基于高通量测序的湖南特色酒曲中微生物群落分析.pdf

2024 年 4 月第 45 卷第 2 期湘南学院学报Journal of Xiangnan UniversityApr.,2024Vol.45 No.2 119 基于高通量测序的湖南特色酒曲中微生物群落分析付江岚1，王岐本1，吴语暄1，张宇莎1，刘祥1，彭瑜2,*（1.湘南学院 基础医学院，湖南 郴州 423000；2.湘南学院 公共卫生学院，湖南 郴州 423000）摘 要：本研究基于 Illumina MiSeq 高通量测序技术，分析酒曲中微生物菌群的组成和多样性，并利用 PICRUSt 和FAPROTAX 进行功能预测。研究结果表明，白露米酒曲（CB）的物种丰富度、群落多样性均最大。经可操作分类单元分析共检出13个菌门、103个菌属。3种酒曲样本在门、属水平上既有相似性又有差异性。厚壁菌门（Firmicutes）是邵阳大曲（SD）、白露米酒曲（CB）的共同优势细菌门；嘉禾倒缸酒曲（CD）第一优势菌门为变形杆菌门（Proteobacteria）。片球菌属（Pediococcus）是 CD、CB 共同的第一优势菌属；葡萄球菌属（Staphylococcus）是SD 的第一优势细菌属。相似性分析表明菌落组成与环境因素有一定联系。功能预测结果表明，3 种湖南特色酒曲均具有较好发酵潜力。关键词：酒曲；微生物多样性；高通量测序；功能预测中图分类号：R681 文献标志码：A DOI:10.3969/j.issn.1672-8173.2024.02.021湘酒是中国主要酒类区域品牌之一，享有悠久的酒文化历史。酒曲是酿酒的糖化发酵剂，酒曲中微生物的代谢通路和功能酶系在酒产品的质量和风味方面发挥决定性影响 1。因此，湖南地方特色酒曲的研究对湘酒产品的优化至关重要。酒曲中微生物的研究方法主要为传统分离培养和高通量测序。已有研究主要采用传统分离培养方法，但存在低通量、研究范围狭窄等缺陷 2，且无法提供微生物功能关系及代谢途径等信息，相关的深入研究因此受阻。近年来，高通量测序技术发展迅速，被广泛应用于微生物群落的相关分析中。高通量测序技术弥补了传统方法的不足，可以快速、深入地进行高通量、低错误率的相关分析 3-4。利用高通量测序技术，李仍树等 5 分析了四种芝麻香型酒曲的理化特性、微生物群落及功能，揭示了它们对白酒独特风味的不同作用，为进一步优化芝麻香型白酒提供了理论依据。而陈申习等 6 分析了清香、酱香两种不同类型的酒曲真菌群落结构和多样性差异，表明真菌的种类对酒曲的风味有重要的影响，为提升酒曲风味提供了真菌资源方面的参考。已有研究中未见湖南地方特色酒种所用酒曲的针对性研究，本研究将其选为研究对象开展实验和分析，通过高通量测序技术进行了酒曲中微生物菌群的组成与多样性分析，并推测微生物潜在的代谢功能及其酶系，旨在为提高湖南酒曲及酒产品质量提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料与试剂嘉禾倒缸酒曲（CD）、白露米酒曲（CB）：湖南省郴州市某酒厂；邵阳大曲（SD）：湖南省邵阳市某酒厂。DNA 试剂提取盒：德国 Qiagen 公司；AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒，美国 Axygen 公司；PowerSoil DNA Isolation Kit 试剂提取盒：深圳市安必胜科技有限公司；QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统：美国Promega 公司。收稿日期：2024-02-15基金项目：湖南省大学生创新训练项目（S202210545030）；2021 年度郴州市技术研发中心资助（郴科发 2021 57 号）。作者简介：付江岚（2000），男，湖南长沙人，在校本科生；通信作者：彭瑜（1980），女，湖南郴州人，政工师，硕士，研究方向大学生思政教育。120 湘南学院学报2024 年 4 月（第 45 卷）第 2 期1.2 仪器与设备Gel Doc 2000型凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；Pro S聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国 Eppendorf 公司；PowerPac 3000 电泳仪：美国 Bio-Rad 公司；Miseq 高通量测序平台：美国 Illumina 公司。1.3 方法1.3.1 样品采集与处理样品采集自湖南省郴州市、邵阳市两地酒厂，取样时间为 2021 年 8 月。采集完成后装入已标记编号的无菌袋中，编号分别为 CD、SD、CB。冷链运输至实验室，置于-80 超低温冰箱备用。运用高通量测序技术对三种不同酒曲进行检测，每种样品检测 3 次，记为 CD-1、CD-2、CD-3、SD-1、SD-2、SD-3、CB-1、CB-2、CB-3。