对CTAB法提取菠菜基因组DNA实验的优化设计_李岩.pdf

2023年05月|15方法，它有着操作步骤简便、使用试剂相对安全、操作时间较短、实验成本低等优点，非常适合运用于课堂教学中，做好这一实验可以让学生更加直观地观察到DNA 提取物。但传统的 CTAB 提取法受人为操作因素和环境因素影响较大，存在 RNA、多糖污染，DNA提纯率不高等问题。因此，需要根据实际情况对实验进行不断地改进和完善，以控制实验教学的进程，提高实验教学的质量。1 材料与方法1.1 实验用品 主要试剂：菠菜、2CTAB 提取缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)、液氮、异丙醇(中国医药集团有限公司)、异戊醇(中国医药集团有限公司)、氯仿(中国医药集团有限公司)、75乙醇(中国医药集团有限公司)、TE 缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)。主要仪器：水浴锅、离心机、移液枪、分光光度计。1.2 实验方法1.2.1 总体思路 合理控制实验时间、降低实验危险性、提高 DNA浓度及纯度。1.2.2 对照组A 实验步骤(1)称取 1.5 g 菠菜叶片于研钵中，加入适量液氮，轻轻捣碎叶片，待液氮快挥发完时，充分研磨成粉状后转移于 2 mL 离心管中，加入 600 L 65 预热的0 引言菠菜1属藜科菠菜属，一年生草本植物，幼嫩新鲜的菠菜叶片富含 DNA，各种杂质含量较少且易去除，菠菜叶片在去除叶脉后纤维含量较少，可轻松研磨至匀浆糊状，便于实验使用。生物技术是 21 世纪人类科技史中最令人瞩目的高新技术，生物化学与分子生物学则是生物技术领域最重要和最基础的学科，由于其专业的知识性、实践性和应用性，使其处于高校生命科学、生物技术、生物工程和临床医学等专业系列课程的核心位置2。DNA提取是分子生物学中重要的一门技术，DNA 的提取方法通常应满足以下几个主要条件：(1)提取的 DNA破损程度小，DNA 保持完整，从而保证后续电泳检测容易获得精确，重复性好的迁移条带3；(2)所制备的DNA 具备理想的纯度，避免蛋白质、RNA 污染，以便于后续 PCR 扩增、酶切及质粒重组等实验操作的完成；(3)提取过程要简便、省时尽可能降低实验费用，同时尽量避免使用危险化学药品，降低危险性；(4)提取的 DNA 的浓度高，以满足对单株植物研究时所需要的 DNA 的量。常用的 DNA 提取方法有：CTAB 法4、SDS法5、高盐低pH法6、尿素法7、异硫氰酸胍法8等。CTAB 是一种阳离子去污剂，可溶解各种膜系统，使细胞中的 DNA 核蛋白释放出来与 CTAB 形成复合物，并使蛋白质变性；在低盐溶液中，通过离心可将 CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖等物质分开，使DNA 纯化。CTAB 法是一种经典的提取植物 DNA 的对CTAB法提取菠菜基因组DNA实验的优化设计李岩，于海琳，马晓彤，杨茜，张海燕(菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000)摘要：CTAB 法是一种经典的提取植物 DNA 的方法，但传统的提取方法存在 RNA 污染、DNA 提纯率不高等问题。基于这些问题，文章对实验步骤进行了优化，并将使用改良方法提取的菠菜叶片 DNA 通过紫外分光光度法进行检测。结果表明，使用改良方法提取的 DNA 其浓度及纯度显著提高，有效提升了实验教学的质量和效率。关键词：菠菜；CTAB 法；DNA 提取；实验教学中图分类号：G633 文献标志码：A 文章编号：1008-4800(2023)14-0015-03DOI:10.19900/ki.ISSN1008-4800.2023.14.005Conditions Research on CTAB Extraction of Spinach Genome DNALI Yan,YU Hai-lin,MA Xiao-tong,YANG Qian,ZHANG Hai-yan(Heze Medical College,Heze 274000,China)Abstract:The methods of CTAB is a classical method for extracting plant DNA,but the traditional extraction method has RNA pollution and low DNA purification rate.Based on these problems,the experimental steps were optimized,and the spinach leaf DNA extracted using a modified method was detected by UV spectrophotometry.The results showed that the concentration and purity of the DNA extracted with the improved method were improved significantly,which effectively improved the quality and efficiency of the experimental teaching.Keywords:spinach;methods of CTAB;DNA extraction;experimental teaching人才培养16|2023年05月量超标；比值大于 1.8，表明被 RNA 污染。