CLDN4对雨蛙素诱导的急...亡和自噬的影响及其机制研究_杨娟.pdf

过下调 Bax 表达、上调 Bac 2 表达来抑制心肌细胞凋亡，以起到心肌保护的作用。引起心力衰竭、心肌梗死的一个主要原因为自主神经平衡失调，交感神经活性持续增加会使得心肌重构、心室功能出现恶化，增加心肌梗死后的病死率，而迷走神经活性持续降低，会加速心肌重塑及左室功能不全进程，引起心力衰竭15，因此治疗心力衰竭的目的是降低患者的交感神经活性，而短暂的阻断股动脉会产生远隔心脏保护作用，对大鼠的正常肢体行缺血再灌注会对保护远隔的心脏组织，其可激活脑干迷走节前神经元，而迷走神经末梢会释放乙酰胆碱等主要神经递质，其会使机体的血管内皮细胞产生内皮源性舒张因子等血管活性因子，该因子会扩张冠状动脉，增加冠脉血流，而乙酰胆碱含量与胆碱能神经的密度降低有一定相关性，因此推测可以通过生理性缺血训练提高胆碱能神经密度，进而增加胆碱能含量，改善迷走神经活性，从而改善心力衰竭大鼠的心功能。4结论生理性缺血训练联合生长激素释放肽 6 可改善心力衰竭大鼠心功能，可能与其可提高大鼠的 Bcl 2、胆碱酯酶活性及胆碱能神经密度，降低血清胱抑素 C、NT proBNP、Ang、醛固酮水平及 Bax 蛋白表达有关。参考文献 1李强，陆士娟，黄康，等 慢性心力衰竭患者利钠肽活化酶、心钠素水平与病情严重程度及预后的关系J 临床和实验医学杂志，2022，21(12):1258 1262 2 Pfeffer MA，Shah AM，Borlaug BA Heart failure with preserved ejectionfraction in perspective J Circ es，2019，124(11):1598 1617 3Di Palo KE，Barone NJ Hypertension and Heart Failure:Prevention，Targets，and Treatment J Heart Fail Clin，2020，16(1):99 106 4王明亮，刘敏，徐亚伟，等 心肌缺血再灌注时内皮功能紊乱与心肌细胞凋亡的相关性研究 J 中华老年医学杂志，2021，40(4):501 505 5胡阳，邓洁，王婷婷，等 基于 PI3K/Akt 信号通路探讨雄性激素对慢性心力衰竭心肌细胞凋亡的影响J 中国老年学杂志，2022，42(10):2471 2476 6王建飞 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654 15 程怡慧，张秀，张心彤，等 迷走神经在生理性缺血训练改善心力衰竭大鼠心功能中的作用 J 中国康复医学杂志，2021，36(6):639 648(收稿日期:2022 11 21)DOI:10 3969/j issn 1671 4695 2023 07 002文章编号:1671 4695(2023)07 0677 05CLDN4 对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型凋亡和自噬的影响及其机制研究杨娟1张超1*徐颢1杨琦1戴菲2(1 西北大学附属医院西安市第三医院消化内科陕西西安710068;2 西安交通大学第二附属医院消化内科陕西西安710068)基金项目:陕西省重点研发计划项目(编号:2020SF235)*通讯作者:张超，E mail:zzwwcc2001163 com【摘要】目的本研究目的在于探究 CLDN4 在急性胰腺炎中的作用及其作用机制。方法使用雨蛙素分别处理大鼠胰腺腺泡细胞(A42J)0、2、4、6、8、10 h 建立急性胰腺炎细胞模型;本研究将 A42J 细胞按随机数字表法分为5 组:对照组:正常培养的 A42J 细胞;雨蛙素组:经雨蛙素处理的 A42J 细胞;si control 组:经雨蛙素处理且转染 si control的 A42J 细胞;si CLDN4 组:经雨蛙素处理且转染 CLDN4 siNA 的 A42J 细胞;NF B 组:经雨蛙素处理、转染CLDN4 siNA 且使用 NF B 激活剂的 A42J 细胞。使用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF776临床和实验医学杂志2023 年 4 月第 22 卷第 7 期)和白细胞介素(IL)6 的含量;使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平;使用蛋白质印迹法分别检测 CLDN4、LC3 I、LC3 II、t p65、p p65、p62 和 Beclin 1 的表达水平。