高效液相色谱法测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的含量.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2024年4月第2期Apr.2024,No.2分析与测评169www.ffc-www.ffc-作 者1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.上海食品科技学校，上海 201599；3.上海市医药学校，上海 200135 聂 磊1 付昕媛1 周耀斌1#李文畅1 薛丽芝2 傅 颖3高效液相色谱法测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的含量摘 要建立了一种使用高效液相色谱测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷含量的方法。样品经提取液超声提取后，用 Acutfex PA-C18色谱柱（250 mm4.6 mm5 m）分离，以体积比 2:2:6 的甲醇-乙腈-水作为流动相等度洗脱，流速 1.0 mL/min，柱温 35，检测波长 205 nm。采用外标法测定，结果表明，积雪草苷和羟基积雪草苷在质量浓度5 100 g/mL 内线性关系良好，方法的检出限为质量分数 0.001 5%，定量限为质量分数 0.005%。在不同类型的空白化妆品（水类、乳类、膏霜类）中进行加标回收试验，方法的回收率为 82.8%106%，相对标准偏差为 0.94%4.28%。该方法前处理简单，分离效率高，重复性好，准确度和精密度高，适用于化妆品中积雪草苷和羟基积雪草苷的测定。关键词化妆品 羟基积雪草苷 积雪草苷 高效液相色谱Determination of Madecassoside and Asiaticoside by High Performance Liquid ChromatographyNIE Lei1 FU Xinyuan1 ZHOU Yaobin1#LI Wenchang1 XUE Lizhi2 FU Ying3(1.Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research,Shanghai 200233,China;2.Shanghai Food Science and Technology School,Shanghai 201599,China;3.Shanghai Pharmaceutical School,Shanghai 200135,China)Abstract:A high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of madecassoside and asiaticoside was developed.The sample was extracted with extraction liquid by ultrasonic technique,and then separated on Acutfex PA-C18 column(250 mm4.6 mm5 m),eluted with a mixture of methanol-acetnirile-water in the volume ratio of 2:2:6 as the isocratic mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min and the temperature of column was 35,and detected at a wavelength of 205 nm.The external standard method was used for quantitative determination.The results showed that the linear relationship of madecassoside and asiaticoside were good within the concentration range of 5-100 g/mL,and the detection limit was 0.001 5%(in mass fraction),and the quantification limit was 0.005%(in mass fraction).The spiked recovery test was carried out in different types of cosmetics(water,milk,cream),and the recoveries of the method were 82.8%-106%with the relative standard deviations of 0.94%-4.28%.The method is simple in pretreatment,efficient in separation,reproducible,accurate and precise,and suitable for the determination of madecassoside and asiaticoside in cosmetics.Keywords:cosmetics madecassoside asiaticoside high performance liquid chromatography(HPLC)作 者 简 介聂磊（1986），女，博士，高级工程师，主要从事食品、化妆品、中药质量与标准化的研究。