螺的浸杀实验发现NOS活性受到抑制的结果一致。表明4种天然化合物可能通过干扰神经递质的传递，降低福寿螺肌肉运动能力，使福寿螺头足不能闭合，以增加福寿螺与药剂的接触面积，最终导致福寿螺个体的死亡。课题组研究发现槲皮素对福寿螺存活率和酶活性的影响最为明显，因此对槲皮素的杀螺作用机制开展进一步研究。SOD和CAT可以防止活性氧自由基对机体中生物大分子的氧化损伤，对清除氧化胁迫过程中产生的活性氧自由基起着决定性作用41，SOD、CAT活性的改变，可以反映生物体在不同胁迫条件下的生理状况42。IDH是三羧酸循环中的限速酶43，TM能调控肌钙蛋白复合物和肌动蛋白之间的相互作用，起到调节肌肉收缩的作用44。本研究RT-qPCR检测结果显示，经槲皮素处理后，福寿螺肝脏和头足中的SOD、CAT的mRNA表达上调，而肝脏中IDH和头足中TM的mRNA表达水平降低。表明槲皮素能引起福寿螺的氧化应激反应，影响福寿螺正常能量代谢和肌肉运动功能。天然活性化合物库的分子结构多样性是新药物开发的源泉。据统计，目前已确定具有生物活性的图中数据为平均数标准差。不同小写字母表示经独立样本T检验法检验在P0.05水平差异显著。Data are meanSD.Different lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level by independent-samples T test.图4槲皮素对福寿螺头足SOD、CAT、TM相对表达量的影响Fig.4Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and TM in the head-foot of P.canaliculata 418第 2 期岑小凤等:4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响天然产物在20万种以上，其中有生物活性的植物天然产物有10万种，占所有天然产物的一半45。植物源杀螺药物具有低毒、易降解等优点，利用植物次生代谢产物成功防治有害生物的例子很多，如印楝素、鱼藤酮、烟碱等植物源农药已市场化很多年，在田间广泛使用。然而，目前已成功推广应用的植物源杀螺药物极少，研究与开发新的植物源杀螺剂，具有极其广阔的市场前景。槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸是广泛存在于植物的根、茎、叶中。在前期筛选的植物中，白肉榕和牛耳枫都具有开发成为植物源农药的潜力，笔者从中分离出了与这些植物防治效果一致的活性化合物，开发高效安全的杀螺药物可能性很大。综上所述，本研究结果表明槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸可以降低福寿螺肝脏中ALT/GPT的活性，升高AST/GOT的活性，影响福寿螺肝脏组织的正常生理功能；同时抑制福寿螺头足神经系统中AChE、NOS的酶活性，影响福寿螺头足的正常神经递质传导。RT-qPCR测定结果表明，经槲皮素处理后福寿螺肝脏中SOD、CAT酶的mRNA表达量和头足中SOD酶的mRNA表达量上升，肝脏中IDH酶和头足中TM的mRNA表达量下降。这些为4种天然产物在防治福寿螺方面的应用提供了一定的实验依据，但其具体作用机制仍有待进一步研究。参考文献 References：1俞晓平，和田节，李中方，等.稻田福寿螺的发生和治理 J.浙江农业学报，2001（5）：9-14.YU X P，HE T J，LI Z H，et al.Occurrence of golden apple snail，Pomacea canaliculata（Lamarck），in paddy fields and 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