1.3.2 样品总 DNA 提取及 PCR 扩增使用 PowerSoil DNA Isolation Kit 提取样本 DNA，并通过 1%琼脂糖凝胶电泳进行质量评估。利用NanoDrop 2000 分光光度计测定 DNA 的浓度与纯度。以提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，引物为：338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）、806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。PCR 扩 增 体 系 共20 L,其中含有 5FastPfu 缓冲液 4 L，上下游引物（5 mol/L）各 0.8 L，模板 DNA（10 ng），DNA 聚合酶（0.4 L），余下体积用双重蒸馏水补足。在满足 PCR 扩增条件下 7，使用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒对 PCR 产物进行切胶回收，并通过 Tris_HCl 进行洗脱处理。回收后的产物再次通过 2%琼脂糖电泳进行检测，并利用 QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统进行定量检测。根据实验需求，将产物进行混合。1.3.3 高通量测序采用 Illumina Miseq PE300 平台进行高通量测序分析。通过 Uparse（v7.0.1090）对所有序列进行可操作分类单元分析（operational taxonomic unit,OTU）划分。使用 UCHIME 软件去除嵌合体序列，并通过核糖体数据库项目（ribosomal database project,RDP）分类器 Classifier（v2.11）以 0.7 的置信度阈值对相似度水平为97%的 OTU 进行物种分类分析。根据 OTU 聚类分析结果，采用 Mothur（v1.30.2）进行指数分析，通过 Shannon 指数、Simpson 指数、ACE 指数和 Chao 指数等进行 Alpha 多样性量化分析。Chao 指数和 ACE 指数侧重于体现群落丰富度，Shannon 指数和 Simpson 指数侧重于体现群落均匀度。Chao 和 ACE 指数值越大，物种丰富度越高；Shannon和 Simpson 指数值越大，群落多样性越高 8。采用 R 语言（v3.3.1）工具进行数据分析和绘图。本研究数据分析取 3 次检测数据平均值，以 CD、SD、CB 代指。所有数据结果保留小数点后两位数字。2 结果与分析2.1 高通量测序结果经高通量测序后，根据序列扩增区域 338F_806R 得到原始数据并对其进行优化。优化后样本测序结果如表 1 所示。统计优化后共获得优化序列 415 346，优化序列总碱基数为 176 897 803，平均序列长度为 425 bp，与设计引物扩增长度接近。本研究数据质控合格，可进行后续分析 9。2.2 酒曲样品的 Alpha 多样性分析根据 silva138/16s_bacteria 物种分类数据库进行 OTU 聚类分析，再根据聚类结果进行 Alpha 多样性分析。本研究对 3 种湖南地方特色酒曲中微生物菌群的 Alpha 多样性分析见表 2。Coverage 值可反映测序的深度 10，各样品的 Coverage 值均 0.99，可保证数据反应微生物情况的有效性 11。Simpson 指数值 CBSDCD；Chao 指数值由大到小为 CBSDCD；ACE 指数值由大到小为 CBSDCD。CB 的物种丰富度最高，同时群落多样性也最丰富。2.3 酒曲中微生物菌群的群落组成2.3.1 门水平菌落结构在门水平上，9 个样本中共检出菌门 13 个。参照王清龙等 12 定义平均相对丰度 1.00%的菌门为优势菌门。其中至少在一个样本中丰度大于 1%的共 6 个，按丰度由高到低排序为厚壁菌门（Firmicutes）变形菌门（Proteobacteria）放线菌门（Actinobacteriota）梭杆菌门（Fusobacteriota）蓝细菌门 121 付江岚，王岐本，吴语暄，等：基于高通量测序的湖南特色酒曲中微生物群落分析（Cyanobacteria）拟杆菌门（Bacteroidota）。如图 1 所示，厚壁菌门在 CD、SD、CB 中均分布较高，在SD、CB中为第一优势菌门，丰度分别为56.14%、87.77%；在CD中为第二优势菌门，丰度仅次于变形杆菌门，为 47.31%；变形杆菌门大量存在于 CD 与 CB，丰度分别为 50.09%、7.35%，是 CD 中的第一优势菌门；放线菌门大量分布于 SD，丰度为 43.55%，在 CB 中少量存在，丰度为 0.23%，在 CD 中存在最少；梭杆菌门少量存在于 CB，丰度为 3.25%，在 CD、SD 中几乎未检出；蓝细菌门主要分布于 CD 与 CB 且丰度较低，分别为2.57%、0.12%，在 SD 中少量存在；拟杆菌门在 SD、CB 中丰度分别仅为 0.05%、1.23%，CD 中不存在；另将在所有样品中丰度均小于 1%的门归为未分类菌门（others），未分类菌在 CD 中微量存在，在 SD、CB 中丰度分别为 0.21%、0.06%。