结果在 A42J 细胞被雨蛙素分别处理 0、2、4、6、8、10 h 后CLDN4 表达水平分别为 1 00 0 07、1 63 0 14、2 34 0 18、2 91 0 25、3 66 0 35 和 3 18 0 32，雨蛙素处理显著增高了 CLDN4 的表达水平，且在处理 8 h 后达到峰值。经过雨蛙素处理后，A42J 细胞上清液中 TNF 和 IL 6 的表达水平显著增加，差异有统计学意义(P 0 05)。经过雨蛙素处理后，A42J 细胞凋亡率升高，LC3 II/LC3 I 比值和Beclin 1 表达水平显著上升，以及 p62 表达水平显著下调。敲低 CLDN4 减弱了雨蛙素的效果并抑制了 NF B 信号通路的激活;而增强 NF B 信号通路的活性逆转了敲低 CLDN4 带来的一系列影响。结论CLDN4 能够通过激活 NF B 信号通路诱导急性胰腺炎细胞模型中细胞的凋亡和自噬。【关键词】CLDN4雨蛙素急性胰腺炎凋亡自噬Effect of CLDN4 on apoptosis and autophagy in acute pancreatitis cell model induced by caerulein and its mechanism YANG Juan，ZHANG Chao，XU Hao，et al Department of Gastroenterology，The Third Hospital of Xi an，Affiliated Hospital of Northwest University，XianShaanxi 710068，China【Abstract】ObjectiveThe aim of this study is to explore the effects and mechanism of CLDN4 in a cell model of acute pancreatitisMethodsA42J cells were incubated with caerulein for 0，2，4，6，8 and 10 hours respectively to establish the acute pancreatitis cell modelThe cells were divided into five groups by random number table method，control group:A42J cells without additional treatment;caerulein group:A42J cells treated with caerulein;si control group:A42J cells treated with caerulein and transfected with si control;si CLDN4 group:A42J cells treated with caerulein and transfected with CLDN4 siNA;NF B group:A42J cells treated with caerulein，NF B agonist andtransfected with CLDN4 siNA The content of tumor necrosis factor alpha(TNF )and interleukin(IL)6 in cell supernatant was detected byenzyme linked immunosorbent assay The level of apoptosis was detected by flow cytometry The expression of CLDN4，LC3 I，LC3 II，P65，P P65，p62 and Beclin 1 was detected by western blotting esultsThe expression level of CLDN4 was 100 007，163 014，234 0 18，2 91 0 25，366 0 35 and 3 18 032 after A42J cells were treated with hydatin for 0，2，4，6，8 and 10 hours respectively