#通信作者：周耀斌（1972），男，本科，高级技师，主要从事食品、化妆品、中药质量与标准化的研究。联系电话：[phone] E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0074收稿日期：2023-03-20；修回日期：2023-04-10分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品170www.ffc-www.ffc-中药积雪草为伞形科植物积雪草（Centella asiatica）的干燥全草，又名连线草、地线草、老公根等，在我国长江以南分布广泛，自古就应用广泛。中药积雪草具有抗抑郁、促进伤口愈合、治疗瘢痕、抗肿瘤、抗胃溃疡、抗菌、抗氧化等生理功效1，而其提取物在化妆品中也使用广泛。化妆品中添加积雪草提取物，可以抗氧化、淡化黑色素沉着、抑制自由基、抗过敏、改善代谢，可以让肌肤光滑细嫩、美白亮丽2。2022 年 5 月 1 日起，申请注册或者进行备案的化妆品，产品标签必须符合化妆品标签管理办法3的规定和要求，即“产品标签上标注化妆品全部成分的原料标准中文名称，以成分作为引导语引出，并按照各成分在产品配方中含量的降序列出。微量成分是指化妆品配方中含量不超过质量分数 0.1%的成分，当产品配方中含有微量成分时，应当以其他微量成分作为引导语另行标注。”不少商家在宣传产品时强调积雪草提取物为功效成分，但是实际上添加与否、添加量多少则不得而知。因此，为了保证消费者的合法权益，拒绝不良商家的概念性添加，亟需建立检测化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的 方法。化妆品中功效组分的分析，文献报道多使用液相色谱4-9或液相色谱-质谱联用法10。针对积雪草提取物，大多数报道集中于其制备和作用11-15，鲜见检测方面的内容。积雪草苷和羟基积雪草苷作为积雪草提取物的主要成分，在文献 16-18 和我国现行中华人民共和国药典（以下简称药典）19中的检测方法多采用高效液相色谱法。药典使用乙腈和-环糊精做流动相等度洗脱，紫外检测器检测，但-环糊精不常作为流动相在液相色谱分析使用，且出峰时间较长，不适用于化妆品的分析。其他文献的研究多针对其作为药品本身，不适用于化妆品。袁莹莹等20使用液相色谱-串联质谱测定了化妆品中积雪草提取物的活性成分，但是液相色谱-质谱仪较为昂贵，且需要基质曲线定量，不适合常规样品的大规模检测。因此，亟需建立适合化妆品中积雪草苷和羟基积雪草苷简单快速的检测方法，对化妆品中的积雪草提取物进行检测，为此类化妆品的监督提供合适的技术手段。1 试验部分1.1 仪器与试剂AL104 型电子天平，梅特勒-托利多科技（中国）有限公司；Waters 2695 型高效液相色谱仪，配 waters 2998 型二级管阵列（DAD）检测器，沃特世科技有限公司；SK8200H 超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。积 雪 草 苷 和 羟 基 积 雪 草 苷 对 照 品，纯 度 98%，上海普誉科技有限公司；乙腈和甲醇（均为色谱纯），默克生命科学有限公司；超纯水，由实验室 Millipore 超纯水系统提供。市售化妆品共 20 份样品，其中标签中不含积雪草提取物的水类、乳液类、膏霜类化妆品共10份，标签中含有积雪草提取物的水类、乳液类、膏霜类化妆品共 10 份。色谱条件：色谱柱为Acutfex PA-C18（250 mm 4.6 mm5 m），流动相为体积比 2:2:6 的甲醇-乙腈-水，流速为 1.0 mL/min，柱温为 35，检测波长为 205 nm，进样量为 20 L。1.2 溶液制备样品提取液：取甲醇 80 mL 加入乙腈定容到100 mL。积雪草苷和羟基积雪草苷对照品溶液：准确称取积雪草苷和羟基积雪草苷对照品各 10.0 mg 于10 mL 容量瓶中，然后用甲醇定容至刻度。即得质量浓度为 1.0 mg/mL 的标准储备液，于-20 下保存。积雪草苷和羟基积雪草苷工作溶液：用甲醇将上述对照品溶液配制成一系列质量浓度为 5、10、20、50、100 g/mL 的标准工作溶液，现用现配。1.3 样品的制备水类化妆品：取样品 1 g（精确至 0.001 g）于10 mL 刻度离心管中，加入甲醇 7 mL，涡旋振荡1 min，水浴超声提取 20 min，冷却至室温后，用甲醇定容至刻度。提取液使用离心机 10 000 r/min离心分离 10 min 后取上清液，经 0.22 m 滤膜过滤后，待测。膏霜、乳液类化妆品：取样品 1 g（精确至0.001 g）于 10 mL 刻度离心管中，加入样品提取液 7 mL，涡旋振荡 1 min，水浴超声提取 20 min，冷却至室温后，用样品提取液定容至刻度。提取液使用离心机 10 000 r/min 离心分离 10 min 后取上清液，经 0.22 m 滤膜过滤后，待测。第 2 期分析与测评聂 磊，等：高效液相色谱法测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的含量171www.ffc-使用棕色样品瓶上机检测，若检测含量超出线性范围，应将提取液稀释相应倍数后上机测定。