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博士学位论文熟地黄提取物对衰老小鼠行为学及大脑退行性病变的影响及机 制熟地黄提取物对衰老小乳行为学及大脑退行性病变的影嘀及机制中文摘要目的：衰老是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变 化，年龄相关的大脑退行性病变是大脑中枢神经系统在生长、发育、成熟 之后走向衰老过程中而表现的生物老化的正常生理现象，其最突出的临床 表现是记忆和学习能力下降。地黄是玄参科植物地黄的根部，主要用于补 益肾阴，地黄及以其为主药的方剂具有延缓衰老进程的作用。在本实验中，我们以自然衰老小鼠为研究对象，通过分析熟地黄水提取物（Rehmannia glutinosa Libosch extracts,RGE）对衰老小 鼠的行为学，与衰老相关 的大脑退行性病变及其分子病理机制的影响，研究RGE延缓衰老的生物学 基础。方法：采用自然衰老小鼠为研究对象。研究：（1）应用Morris水迷 官、旷场实验及避暗实验评价RGE对衰老小鼠学习记忆能力变化的影响，应用HE染色研究RGE对衰老小鼠脑海马CA3区神经元密度的影响，BrdU标记（BrdU Labeling）检测RGE对衰老小鼠脑齿状回神经细胞合成及分化的影 响；（2）采用脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠 脑组织细胞凋亡率，分光光度法检测RGE对衰老小鼠脑组织Cu-ZnSOD、MDA 表达水平的影响；（3）采用Southern Blot与端粒重复序列扩增法检测RGE 对自然衰老小鼠的端粒片段长度和端粒酶活性影响；（4）应用real-time PCR、western blot等技术研究RGE对衰老小鼠脑组织）53、,久”基因表 达的影响。结果：使用RGE喂养30日，（1）可明显改善自然衰老小鼠与年龄相关 的行为学改变，提高老年小鼠学习记忆能力，改善衰老引起的海马CA3区 神经元密度降低，提高脑齿状回细胞合成分化率；（2）改善自然衰老小鼠 脑组织中细胞凋亡率；显著增加自然衰老小鼠脑组织Cu-ZnSOD含量，且此 作用与RGE浓度有呈正相关的趋势；但对MDA的表达水平的影响不明显；（3）显著增强自然衰老小鼠脑组织端粒端粒酶活性，与老年对照组相比，RGE湖北中医学除2009届博士学位论文喂养的自然衰老小鼠脑组织端粒长度有显著性变化；（4）抑制自然衰老小 鼠夕21”基因转录，可能通过影响非依赖P53途径的厂基因表达发挥降 低P21蛋白表达量的作用。结论：衰老过程中与年龄相关的大脑退行性变化是主要与遗传因素、氧化损伤、神经细胞凋亡、免疫系统异常、脑组织缺血缺氧等因素关系密 切。中医认为，与年龄相关的神经退行性病变多属中医的“呆病”、“文痴”、“痴呆”、“健忘”等范畴，阴精盛衰与衰老的发生发展密切相关，滋阴补 肾是延缓衰老最重要的手段。地黄是重要的补益肾阴中药，应用熟地黄水 提取物可明显提高老年小鼠学习记忆能力，改善与年龄相关的大脑退行性 变化，其发挥作用的生物学基础可能在于通过提高自然衰老小鼠脑组织抗 氧化剂Cu-ZnSOD含量，增强脑组织细胞端粒酶活性，提高了脑齿状回细胞 合成分化率，减轻衰老过程中氧化损伤引起的DNA损伤，进而通过影响非 依赖P53途径的22rs基因表达，降低调控细胞周期的核心蛋白P21表达，改善自然衰老小鼠脑组织中细胞凋亡及衰老引起的海马CA3区神经元密度 降低，提高老年小鼠学习记忆能力，改善自然衰老小鼠与年龄相关的行为 学改变。关键词：衰老；熟地黄水提取液；端粒；细胞凋亡；P21-afl；p53熟地黄提取物对衰老小鼠行为学及大脑运行性病变的影响及机制AbstractObjective:Aging is the degenerative changes in body tissues and organs functions as the subject grows older.Age-related recession in brain performance is a normal phys io-phenomenon of biological aging of the central nervous system post the periods of growth,development and maturity.The mos t cl inical manifestat ion is the deci ine in learning and memory abi 1 i ty.D i hu d ng(Radix Rehmanniae)is the root of Rehmannia glut inosa Libosch,main benef it is for strengthening the Yin and kidney-1 inked organs.11 is used and also as a major ingredient in medicines,for anti-aging.In this