Theexpression level of CLDN4 was significantly increased by hydatin treatment，and reached the peak after 8 hours of treatment After being treatedwith hydatin，the expression levels of TNF and IL 6 in the supernatant of A42J cells were significantly increased，the differences were sta-tistically significant(P 0 05)After treatment with hydatin，the apoptosis rate of A42J cells increased，the ratio of LC3 II/LC3 I and theexpression level of Beclin 1 increased significantly，and the expression level of p62 decreased significantly The knockdown of CLDN4 alleviatedthe effects of caerulein and inhibited the activation of NF B signal Whereas the enhance of NF B signal reversed the influence of CLDN4knockdown ConclusionCLDN4 induces cell apoptosis and autophagy by activiting NF B singnaling pathway in A42J cells incubated withcaerulein【Key words】CLDN4;Caerulein;Acute pancreatitis;Apoptosis;Autophagy急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种常见的疾病，尽管急性胰腺炎是自限性的，但约有 20%的急性胰腺炎患者会发展为重症急性胰腺炎(severe acute pan-creatitis，SAP)，并可能发生多器官功能障碍，威胁生命1。在中国，近年来胰腺炎带来的医疗负担虽有缓解，但人口老龄化的加剧为胰腺炎的防治带来了新的挑战2。目前，急性胰腺炎发生、发展的分子机制尚不完全明确，缺少对急性胰腺炎发病机制的特异性治疗方法3。曾有研究发现，在发生了胰腺炎的胰腺组织中CLDN4 表达水平显著提高，且通过构造蛋白质互作用网络发现 CLDN4 在胰腺炎相关的蛋白质中处于中心位置4;另有研究发现，CLDN4 和急性胰腺炎发生时的肠道通透性增加有关5。这些研究显示，CLDN4 可能在急性胰腺炎的发生、发展中发挥了重要作用。然而，尚且没有文献具体阐述 CLDN4 在急性胰腺炎中发挥的具体作用。本研究试图通过探究 CLDN4 对急性胰腺炎细胞模型的影响及其作用机制，为急性胰腺炎的发生、发展机制提供新的认识，为靶向药物的开发提供新的理论基础。1材料与方法1 1主要材料与仪器大鼠胰腺腺泡细胞株(A42J)购自中国典型培养物保藏中心;青霉素、链霉素、DMEM培养基、Lipofectamine 2 000 和酶联免疫吸附试验试剂盒均购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;CLDN4siNA 及其阴性对照 si control 由上海吉玛制药技术有限公司构建;细辛酮购自美国 MedChemexpress 生物科技公司;膜联蛋白 V(Annexin V)/碘化丙啶(propidiumiodide，PI)凋亡检测试剂盒购自美国 Southern Biotech-nology 公司;使用 FlowJo V10 软件(美国 BD 公司)分析流式细胞术结果;IPA 裂解液购自上海碧云天生物科技有限公司;蛋白质印迹专用试剂购买于美国 Invitrogen公司。1 2方法1 2 1细胞培养在37，5%CO2的条件下，于含有10%胎牛血清、1%青霉素和 1%链霉素的 DMEM 培养基中培养 A42J 细胞。