研究表明，3 种酒曲间微生物菌门存在差异，且相同菌门的相对丰度也有显著差异。2.3.2 属水平菌落结构在属水平上，9 个样品中共检测出菌属 103 个。参照王清龙等 12 定义平均相对丰度 1.00%的菌属为优势菌属（见图 2）。CD 的优势菌属为片球菌属（Pediococcus）、弗兰科尼杆菌（Franconibacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、克罗诺杆菌属（Cronobacter）、norank_f_norank_o_Chloroplast。SD 的优势菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、短杆菌属（Brevibacterium）、片球菌属（Pediococcus）、糖多孢菌属(Saccharopolyspora）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brachybacterium）、微球菌属（Kocuria）。CB 的优势菌属为片球菌属（Pediococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）、肠球菌属（Enterococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、泛菌属（Pantoea）、芽孢表 2 湖南特色酒曲样本微生物菌群的 Alpha 多样性分析样本Shannon 指数Simpson 指数ACE 指数Chao 指数覆盖率/%CD-12.010.2057.6855.5099.99CD-22.040.1955.9954.8699.99CD-32.190.1860.1858.0099.98SD-12.140.2278.4380.2099.97SD-22.120.23107.1391.0099.96SD-32.030.2677.6976.1499.98CB-11.490.4598.5895.8999.98CB-21.170.55114.7393.8399.95CB-31.140.5890.7692.4399.96表 1 样本测序结果样本优化序列数碱基数 bp平均长度 bp最短序列长度 bp最长序列长度 bpCD-146 91320 089 04142 822321430CD-248 23620 671 52142 855203477CD-345 27319 390 62842 830263431SD-146 80419 719 40742 132277498SD-250 03721 103 72242 176246471SD-347 01019 859 95842 246267507CB-144 57219 060 11342 763277432CB-242 92818 360 45942 770277430CB-343 57318 642 95442 786277430 122 湘南学院学报2024 年 4 月（第 45 卷）第 2 期杆菌属（Bacillus）、Sebaldella、顶端杆菌属（Apibacter）、Clostridium_sensu_stricto_6。各酒曲的菌属组成都存在着较大的差异，片球菌属、乳杆菌属、乳球菌属为 3 种酒曲共有的菌属，其丰度也具有较大差异。CD 中主要细菌属组成与其优势菌属相同，但弗兰科尼杆菌为 CD 所独有；在 SD 中丰度最大的葡萄球菌属（44.25%）在其他酒曲中占比很少以至可以忽略不计。乳杆菌属在 CD 和 CB 中有较大占比，推测对酒品风味物质有较大影响。成林等 13 研究发现乳杆菌、醋杆菌和芽孢杆菌都是影响酒体风味的关键细菌，且均属于厚壁菌门。这与我们的发现一致。在属水平上，我们的研究结果与 Zhao 等 14 研究结果相似，芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属均为优势菌属。但 SD、CB 的共同优势菌属片球菌属在 Zhao 等 14 研究中未见优势。也有文献表明酒曲的优势菌属多为芽孢杆菌属、片球菌属和乳酸杆菌属 12-15。马琳娜等 16 学者指出优势细菌属与特征风味物质之间具有较强的相关性。由此推测乳杆菌属、芽孢杆菌等可能是影响酒产品风味的关键。而不同研究中优势菌属的差异提示其风味可能受到原料、发酵条件等多种因素的影响。图 1 3 种酒曲样品在门水平的微生物菌落组成图 2 3 种酒曲样品在属水平的微生物菌落组成2.3.3 基于 Circos 样本-物种关系图的酒曲微生物菌群的相似性与差异性分析如图 3 所示。