2 结果与讨论2.1 流动相的选择对于积雪草苷和羟基积雪草苷，现有文献报道使用的流动相有甲醇、-环糊精、乙腈等，药典方法18采用甲醇和-环糊精等度洗脱，时间较久，且-环糊精在反相色谱分离时不常用，在参照文献报道的基础上，考察了不同流动相的分离效果。使用甲醇和水做为流动相，按不同比例进行洗脱。使用体积比 1:1 的甲醇-水为流动相等度洗脱时，5 min 可以完成洗脱，但羟基积雪草苷和积雪草苷的分离度不好；当提高甲醇的比例，羟基积雪草苷和积雪草苷的分离度变好，但是洗脱时间较长，不适用于大规模样品的快速分析。更换乙腈-水作为流动相，当使用体积比 1:1 的乙腈-水为流动相等度洗脱时，洗脱时间更短，且随着乙腈比例增高，洗脱时间变短，但是分离度变差，峰型也较差。综合考虑分离度和分析时间，选用了甲醇-乙腈-水 3 相作为流动相。考察了不同配比的甲醇、乙腈、水作为流动相时羟基积雪草苷和积雪草苷的分离度和洗脱时间，最终选择了甲醇-乙腈-水体积比为 2:2:6 作为最终的洗脱条件，此时羟基积雪草苷和积雪草苷可以完全分离，且可以在 20 min 内完成分离，适用于大规模样品的快速分析，如图 1 所示。多，其信噪比较差，参考药典选择了 205 nm作为检测波长。图 1 积雪草苷和羟基积雪草苷混合标准品溶液色谱图2.2 波长的选择使用 DAD 检测器，对羟基积雪草苷和积雪草苷进行 190 400 nm 全波段扫描，扫描光谱如图 2所示，羟基积雪草苷和积雪草苷均在 195 nm 处有最大吸收波长，但是在 195 nm 处有吸收的物质很2.3 色谱柱的选择使用了喆分色谱公司的 Acutfex PA-C18（250 mm4.6 mm5 m）、安捷伦公司的 XDB-C18（250 mm4.6 mm5 m）、纳 谱 分 析 的 ChromCore 120-C18（250 mm4.6 mm5 m）、菲齐生物科技 公 司 的 CapaSil-C18（250 mm4.6 mm5 m）色谱柱，发现均能对积雪草苷和羟基积雪草苷进行有效分离，故对色谱柱不做特殊限定，试验采用了 Acutfex PA-C18（250 mm4.6 mm5 m）色谱柱。2.4 柱温的选择在上述色谱条件下，考察了在柱温为 30、35、40 下目标混合物的色谱分离情况，发现柱温对色谱的分离几乎没有影响，故对色谱柱温也不做特殊要求，试验使用柱温为 35。2.5 系统适用性与稳定性测试在上述色谱条件下，考察了系统适用性，羟基积雪草苷的理论塔板数为 8 739，拖尾因子为0.97；积雪草苷的理论塔板数为 10 083，拖尾因子为 0.97。使用质量浓度为 100 g/mL 的羟基积雪草苷和积雪草苷的混合标准品溶液，连续进样6 次进行色谱分析，羟基积雪草苷的峰面积相对标准偏差（RSD）为 1.07%，积雪草苷的峰面积RSD 为 0.33%，可以满足检验的需求。2.6 前处理条件的筛选2.6.1 提取溶剂的选择积雪草苷和羟基积雪草苷易溶于水和甲醇，参考文献多用甲醇对目标物中的积雪草苷和羟基积雪草苷进行提取。对于水类化妆品，直接采用甲醇对目标物进行提取，对于膏霜和乳液类化妆品，单纯的甲醇溶剂破乳效果较差，提取的含目0.020.01响应值(AU)羟基积雪草苷积雪草苷0 5 10 15 20时间/min图 2 积雪草苷（a）和羟基积雪草苷（b）的 DAD 吸收光谱图响应值(AU)吸收波长/nm吸收波长/nm响应值(AU)195195（a）（b）分析与测评2024 年 4 月香料香精化妆品172www.ffc-www.ffc-标物的样品溶液不澄清，上机分析时易堵塞色谱柱。针对这个问题，采用在甲醇中添加破乳效果更强的乙腈进行混合提取，通过在基质较复杂的膏霜样品中加入目标混合物，考察不同比例的甲醇和乙腈提取效果，结果如图 3 所示。当甲醇与乙腈的体积比为 8:2 时，提取效果最好，故以此作为膏霜和乳液的提取液。和含有上述目标物样品提取液的稳定性。取 50 g/mL 积雪草苷和羟基积雪草苷混合标准品溶液在第1、2、3 天分别上机分析，进行稳定性测试，发现第 1 天目标物的峰面积与现配制的混合标准溶液峰面积 RSD10%，第 2 天目标物降解大半，第 3天目标物几乎降解完全。以化妆品中基质最为复杂的膏霜样品为代表，加标质量浓度为 50 g/mL，在同样条件下进行检测，目标物的峰面积相对稳定，第 3 天目标物的峰面积与刚提取后即刻检测的样品峰面积RSD5%，故而工作曲线需要现用现配，提取的样品需在 3 天内检测完成。2.8 方法线性、检出限和定量限以羟基积雪草苷和积雪草苷的质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标做标准曲线，外标法定量，羟基积雪草苷和积雪草苷在质量浓度 5 100 g/mL 呈线性相关。羟基积雪草苷的线性回归方程为 Y=-3.35103X+5.04103，线性相关系数（R2）为 0.999 8；积雪草苷的线性回归方程为Y=-1.41103X+4.94103，R2为 0.999 2。以 3 倍 信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限，结合样品加标回收情况，确定羟基积雪草苷和积雪草苷的检出限为 0.001 5%（质量分数），定量限为 0.005%（质量分数）。