1 2 2急性胰腺炎细胞模型构建将 A42J 细胞(1105细胞/mL)接种到 6 孔板中培养 24 h，然后使用100 nmol/L 雨蛙素分别孵育 0、2、4、6、8 和 10 h。最后，收集细胞上清液，使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF )和白细胞介素(interleukin，IL)6 的表达水平。1 2 3细胞转染和分组A42J 细胞被雨蛙素分别处理 0、2、4、6、8、10 h。使用 Lipofectamine 2 000 将876Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol22，No7Apr2023CLDN4 siNA 和其阴性对照 si control 转染到 A42J细胞中。将经过不同处理的细胞按随机数字表法分为5 组:对照组:正常培养的 A42J 细胞;雨蛙素组:经过100 nmol/L 雨蛙素处理 8 h 后的 A42J 细胞;si con-trol 组:向 A42J 细胞中转染 si control 并经过 8 h 的雨蛙素处理;si CLDN4 组:向 A42J 细胞中转染CLDN4 siNA 并经过 8 h 的雨蛙素处理;NF B 组:向A42J 细胞中转染 CLDN4 siNA 并经过 8 h 的雨蛙素处理，且使用 NF B 激活剂(细辛酮)。1 2 4酶联免疫吸附试验将 A42J 细胞以每孔 4 104种植到 24 孔板中，在室温下 1 000 g 离心 10 min，收集细胞上清液。根据制造商说明书，使用酶联免疫吸附试验试剂盒测定细胞上清液中白细胞介素 6(interleu-kin 6，IL 6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factoralpha，TNF )的浓度。1 2 5细胞凋亡检测用流式细胞仪检测 A42J 细胞凋亡。使用 AnnexinV/PI 凋亡检测试剂盒测定凋亡程度。将处理好的细胞消化并离心，用冷 PBS 洗涤 2 次，重悬细胞并使其终浓度为 1 106cells/mL。最后，使用FlowJo V10 软件分析 A42J 细胞凋亡情况。1 2 6蛋白质印迹法待各组 A42J 细胞处理完毕，弃培养基，用预冷 IPA 裂解液冰上孵育 20 min，13 000r/min(离心半径 8 cm)、4 消化细胞并离心 20 min 后收集细胞，提取细胞总蛋白。取 50 g 总蛋白加样于12%聚丙烯酰胺凝胶中，100 V 电泳2 h。然后电转移至聚偏氟乙烯膜。使用 5%脱脂牛奶室温封闭聚偏氟乙烯膜 1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，与一抗在 4 下孵育过夜。在 TBST 洗膜后，在室温下将膜用二抗孵育1 h。TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。最后用蛋白质印迹专用试剂显色成像。以 actin 为内参分析蛋白质表达情况。本研究所有实验均重复 3 次。1 3统计学处理使用 SPSS 25 0 软件分析本研究的数据;计量数据以均数 标准差(?x s)表示，两独立样本差异比较采用 t 检验，多组独立样本差异比较采用方差分析;P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1急性胰腺炎细胞模型的构建在 A42J 细胞被雨蛙素分别处理0、2、4、6、8、10 h 后 CLDN4 表达水平分别为 1 00 0 07、1 63 0 14、2 34 0 18、2 91 0 25、3 66 0 35 和 3 18 0 32，组间比较差异有统计学意义(F=53 23，P 0 05)，说明雨蛙素处理显著增高了 CLDN4 的表达水平，且在处理 8 h 后达到峰值(见图1)，因此，本研究使用被雨蛙素处理了 8 h 的 A42J 细胞作为急性胰腺炎细胞模型。此外，经过雨蛙素处理后，A42J 细胞上清液中 TNF 和 IL 6 的表达水平显著增加，差异有统计学意义(P 0 05)，说明急性胰腺炎细胞模型构建成功。见表 1。图 1经过雨蛙素处理不同时间后 A42J 细胞中 CLDN4 的表达水平表1雨蛙素处理前后A42J 细胞上清液中TNF 和IL 6 的含量(?x s)组别TNF IL 6对照组1 00 006100 008雨蛙素组2 68 019242 024t 值1460972P 值0010012 2CLDN4 对 A42J 细胞凋亡和自噬的影响蛋白质印迹结果显示，si CLDN4 成功敲低了 A42J 细胞中CLDN4 的表达，差异有统计学意义(P 0 05)。