experiment,natural aged mice were used to examine the effects of Rehmannia glut inosa Libosch extracts(RGE)on their behavior,age-related degenerative changes in brain,molecular pathological impacts and to study the biological bas ics of RGE effect on anti-aging.Methods:Natural aged mice were chosen as the study subject.Aims:To examine and to evaluate the effect of RGE on:(1)learning and memory of aged mice by us ing Morris water maze,open-field test and passive avoidance test;neuron dens i ty in hippocampal CA3 area of aged mice by means of Hematoxyl in-Eos in(HE)dyeing;aged mice brain,s dentate gyrus(DG)neurons synthesis and differentiation by 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)Labeling.(2)brain tissue apoptosis(AI)by Tdt-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL);copper/zinc superoxide dismutase(Cu-ZnSOD),ma 1ondia 1dehyde(MDA)expression level in brain t issue of aged mice by spectrophotometric detection.(3)fragment length of telomere and the telomerase activity of natural aged mice by Southern Blot and telomeric repeat in湖北中医学旄2009届博士学位论文amplif icat ion protocol(TRAP).(4)aged mice bra in tissue p5 3,p21wafl gene expression by methods of rea 1-t ime PCR,western blot,etc.Results:After fceding with RGE for 30 days,(1)Improvement was obvious in the age-related behavior of the natural aged mice,increas ing memory ability in learning for elderly mice,improving the aging-caused deci ine in neuron dens i ty in the hippocampal CA3 area,increasing the rate of cell synthesis and different iat ion of brains DG neurons.(2)Improving rate of AI in brain tissues of the natural aged mice;s ignif leant ly increased the content of Cu-ZnSOD in brain tissue of the natural aged mice,the increase was correlatd with RGE concentration,but was not obvious in MDA expression level.(3)Significantly enhancing telomerase activity in the brain t issues of the natural aged mice compared with the elderly control group.Change in the telomere length was pos i t ive in brain t issues of the RGE fed natura1 aged mice.