检测 OD230 是判断样品中存在污染物(如：碳水化合物、有机溶剂等)的依据，较纯净的核酸 OD260/OD230 的比值在 2.02.5 之间。取溶解后的待测液 30 L，加 1.97 mL 超纯水，混匀后转入石英比色皿，使用紫外分光光度法检测DNA 的含量。1.2.5 实验步骤改进方法及意义 舍弃液氮的使用，液氮温度低，操作不当容易被冻伤，舍弃其使用有效的降低了实验的危险性。重新分配离心节点，增加 65 后离心，分离清液与未磨碎的叶片，沉淀蛋白质、多糖等物质，减少杂质的污染，提高 DNA 纯度。提高加入 RNaseA 的反应温度至 55 左右，接近 RNaseA 的最适温度，既可以加快反应速度，减少反应时间，还可以避免温度过高导致的 DNA 结构被破坏。在氯仿异戊醇混合液抽提后取清液加入 RNaseA，反应完成后，再加入异丙醇沉淀DNA，减少蛋白质和 RNA 的污染。使用挑出 DNA 的方法代替离心10，减少离心时沉淀下来的蛋白质等杂质干扰，絮状物结构较为疏松，可以更好的被乙醇洗涤，有效的去除残留的杂质。使用 75乙醇清洗三次，使残留的杂质充分溶解于乙醇中，减少有机溶剂及多糖的污染。充分抑制核酸水解，增强 DNA 分子柔韧性，防止 DNA 断裂，延长 DNA 的保存时间。实验分组如图 1 所示。2 实验结果2.1 使用分光光度计检测D 组 OD260/OD280 接近 1.8，DNA 纯度、浓度较高且污染较少，证明使用 RNaseA 可有效的提高DNA 的纯度。C 组与 A 组比较得出挑出絮状沉淀及乙醇洗涤三次的方法可以有效减少杂质污染；B 组与 C 组比较得出，在 65 温育后离心可以更好的保证 DNA 的纯度及浓度。CTAB 提取液，剧烈震荡。(2)将离心管放入 65 水浴锅中温育 20 min，期间颠倒混匀 23 次。(3)将离心管取出后冷却至室温，加入等体积氯仿-异戊醇 241 的混合液，上下颠倒混匀后静置 10 min，10 000 r/min 离心5 min。(4)取上清 500 L 于新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀使样品与有机溶剂充分接触，室温静置 10 min，10 000 r/min 离心 5 min。(5)弃上清，加入800 L 75乙醇，颠倒离心管使沉淀悬浮，充分洗涤，10 000 r/min 离心 2 min。(6)弃上清，待乙醇完全挥发至离心管中无乙醇气味后，加入 100 L TE 缓冲溶液充分溶解 DNA，于 4 冰箱或-80 冷藏箱保存用于后续实验9。1.2.3 改良实验步骤(G组)(1)称取 1.5 g 菠菜叶片于研钵中，充分研磨至匀浆状态，加入 2.5 mL 65 预热的 CTAB 提取液，充分混合均匀，取 2 mL 悬浊液于离心管中。(2)将离心管放入 65 水浴中温育 20 min，期间颠倒混匀 2 次。(3)将离心管取出后冷却至室温，10 000 r/min离心5 min。(4)取 1 mL 上清液于新的离心管中，加 1 mL 氯仿-异戊醇 241 的混合液，上下颠倒混匀后，使样品与有机溶剂充分接触，静置 3 min，10 000 r/min 离心5 min。(5)取上清 700 L 于新的离心管中，加入 5 L RNase A，轻轻吹打混匀，置于 55 水浴中温育 30 min。(6)待冷却至室温，加 700 L 异丙醇，颠倒混匀至样品与有机溶剂充分接触，室温静置 10 min，用枪头旋转挑出离心管中的絮状沉淀至另一离心管中。(7)加入 800 L 75乙醇，上下颠倒离心管使沉淀悬浮，充分洗涤，重复三次。第三次洗涤后，10 000 r/min 离心2 min。(8)弃上清，待乙醇完全挥发至离心管中无乙醇气味后，加入 100 L TE 缓冲溶液充分溶解 DNA，于4 冰箱或-80 冷藏箱保存用于后续实验。1.2.4 紫外分光光度计法检测样品 OD260/OD280 是判断 DNA 纯度的重要指标，比值在 1.6 到 1.8 之间，表明 DNA 纯度高，能够满足下游实验的要求；比值小于 1.6 表明蛋白质、酚类含对照组A直接研磨挑出沉淀实验组E实验组B实验组C实验组D实验组F实验组G挑出沉淀挑出沉淀挑出沉淀乙醇洗涤三次直接研磨直接研磨CTAB 温育后离心CTAB 温育后离心CTAB 温育后离心使用RNaseA乙醇洗涤三次乙醇洗涤三次乙醇洗涤三次抽提去蛋白后使用RNaseA乙醇洗涤三次图1 实验分组图2023年05月|17RNaseA 的最适温度，55 不会导致 DNA 结构破坏，可以提高 DNA 纯度。