此外，流式细胞术结果显示，雨蛙素组细胞凋亡率为(28 562 44)%，显著高于对照组(7 24 0 68)%，t=14 58，P 0 01，si CLDN4 组细胞凋亡率为(12 471 21)%，显著低于 si control 组(27 42 2 76)%，t=8 59，P 0 01，si CLDN4 组细胞凋亡率显著低于NF B 组(1758 1 55)%，t=4 50，P=0 01。经过雨蛙素处理后，A42J 细胞中 LC3/LC3 的比值和Beclin 1 的表达显著上升，而 p62 表达水平被显著下调，差异均有统计学意义(P 0 05)，CLDN4 加强了细胞自噬水平。见图2、表2。23CLDN4 激活 NF B 信号通路蛋白质印迹的结果显示，与正常 A42J 细胞相比，经过雨蛙素处理后，p p65 表达水平显著提高，NF B 信号通路被激活，而在敲低了 CLDN4 后，NF B 的激活被逆转，差异均有统计学意义(P 0 05)。见图 2、表 2。2 4干扰 NF B 信号通路减弱了 si CLDN4 的作用流式细胞术和蛋白质印迹法结果显示，通过同时抑制CLDN4 的表达并激活 NF B，前文中 si CLDN4 对于细胞凋亡和自噬的抑制作用被显著减弱，差异有统计学意义(P 0 05)。见图 2、表 2。图 2不同处理条件下各蛋白表达情况976临床和实验医学杂志2023 年 4 月第 22 卷第 7 期表 2不同处理条件下各蛋白表达情况(?x s)组别CLDN4LC3 II/LC3 It p65p p65p62Beclin 1对照组1 00 0 041 00 0 09100 0 12100 007100 012100 0 10雨蛙素组3 47 0 352 36 0 22107 0 08287 025042 004213 0 19si control 组3 38 0 332 22 0 18104 0 07279 028039 004216 0 23si CLDN4 组1 42 0 111 28 0 13110 0 11156 017091 008134 0 15NF B 组1 33 0 152 29 0 17109 0 10269 022050 006221 0 21t 值/P 值a1214/0 01990/0 01048/0661248/0 01794/0019 11/0 01t 值/P 值b976/0 01733/0 01080/047650/0 011007/0015 17/0 01t 值/P 值c084/045817/001012/091704/001710/0015 84/001注:a对照组与雨蛙素组比较;bsi control 组与 si CLDN4 组比较;csi CLDN4 组与 NF B 组比较。3讨论在世界范围内，急性胰腺炎的发病率仍在持续增长，常有急性胰腺炎患者反复入院或转变为慢性胰腺炎，造成长期生活质量下降，但目前仍缺乏机制特异性的针对性疗法6。因此，继续深入研究导致急性胰腺炎发生、发展的分子机制十分重要。CLDN4 是 claudin 家族的重要成员，参与了能够作为 CPE 受体的细胞外环的形成，并通过与 CPE 的紧密结合对细胞凋亡等产生影响7。目前，对 CLDN4 的研究仍主要集中在癌症方面，CLDN4 在多种恶性上皮肿瘤中异常表达，在多种肿瘤的早期诊断和靶向治疗中具有重要的开发潜力8。有研究发现，在膀胱尿路上皮癌组织中，与正常组织相比，CLDN4 表达显著增加，CLDN4的低甲基化能促进癌细胞的增殖、转移和上皮细胞间质化9。早在 2001 年，CLDN4 就被认为可能是胰腺癌治疗的有效靶点10。CLDN4 在人胰腺癌组织及其早期病变组织中表达显著增加，这种表达异常使得其具有作为早期诊断标志物的潜力11，而通过使用单克隆抗体减弱 CLDN4 的效果有望成为胰腺癌的治疗手段之一7。这些研究表明 CLDN4 在胰腺癌的诊断和治疗中具有良好的应用前景。尽管目前在急性胰腺炎中 CLDN4 相关的报道不多，但值得注意的是，急性胰腺炎也有可能是胰腺癌的早期表现之一，而慢性胰腺炎则有可能发展成为胰腺癌12。这种相关性使得 CLDN4 也有可能是急性胰腺炎的潜在治疗靶点，且 CLDN4 可能在这些疾病的转化和发展中产生了重要作用，但需要大量的实验和证据进行进一步调查。