(4)Inhibited p21Mfl gene transcription in the natural aged mice,might had been through the affected gene expression of non-P53 dependent p21wafl,reducing the content of P21 protein expression.Conclusion:The process of aging and age-related degenerative changes in the brain is mainly related to factors of genetics,oxidative damage,neurona 1 apoptosis,immune system abnorma 1 ities,hypoxia and ischemia in brain tissues and others.Traditional Chinese Medicine(TCM)regards the age-related neurodegenerat ive diseases are mostly syndrome of dullness,nerd,Hdement ian and nforgetfulnessM.Strengthening the funct ions of Yin and kidney-1 inked organs is the most important means for Ant i-aging.Application of RGE can obviously increase the memory ability of IV慈地黄提取物对衰老小鼠行为学及大雅运行胜病变的影响及机制learning in elderly mice,and improve age-related degenerative changes in the brain.The effectiveness is biologically based on the possibilities of the increased content of antioxidant Cu-ZnSOD in the brain tissue of the natural aged mice,the enhanced telomerase activity in brain cel Is,the increased rate of cell synthesis and differentiation of brains DG neurons and the reduced oxidative damage caused by DNA destruction during aging.Then through the influence of non-P53 dependent p21W8fl waf 1 expression,to decrease the cel 1 cycle regulat ion for the P21core protein expression,and improving AI in the brain cells of the natural aged mice and deciining the neuron density in hippocampal CA3 area caused by aging.Hence,the memory abi1ity in learning is increased in elderly mice and the age-related changes in behavior of the natural aged mice are improved.Key words:aging;Rehmannia glutinosa Libosch extracts;apoptosis;telomere;p21*afl;P5 3v湖北中医学院2009届博士学住论文英文缩略语及英汉对照名称英文 中文AgingRGEaging 衰老Rehmannia glut inosa Libosch 熟地黄水提取物 extractsMWMMorris water maze Morris 水迷宫HEMDASODBrdUAIHematoxyl in-Eosin 苏木素-伊红ma 1 ond i a Idehyde 丙二醛superoxide dismutase 超氧化物歧化酶5-bromo-2-deoxyur i dine 5-澳-2-脱氧尿昔apoptosis 凋亡指数TUNELTdT-mediated dUTP nick end 脱氧核糖核甘酸末端转labeling 移酶介导的缺口末端标记法DGTRAPdentate gyrus 齿状回telomeric repeat amplification 端粒重复序列扩增法 protocolVI湖北中医学院学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果.除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医学院或其他单位的学位或证书而 使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明.