升高温度的同时可以减少反应时间，55 温育 30 min 与 37 温育 1 h 取得效果相似，可以减少实验时间，提高实验效率。使用改良法提取菠菜叶片 DNA，其浓度显著提高，同时实验时间适宜，减少了危险化学药品的使用，降低了蛋白质、RNA 等物质的污染，较好地调控了实验进程，有效地提高了教学质量和效率。可用于课堂教学、实验室提取 DNA 等多种场景，可行性较高，推广前景良好。参考文献：1 丁宝义，王遂平，高增义.河南植物志M.郑州：河南科学技术出版社，1988.2 卢韫，王顺昌，汪承润，等.血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验教学的优化设计J.生物学杂志，2010(4)：103-106.3 房经贵，章镇.一种提取果树叶片DNA 的简便方法J.生物技术，1999(2)：31-32.4 孔德政，刘艺平，田云芳.改良 CTAB 法对碗莲叶片基因组 DNA 提纯效果的影响J.沈阳农业大学学报，2005，36(4)：428-431.5 候泽菁，常廼滔.用改良 SDS 法提取适于 PCR 扩增的小麦基因组DNAJ.江苏农业科学，2014，42(5)：49-51.6 许理文，王风格，赵久然.高盐低 pH 值法提取玉米基因组 DNA 的研究J.玉米科学，2009，17(1)：59-61，70.7 雷开荣，石春焱，李明顺.一种玉米叶片基因组DNA 快速提取新方法的初步研究J.华北农学报，2006，21(2)：10-12.8 曹文波，郑璐璐，谢文海.一种提取植物基因组DNA 的方法-改良尿素法J.华中师范大学学报，2008，42(3)：448-451.9 李菡，郭兴启.生物化学实验技术原理和方法.第二版M.北京：中国农业出版社，2013.10 范源洪，蔡青，宿兵，等.DNA 提纯方法对 6 种甘蔗亚族植物 RAPD 的影响J.西南农业学报，1999，12(1)：1-7.11 罗强，恒春娜，段世华.山茶属(Camellia L.)植物叶片基因组 DNA 不同提取方法的比较J.井冈山大学学报(自然科学版)，2014，35(4)：40-43.12 丁晨.小麦单片叶片DNA 提取及SSR-PCRJ.安徽农业科学，2016，44(17)：175-176，186.作者简介：李岩(1986-),女，副教授，山东济宁人，博士研究生，研究方向：囊泡运输。基金项目：山东省教育发展研究微课题(No.FJ021)；山东省医药卫生科技发展计划项目(No.2018WS494)；山东省高等学校科技计划项目(No.J18KA295)。由 EF 两组得出，不使用液氮对实验无影响，可以舍弃液氮的使用。EF 两组相较前六组数据较好，同 时 采 用 EF 组 方 法 再 加 入 RNaseA 之 后(G组)，OD260/OD280 比值接近 1.8，DNA 纯度极高且浓度适宜如表 1 所示。表1 七组实验结果对比组别OD260OD280OD230OD260/OD280OD260/OD230A0.2420.1050.1882.031.29B0.1260.3030.1452.082.40C0.3970.1960.2032.021.96D0.2480.1390.3851.780.64E0.9760.4950.6041.971.62F0.2460.1130.1322.171.86G0.3220.1850.2101.741.53故选择 G 组为最终实验流程。2.2 DNA 检测结果采用 G 组实验流程，进行 5 个样品的重复实验，该方法提取的 DNA 的量较多，同时不含有杂质，重复性好(如图 2 所示)。图 改良CTAB方法提取不同菠菜单株的DNA2.3 PCR 的扩增结果对 5 个样品进行 PCR 分析，都可以扩增出比较清晰的条带，并且条带比较丰富(如图 3 所示)。改良的 CTAB 方法可以较好的提取菠菜的 DNA，并且这些 DNA 可以满足后续 PCR 等实验的要求。图 对5个样品进行PCR扩增电泳结果3 结语为避免 RNaseA 对 DNA 的污染以及对后续试验的影响，大部分实验方法都是在异丙醇沉淀 DNA 后重新溶解 DNA 再加入 RNaseA11-12，37 水浴 1 小时至数小时不等。再使用氯仿异丙醇抽提去蛋白，加入异丙醇沉淀 DNA。这种方法耗时长、步骤复杂，DNA丢失量大，提取浓度不高，不适合课堂教学及少量样品的提取。改进方法在异丙醇之前加入 RNaseA，使用挑出絮状沉淀的方式代替离心，避免蛋白质被离心至沉淀中，减少污染的可能。异丙醇沉淀核酸，不沉淀蛋白质，可以减少去除 RNaseA 的过程，减少实验步骤，缩短实验时间，增加 DNA 的得率，提高 DNA 的浓度。同时提高 RNaseA 反应温度至 55 左右，接近