2.9 回收率与精密度选取 3 种有代表性的阴性空白样品基质（化妆水、膏霜、乳液），分别添加低、中、高 3 个含量水平（质量分数 0.005%、0.01%、0.05%），每一个添加水平重复测定 6 次测定。其回收率和精密度结果如表 1 和表 2 所示，化妆水、膏霜、乳液的加标回收率为 82.8%106.0%，且 RSD5%。由此可见，方法具有较高的准确性。2.10 实际样品测定选取市面 20 份化妆品样品，其中 10 份化妆品标签标有积雪草提取物，另 10 份化妆品标签未标有积雪草提取物，按照上述方法进行检测，结果如表 3 所示。标签标示含有积雪草提取物的化妆品实际样品中，积雪草苷和羟基积雪草苷含量为 0.022 3%0.202 0%（质量分数）；有 2 份标签中含有积雪草提取物的化妆品未检出积雪草苷和羟基积雪草苷，10 份未标有积雪草提取物的化妆品均未检出积雪草苷和羟基积雪草苷。图 3 甲醇与乙腈体积比筛选结果图 4 超声时间的选择2.6.2 超声时间的选择在空白的膏霜类化妆品中添加目标混合物，使用提取液进行超声提取，超声提取时间对提取效率的影响如图 4 所示，超声时间在 20 min 后提取效率增加甚微，综合考虑选取超声 20 min 做为提取时间。2.6.3 超声温度的选择在空白的膏霜类化妆品中添加目标混合物，使用提取液进行超声提取。在超声时间相同的情况下，考察了不同的超声提取温度（30、40、50），发现在这 3 个温度下超声提取效率几乎相同，故不对超声温度做限制。2.7 稳定性测试考察了积雪草苷和羟基积雪草苷标准品溶液1000948474提取效率/%提取效率/%9182552889.51020时间/min3087.5854537.598.579.9190.1291.2496.5103甲醇与乙腈的体积比羟基积雪草苷积雪草苷第 2 期分析与测评聂 磊，等：高效液相色谱法测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的含量173www.ffc-表 1 羟基积雪草苷的回收率和精密度结果（n=6）样品类型加入量/%测定值/%回收率/%RSD/%化妆水0.0050.004 8196.23.590.0100.009 6896.84.280.0500.052 41105.03.22膏霜0.0050.005 26105.01.570.0100.009 9799.73.960.0500.041 4382.81.99乳液0.0050.004 5190.22.740.0100.008 3583.51.860.0500.045 7891.60.94表 2 积雪草苷的回收率和精密度结果（n=6）样品类型加入量/%测定值/%回收率/%RSD/%化妆水0.0050.005 19104.03.540.0100.010 26103.02.540.0500.052 89106.03.23膏霜0.0050.004 9899.11.280.0100.009 7097.03.710.0500.043 8287.63.51乳液0.0050.004 8096.03.770.0100.009 6696.63.360.0500.049 5599.11.28表 3 标签标示含有积雪草提取物化妆品实际样品检测结果样品名称羟基积雪草苷质量分数/%积雪草苷质量分数/%焕颜提亮精华0.022 30.045 1植萃贵妇膏未检出未检出精华水未检出未检出修颜乳0.052 50.068 4平衡修护水0.121 00.098 5美肌精华乳0.065 10.202 0焕肤乳液0.121 00.126 0修护膏0.025 40.032 5修护乳0.058 40.061 2洋甘菊修护膏0.026 50.031 23 结论建立了一种使用高效液相色谱测定化妆品中羟基积雪草苷和积雪草苷的方法。该方法前处理简单、快速、准确性和精密度好，可以检测化妆品中是否如实添加了积雪草提取物，因此可为企业提升产品质量以及规范市场上积雪草提取物相关的标识产品质量提供相应的技术手段。参考文献1 严明强,任娟.积雪草提取物在个人护理品中的应用 J.香料香精化妆品,2009(6):44-46.2 聂艳峰.积雪草提取物的制备及其在化妆品中的应用 D.广州:暨南大学,2017.3 国家药品监督管理局.国家药监局关于发布实施化妆品标签管理办法的公告(2021 年第 77 号)EB/OL.(2021-06-03)2022-08-27.https:/ 聂磊,闫晴,俞所银,等.液相色谱法测定美白类化妆品中的阿魏酸、苯乙基间苯二酚、辛酰水杨酸 J.香料香精化妆品,2021(1):53-57.5 蔡铱妮,孙红梅,徐新军.高效液相色谱法测定吡咯烷酮羧酸钠含量 J.香料香精化妆品,2022(2):71-74.6 茹歌,韩晶,彭兴盛,等.化妆品中儿茶素类组分的高效液相色谱测定法 J.上海预防医学,2022,34(6):601-606.7 曹菲斐,石兴红,符秋美,等.高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯乙酮等 6 种防腐剂 J.广东化工,2021,48(19):185-186,195.8 陈燕,鲍熹珺,闫秀芳,等.高效液相色谱法同时测定化妆品中 16 种防腐剂、防晒剂和去屑剂 J.日用化学工业,2022,52(3):337-344.9 李静静,范菲,朱清.高效液相色谱法同时测定洗发水中 7种防腐剂和去屑剂 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