本研究发现在使用雨蛙素诱导构建的急性胰腺炎细胞模型中 CLDN4 的表达水平显著增高，这与胰腺癌中发现的结果相似。急性胰腺炎是最初仅局限于胰腺的炎症，但在其发生、发展中会产生TNF 和 IL 1 等促炎细胞因子，这些细胞因子会进一步激活 MAPK 等信号通路，通过这种方式，急性胰腺炎的炎症反应能够被放大到全身，并引发多器官功能障碍等严重问题13。此外，激活的 MAPK 信号通路能够促进 CLDN4 的表达，这在一定程度上回答了为什么成功构建急性胰腺炎细胞模型后能观察到 CLDN4 表达水平的显著提高。异常的细胞自噬和细胞凋亡是导致急性胰腺炎及急性胰腺炎后多器官功能障碍的重要因素6，在急性胰腺炎发生、发展的进程中，异常的自噬会损伤线粒体和内质网等细胞器，并因此导致细胞功能异常和死亡14，这种胰腺腺泡细胞本身受到的损伤不仅能够反映急性胰腺炎的严重程度，而且调节细胞凋亡和坏死之间的平衡是缓解急性胰腺癌症状的重要途经15。本研究发现抑制 CLDN4 的表达能够显著降低雨蛙素导致的 A42J细胞的凋亡和自噬，即通过抑制 CLDN4 能够减轻急性胰腺炎细胞模型中 A42J 细胞受到的损伤，这表明CLDN4 可能具有治疗急性胰腺炎的潜力。进一步研究发现，抑制 CLDN4 带来的对 A42J 细胞的保护效果是通过间接减弱下游 NF B 信号通路的激活实现的。NF B 是影响急性胰腺炎发生、发展的重要信号通路之一，在急性胰腺炎的治疗上具有巨大的潜能。大量的研究表明，NF B 的激活是急性胰腺炎的早期发生、发展及其炎症反应的中心事件。急性胰腺炎导致的氧化应激反应和炎症反应能够激活 NF B，而激活的 NF B 又会促使更多的炎性细胞因子继续产生。抑制 NF B 减轻急性胰腺炎的研究在多种体内外实验中取得了良好的结果，例如，有研究发现，川芎嗪能够通过降低 NF B 信号通路的活性减少胰腺细胞凋亡，进而缓解大鼠的急性胰腺炎症状16;类似的，吴茱萸次碱被发现能够减轻小鼠的急性胰腺炎炎症，并在急性胰腺炎细胞模型中被证实能够通过抑制MAPK、NF B 和 STAT3 信号的激活提高细胞活性，抑制细胞凋亡17。但由于临床实际情况的复杂性，抑制NF B 的手段尚且没有实际应用18。目前，关注CLDN4 和 NF B 关系的研究虽然不多，但也曾有研究发现在胶质母细胞瘤组织中，CLDN4 表达显著增高，其通过 TNF 间接促进 NF B 的激活，进而显著促进癌细胞的迁移和肿瘤生长19;鉴于细胞炎症因子在急性胰腺炎发生发展中发挥的重要作用，CLDN4 也有可能通过类似的机制影响 NF B 信号通路，但这还需进一步实验验证。在另一项针对急性肺损伤的研究中，研究者观察到敲低 CLDN4 显著抑制了 NF B 的激活20。这些研究中 CLDN4 对 NF B 的激活作用与本研究观察到的现象一致，本研究为在急性胰腺炎中靶向抑制 NF B 提供了新的思路。4结论总而言之，本研究通过构建急性胰腺炎细胞模型，086Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol22，No7Apr2023发现 CLDN4 能够通过激活 NF B 信号通路促进急性胰腺炎细胞模型的凋亡和自噬。本研究进一步解释了急性胰腺炎发生、发展的分子机制，为急性胰腺炎的诊治提供了新的理论基础。参考文献 1Li H，Lin Y，Zhang L，et al Ferroptosis and its emerging roles in acutepancreatitis J Chin Med J(Engl)，2022，135(17):2026 2034 2Han K，Chen S，Song Y，et al Burden of pancreatitis and associatedrisk factors in China，1990 to 2019:a systematic analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2019J Chin Med 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患者临床特点及治疗效果的关系朱健清蒋小英童玲玲梁霞(玉林市第一人民医院神经内科广西玉林537000)基金项目:广西科技计划项目(编号:2021AA19001)【摘要】目的探讨血清 25 羟基维生素 D 25 (OH)D、白细胞介素 6(IL 6)、CD8 与视神经脊髓炎谱系疾病(NMO