本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担.学位论文作者签名:年 月 日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解湖北中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部份内容，可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可以根据国家或湖北省有关部门 的规定送交学位论文。同意中国优秀博硕士论文全文数据库出版章程的内容.（保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名:导师签名年 月日热地黄提取物对衰老小”行为学及大脑运行性痛变的影幅及机W前 言老年人口已成为整个社会人口比例中增幅最快的群体，2002年人口 抽样调查结果显示，我国65岁及以上老年人口已占调查人口总数的 8.16%,全国65岁及以上老龄人口已达10,482万人。据联合国预测，1990-2020年世界老龄人口平均年增速度为2.5%,同期我国老龄人口的递 增速度为3.3%,到2020年我国65岁以上老龄人口将达1.67亿人，我国 已成为人口老龄化增长最迅速的国家。随着社会老龄化，与衰老相关的各 类疾病的发病率不断上升。衰老(Aging)是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性 变化，其中与年龄相关的神经退行性病变已成为挑战人类健康和生活质 量的主要因素。神经退行性病变是指由于神经元进行性变性死亡导致的 以大脑为主的中枢神经系统损害的神经系统疾病，与年龄相关的大脑退行 性病变是大脑中枢神经系统在生长、发育、成熟之后走向衰老过程中而表 现的生物老化的正常生理现象，其最突出的临床表现是记忆和学习能力下 降，其发生发展主要与遗传因素、氧化损伤、神经细胞凋亡、免疫系统异 常、脑组织缺血缺氧等因素关系密切。中医认为，与年龄相关的大脑退行性变化多属中医的“呆病”、“文痴二“痴呆”、“健忘”等范畴。其病位在脑，与心肝脾肾功能失调关系密切。在我们前期临床及文献研究中发现，精血津液亏虚，脏腑组织萎废是人类 在进入老年期前其最主要的改变，随着时间的推移逐渐出现阴虚气弱、阴 损及阳以及痰浊血瘀之变。随着年龄的增加，机体由精血津液亏虚，阴不 化气而致阴虚气弱，脏腑功能减退而气阴两虚，进而阴阳失调，阴虚火旺，津血运行失常，痰瘀内生，虚实错杂。后期则阴损及阳，阴阳两虚。因此，阴精盛衰与衰老的发生发展密切相关。“故补阴之药，自少至老，不可缺 也”，滋阴补肾是延缓衰老最重要的手段。地黄是玄参科植物地黄的根部(Rehmannia glutinosa Libosch),是 一味重要的补肾中药，主要用于补益肾阴咒研究表明，地黄及以其为主 2李献平，刘敏.六味地黄丸及其类方对家蚕寿命的影响.中国中医基11:111-113.inAlzheimer9sDisease.Progressofanatomicalsciences2005;learningandmemoryofratsandapoptosisofhippocampalcells6HouJC,ZhangCX,YangSL.Effectsofdihuangcompoundon习记忆能力的改善作用.中国实验方剂学杂志.1999;5:29-33.周建政，张永祥，周金黄.六味地黄汤对快速老化模型小鼠(SAM)学力的改善作用.于中药新药与临床药理，2001;12(4)：282-283.陈京萍，周乐全，丁胜元等.六味地黄汤对老年阴虚大鼠学习记忆能南科学技术.，1984,第一版：127-128.张从正撰，张海岑，赵法新，胡永信等校注.儒门事亲校注，郑州：河GrowingbyUnprecedented800,000aMonth.2001.2U.S.CensusBureau.AgingPopulation:World9solderPopulation2003;38(8):843-853.pharmacodynamicsintheelderly.ExperimentalGerontology,1TurnheimK.Whendrugtherapygetsold:pharma-cokineticsand参考文献究RGE延缓衰老的生物学基础。WesternBlotSouthernblot及流式细胞术等分子生物学实验技术，研学及与衰老相关的大脑退行性病变的影响，并使用Real-timePCR、物(RehmanniaglutinosaLiboschextracts,RGE)对衰老小鼠的行为变关系密切，因此，我们拟应用自然衰老小鼠为模型，研究熟地黄水提取究发现，与衰老相关的脑部的神经退行性改变与细胞凋亡及端粒片段的改自然衰老小鼠脑的退行性改变接近于人脑老化的自然进程。近年来研物寿命巴提高机体免疫力，起到延缓衰老进程的作用。药的方剂多能提高衰老动物学习记忆能力，治疗老年性痴呆叫延长动湖北中医学虎2009届博士学住论文熟地货提取物对衰老小鼠行为学及大M送行性病变的影响及机制础医学杂志.1998;4：39.苗明三.(怀)地黄多糖对衰老模型小鼠免疫器官的影响.