栓剂微生物限度检查方法验证方案.doc

Method Validation Scheme
方法学验证方案
栓剂微生物限度检查

Approval Before Execution审核和批准

Written by起草
姓 名
职 务
签 名
日 期

化验员

Reviewed by审核

质检部部长

质管部部长

Approved by批准

质量副总经理

××××××有限公司

目 录

1. 概述 3
2. 目的 3
3. 范围 3
4. 依据 3
5. 责任 3
6. 人员培训 4
7. 所需文件 4
8. 所需仪器仪表校验 5
9. 试验用培养基、稀释剂、冲洗液、菌种及消毒剂 5
10. 验证内容 5
11. 结果分析及评价 9
12. 进度计划 9
13. 再验证周期 10

1. 概述
根据2015版药典要求，在建立某一药品微生物限度检查方法时应对其检查的方法进行验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或生产工艺发生改变时，还应对其检验方法进行重新验证，以确认供试品在该实验条件下无抑菌性或其抑菌活性可忽略不计。
此次验证应进行3次独立试验，所有验证人员都应进行GMP和岗位SOP培训，设备应进行校验。

2. 目的
确保在实际检验条件下“醋酸氯己定痔疮栓”微生物限度检查方法的准确性、有效性和重现性。

3. 范围
适用于“醋酸氯己定痔疮栓”的微生物限度检查方法。

4. 依据
2015年版中国药典四部通则1105、1106、1107微生物限度检查法

5. 责任
姓 名
部 门
职 务
职 责
吴霜
质量
检验部
化验员
起草验证方案，负责验证方案的实施，数据的收集、统计，完成验证报告。
代兵
质量
检验部
部长
审核验证方案，组织验证方案的实施，审核验证报告。
王秀芝
质量
管理部
部长
审核验证方案、报告，协调验证方案的实施。
金霞
工程部
计量员
负责本次验证中仪器仪表的确认。
何笛
公 司
主管副
总经理
批准验证方案，批准验证报告。

6. 培训
所有相关人员均应按如下内容，在验证开始之前进行培训，以使每一名参与验证工作的人员明确自己的职责，更好地完成本次验证工作。
培训内容：
①本次验证的性质； ②验证的内容
③验证小组成员的分工及职责； ④验证方法及职责
⑤取样计划及职责； ⑥验证进度计划安排

7. 所需文件
文件资料
编号
存放地点
菌种传代、储存、接种操作程序
GCZ—Zk—101
质量检验部
2015年版中国药典四部
——
质量检验部

8. 所需仪器仪表的校验
器具名称
规格
型号
器具
编号
校验证
书编号
校验
部门
有效
期至
电热恒温培养箱

生化培养箱

立式压力蒸汽消毒器

电热鼓风机

电热恒温培养箱

9. 试验用培养基、溶剂、冲洗液、菌种及消毒剂验证内容
培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养、甘露醇氯化钠琼脂培养基

稀释剂、冲洗液： pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
试液：0.9%无菌氯化钠、1%二盐酸N，N-二甲基对苯二胺试液
菌种：包括金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，以上菌种应均由中国药品生物制品检定所提供，传代次数不得超过五代。
消毒剂：75%乙醇；3%双氧水。

10. 验证内容
10.1微生物计数法
10.1.1菌种
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
10.1.2菌液制备：
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，30~35℃培养18~24小时，取新鲜培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖琼脂培养基中20~25℃培养2～3天，取新鲜培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基中20~25℃培养5～7天，取黑曲霉的新鲜培养物加入3〜5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。 然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应 在 2 小时内使用；若保 存在2〜8℃，可 在 2 4小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存 在2〜8 ° C ,在验证过的贮存期内使用。
10.1.3供试液：
供试液制备：称取10g供试品，置锥形瓶中，加10ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液置45℃水浴浸泡10分钟使熔融，加无菌聚山梨酯80 10ml，使乳化，再加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，保温，混匀，作为1：10供试液。
10.1.4操作方法
需氧菌、霉菌及酵母菌菌落计数验证方法：验证试验至少进行3次独立的平行试验并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。
阴性对照：取稀释剂10mL按下述检查方法进行。
一、 需氧菌：
1、 金黄色葡萄球菌
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
2、铜绿假单胞菌
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
3、枯草芽孢杆菌
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过3天，计数。
4、白色念珠菌
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
5.黑曲霉
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基上，30~35℃培养不超过5天，计数。
二、霉菌、酵母菌
1、白色念珠菌
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
2. 黑曲霉
（1）试验组：
取1：10供试液9.9 mL加试验菌0.1 mL混匀，滤过，先用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
（2）供试品对照组：
取1：10供试液10mL，滤过，用200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
（3）菌液对照组
在9.9mLPH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加试验菌0.1 mL混匀，滤过，用 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养不超过5天，计数。
10.2控制菌检查方法验证：
10.2.1菌种
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌
10.2.2菌液制备
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基上，30〜35°C培 养 18〜24小时；上述培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在 2〜8°C，可在24小时内使用。
10.2.3供试液
取微生物计数法项下的供试液
10.2.4操作方法：
控制菌验证方法：验证试验至少进行3次独立的平行试验
1.铜绿假单胞菌
（1）取1：10供试液10ml加到200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，分次滤过，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu的大肠埃希菌，取出滤膜，菌面朝上接入制备好的100m l胰酪大豆胨液体培养基中，然后置30~35℃培养18小时。
取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30〜35℃培养 18小时。
将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二 盐 酸 N - N二甲基对苯二胺试液，在 3 0秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
（2）阴性对照组：取10mL稀释液（ PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液）按上述检查方法进行。
（3）阳性对照组：取 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次滤过，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu的铜绿假单胞菌，取出滤膜，菌面朝上接入制备好的100m l胰酪大豆胨液体培养基中，按上述检查方法进行。
2、金黄色葡萄球菌
（1）取1：10供试液10ml加到200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，分次滤过，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu的大肠埃希菌，取出滤膜，菌面朝上接入制备好的100m l胰酪大豆胨液体培养基中，然后置30~35℃培养18小时。
取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30〜35°C培养 18小时。
（2）阴性对照组：取10mL稀释液（ PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液）按上述检查方法进行。
（3）阳性对照组：取 200ml 1%聚山梨酯80PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次滤过，再用700ml冲洗液分次冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml不大于100cfu的金黄色葡萄球菌，取出滤膜，菌面朝上接入制备好的100m l胰酪大豆胨液体培养基中，按上述检查方法进行。
10.4合格标准：
供试品试验三次，三次供试品应符合以下规定：
（1）需氧菌、霉菌及酵母菌菌落计数方法验证：在3次独立的平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌 落数的比值应在0 .5〜2 范围内；阴性对照组应无菌生长。
（2）控制菌检查方法验证：试验组检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。
11. 结果分析及评价
依据测试结果，进行结果分析，得出验证评价，写出验证报告。评估试验过程是否存在偏差，是否引入风险。
12. 进度计划：
时间
内容

起草验证方案

验证领导小组会审

批准验证方案

所需器具、人员培训、文件的确认

验证数据收集、统计、汇总

完成验证报告

验证领导小组会审

主管副总批准

13. 再验证周期：
药品的组份、标准和生产工艺发生改变时，其检验方法要进行再验证。