CD 和 CB 的第一优势菌属均为片球菌，该菌属在酒曲样本中的占比分别为 33.30%和71.87%；SD 的优势菌属是葡萄球菌属，其占比是 44.25%。片球菌属在 3 种酒曲中所占比重从大到小为CBCDSD，葡萄球菌属仅存在于 SD。研究表明，3 种酒曲既具有相似性又具有差异性。其中，相较于产 123 地为邵阳的 SD，产地同为郴州的 CD、CB 中的微生物具有较高相似性。推测产地与酒曲样品中微生物菌群多样性存在一定联系。乳杆菌属在 CD 和 CB 中有较大占比，分别为 4.12%和 3.19%。乳杆菌属是乳酸菌中的一个重要菌属。乳酸菌不仅通过自身代谢物影响白酒风味，还通过调控酵母的生长和代谢间接提升白酒的风味 17。有研究表明，片球菌属、乳杆菌属提供了发酵所需的酸性环境以及形成有机酸等风味成分 18。本研究中，样品CD 和 CB 中存在该菌种，因此推测对酒品风味物质有较大影响。而 SD 的第一优势菌属葡萄球菌属可以提供酶和抗菌潜力，对发酵过程有促进作用 19-20。2.3.4 PCoA 分析基于主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）分析 3 种不同酒曲中微生物群落结构的相似性和差异性，结果如图 4。由图 4 可知，第一主成分和第二主成分的变异解释率分别为 77.71%和 21.46%。结果显示，CD 和 CB 距离较近且与 SD 距离较远，前两者的微生物群落结构相似性高，微生物组成较为接近，但与 SD 在微生物组成有显著的差异性，推测外界环境与酒曲样品中微生物菌群多样性存在一定联系。图 3 Circos 样本-物种关系图图 4 3 种酒曲样品中微生物菌落的 PCoA 分析2.4 酒曲微生物菌群的功能分析2.4.1 样本个体及整体 COG 功能分析通过 PICRUSt 进行直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）功能分类预测，并绘制功能分类统计柱状图，结果如图 5。由图 5 可知，在 3 种酒曲样本中微生物菌群间进行比较，发现所有样本的 COG 功能组成相似度高。功能注释结果共24类，CD功能性强的前三类分别为，S：未知功能；R：一般功能预测；G：碳水化合物运输和代谢。SD 功能性强的前三类分别为，S：未知功能；E：氨基酸转运和代谢；R：一般功能预测。CB 功能性强的前三类分别为，G：碳水化合物运输和代谢；S：未知功能；J：翻译及核糖体结构与生物合成。除去特征性较差的未知功能和一般功能预测外，3 种样本功能预测结果在碳水化合物转运及代谢、氨基酸转运及代谢方面有较强的表现，CD、SD、CB 分别占比 8.26%，7.32%，11.32%和 7.96%，9.47%，7.17%。代谢产物还原糖、氨基酸等可以参与构成酒类营养物质、风味物质及其前体 21-22，直接影响酒的风味。推测在 3 种湖南特色酒曲样品中，菌群能较好地利用原料中的淀粉和蛋白质，生长代谢及酶系合成较活跃，具有较强发酵潜力 23。付江岚，王岐本，吴语暄，等：基于高通量测序的湖南特色酒曲中微生物群落分析 124 湘南学院学报2024 年 4 月（第 45 卷）第 2 期图 5 COG 功能分类统计图2.4.2 微生物功能预测分析 利用 FAPROTAX 对三种酒曲中的微生物进行功能预测并绘制热图，发现化学异养、发酵、好氧化学异养三个功能在所有样本中表达功能都很丰富，结果见图 6。这些功能多数与物质的代谢有关，分析结果与COG 功能分析结果相同。部分基因在 SD 中表达较弱，在 CD 和 CB 中表达较强。主要为动物共生或寄生、哺乳动物和人类的肠道、所有的人类病原体、叶绿体，植物和某些藻类中的细胞器、植物病原体等。同时可推测 CD 和 CB 酒曲中的微生物功能较为相似，推测结果与 PCoA 分析结果相同。图 6 微生物功能预测 heatmap 图3 结论本研究采用高通量测序技术分析湖南特色酒曲中的微生物菌群，分析酒曲中微生物菌群的群落组成与多样性，并进行组间相似性分析和样品的微生物功能预测。共检测到 13 个菌门和 103 个菌属。CB 物种丰富度和群落多样性最高。厚壁菌门是 SD 和 CB 的共同优势菌门，变形杆菌门是 CD 的主要菌门；片球菌属 125 是 CD 和 CB 的共同优势菌属，葡萄球菌属则是 SD 的主要菌属。相似性分析发现菌落组成与环境因素之间存在一定联系，这进一步验证了微生物菌群与酿造环境之间的相互作用。功能分析结果显示，3 种酒曲样本整体功能集中在碳水化合物转运及代谢、氨基酸转运及代谢，推测其具有良好发酵潜力。参考文献 1 李静心,王艳丽,何宏魁,等.基于高通量测序技术解析高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构 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