河南中医.1999;19(3)：30.3湖北中医学庞2009届博士学位论文实验一 熟地黄提取物对自然衰老小鼠学习记忆能力的影响衰老(Aging)是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性 变化，其中与年龄相关的神经退行性病变已成为挑战人类健康和生活质 量的主要因素。神经退行性病变是指由于神经元进行性变性死亡导致的 以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，与年龄相关的大脑退行性变化 是大脑中枢神经系统在生长、发育、成熟之后走向衰老过程中而表现的生 物老化的正常生理现象，其最突出的临床表现是记忆和学习能力下降。自 然衰老小鼠大脑的退行性改变接近于人脑老化的自然进程，因此，本实验 主要以自然衰老小鼠为研究对象，观察熟地黄提取物对衰老小鼠的学习记 忆能力的影响。一、材料与方法1、材料1.1 动物16月龄的小鼠96只，体重43.27 5.41g;7-8月龄小鼠32只，体重 30.61 3.37g,雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院医学实验动物部提 供。1.2 药物和试剂熟地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glut inosa Libosch)根部的炮 制加工品，系鲜地黄制成干地黄后以10%的乙醇为液体辅料在100P的条 件下蒸制3次而得。由湖北省中医院药剂科提供。参照Kwi-0k Oh等方法，制备熟地黄水提取物(Rehmannia glut inosa Libosch extracts,RGE)o 每 100g 熟地黄加入 2000ml 蒸福水 95 煎煮 8hr后，于真空容器内40 P挥干水份，获得40g粉状RGE。将40g粉状 RGE溶解于67ml蒸馆水(终浓度为0.6 g/ml),4 0c储存备用。其中，RGE 主要成份包括氢谷备醇、甘露醇、豆幽醇、梓醇及维生素A等、1.3 仪器4熟地黄提取物对衰老小鼠行为学及大脑运行性病变的影响及机制AEG-220型电子分析天平（Shimadzu,Japan）;Df-206型鼓风干燥 机（北京京通仪器厂）；Morris水迷宫分析系统北京硕林苑科技有限公 司）。2、实验方法2.1 实验分组：小鼠购入后观察一周无异常，随机分成3组：,1组：青年对照组32只，为7-8月龄昆明种小鼠；2组：老年对照组32只，为16月龄昆明种小鼠；3组：RGE低剂量组32只，为16月龄昆明种小鼠；4组：RGE高剂量组32只，为16月龄昆明种小鼠。4组小鼠均按雌雄性别分笼饲养，自由饮食（饲料为湖北省疾病控制 中心提供的标准实验动物全价颗粒饲料），每日定时清洗饲养箱。实验观 察室为开放式，自然光线，温度控制在20-26,湿度控制在40%-70%,保持室内安静。2.2 绐药方法：1组：青年对照组小鼠200ul蒸镭水灌胃/日；2组：老 年对照组，200ul蒸储水灌胃/日；3组：RGE低剂量组，lOOulRGE溶液（终浓度为0.6 g/ml）溶于lOOul蒸馅水后灌胃/日；4组：RGE低剂量 组，200ul RGE溶液（终浓度为0.6 g/ml）灌胃/日。灌胃时间共计30 日（即实际用于指标检测的老年小鼠为17月龄）。实验过程中无小鼠死亡发生。至实验结束时，在末次灌胃2小时后，进行Mori is水迷宫、旷场实验及避暗实验等检测。3、Morris水迷宫测试检测学习记忆能力Morris永迷.宫内设4个盲端，按照离出口由近及远依次是4区、3区、2区、1区，终点有一高出水面的安全平台，水深10cm,温度25 2X2。实验时由计算机自动记录动物从起点游到终点登陆安全平台所需的时间;,并设定3min为游出的最后时限，观察各组小鼠在3min内的游出率（图1）。测试前5天每天对小鼠进行训练，保证训练环境安静，每次训练的时间、地点相同，操作者站于相同位置。训练第一天将受试小鼠放在出口处，使 之爬上3次，让其了解逃离方式，以后每次实验前让小鼠从出口处自行爬 5珈北中原学区2009届博士学位论文上1次，然后放入离出口最近的4区，引导小鼠至出口；之后两天依次由 3区、2区将小鼠引导至出口；第四、五天将小鼠放入1区，引导至出口。第六天当全部青年组小鼠从1区至出口 3min通过时，对各组小鼠进行测 试，观察各组小鼠3min内自行游出率.S 1 Morri水遑含（Morri.Vater 分析系倏4.旷场实跄（open field）与建暗实腌4.1 旷场实验：旷场实验箱为（38 cmx 20 cmM 24 cm）的箱体，箱底画有 25个相等方格。把制作好的。pen field放在光线充足的地方，在底面放 一块透明玻璃，把各组小鼠分别放进。pen field边缘，让小鼠自由爬行，并录下小鼠在open field里面5分钟的行为表现，实验结束将小鼠放入 开阔箱的正中格内，观察小鼠5分钟的活动情况。测定指标包括：正中 央格停留时间；方格间穿行时间；竖起或修饰时间（两前肢离地1cm 以上的时间）。4.2 避暗实验：实验装置（Shuttle box）分为明暗两室，两室之间有 一直径为3 cm的圆洞，暗室底部铜栅通电.训练时先将小鼠放入反应箱 中适应3 min,然后暗室底部铜栅通以40 V、50 Hz交流电，将小鼠背对 洞口放入明室，小鼠进入暗室即受电击.训练时潜伏期180 s者弃去不 用.用药后第1，2.3.5天将小鼠再次放入明室，记录第1次进入暗室 的时间（潜伏期）和5 min内进入暗室的次数（错误次数）.如果5 min内 小鼠未进入暗室，错误次数记为。次，潜伏期记为300 s。5、统计方法6焦地黄桂取也为衰老小现行为学及大虺运行牲旃麦妁影响及机制数据以均数土标准差(嚏土 s)表示，采用SPSS 12统计软件对实验 数据进行分析，多组间数据比较采用方差分析，组间比较采用。检验。P0.05具有统计学意义。二、结果1、小鼠Morris水迷官测试由图2可知，在Morris水迷宫测试中，老年小鼠在3min内的游出率 均明显低于青年对照组(P0.OD；但是，不同剂量RGE组小鼠在3min内 的游出率均高于老年对照组小鼠(P0.05).提示自然衰老小鼠已出现学习 记忆能力减退脑功能的改变，符合与衰老相关的神经退行性改变特征，RGE 则具有提高老年小鼠学习记忆能力的作用。图2 RGE对自然衰老小BLHorris水迷宫潮试SMin通过率的彩晌(n=32)1组：青年对照组；2组：老年对照组；3组：RGE低剂量组；4组：RGE 高剂量组*表示与青年对照组相比P0.01;#表示与老年对照组相比P0.05;#表示与老年对照组相比p0.052、旷场实验与避暗实验2,1旷场实验由图3可知，在旷场实验中，老年小鼠各项指标与青年对照组相比有显7湖北中医学虎2009届博士学位论文著变化，如方格间穿行时间(尸(4.40)=3.12,P 0.05);正中央格 停留时间(户(4,40)=2.06,P 0.05);竖起或修饰时间(尸(4,40)=1.24,P 0.05)o提示17月龄老年小鼠学习记忆能力减退，存在与年龄相关的 大脑退行性改变。经不同浓度RGE喂养4周后的老年小鼠，其正中央格停留 时间与竖起或修饰时间较老年对照组小鼠有显著性改善(户 0.05)。图3 RGE对自然衰老小鼠旷场实验的彭晌(n=32,所有的数据均经过3次独立实验计 算获得)1组：青年对照组；2组：老年对照组；3组：RGE低剂量组；4组：RGE 高剂量组*表示与青年对照组相比P0.05;#表示与老年对照组相比p0.052.2避暗实验由图4可知，在避暗实验中，各老年组小鼠24小时停滞实验的潜伏期与 青年对照组比较有显著性的减少(尸 0.01),经过不同浓度的RGE喂养4 周后的老年小鼠，与老年对照组小鼠相比，24小时停滞实验的潜伏期有显 著性的提高(P 0.01).热地黄梃a物对衰老小现行为学及大用送行性姆克的影响及机制图4 RGE对自然衰老小BUS暗实躲的影响（片32,所有的数据均经过3次独立实验计 算获得）1组：青年对照组；2组：老年对照组；3组：RGE低剂量组；4组：RGE 高剂量组”表示与青年对照组相比P0.01;#表示与老年对照组相比p0.01 三、讨论衰老是生物体维持细胞稳态的能力逐渐下降直至死亡的自然过程，在这个过程中，机体产生包括认知及活动等方面的一系列功能和行为障碍。大量的研究显示人类的记忆功能随衰老而减退，由于记忆构成了其它 许多认知行为的基础，也是认知行为的高级形式之一，在衰老过程中又最 易受损匕 因此，观察和评价个体的记忆和学习能力下降状况是研究衰老 过程的重要内容。年龄相关性的学习记忆功能下降是哺乳动物（从人到啮齿类）的特征。在老年人，包括空间学习记忆和近事记忆能力多种类型的记忆受衰老过程 的影响这些构成了老年人行为改变的核心症状。大、小鼠的空间记忆,尤其是空间参考记忆和工作记忆亦呈年龄相关性减退”久Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）是一种强迫实验动物（大 鼠、小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实 验动物对空间位置觉和方向觉（空间定位）的学习记忆能力。研究显示用 Morris水迷宫检测到的空间参考记忆的轻度减退在11月龄大鼠即可出 9湖北中医学院2009届博士学住论文现；衰老小鼠Morris水迷宫检测结果显示，完成Morris水迷宫任务时，老年小鼠的空间学习记忆能力减退皿，且这种减退的空间学习记忆能力与 探索运动或协调性的损害无关，但与大脑皮质氧化损害有关皿；17月龄 雌性小鼠虽然也能学会Morris水迷宫任务，但较7周龄鼠学习速度慢，且不易分清放置平台的象限和其他象限；25月龄和17月龄小鼠的成绩 均较5月龄小鼠差，且25月龄小鼠又差于17月龄小鼠皿。在本次实验中，我们发现17月龄老年小鼠Morris水迷宫测试3min内的游出率均明显低 于青年对照组，与上述类似实验研究结果一致。旷场实验(open field test)又称敞箱实验，是评价实验动物在新异 环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法，以实验动物在新奇环境 之中某些行为的发生频率和持续时间等反应实验动物在陌生环境中的自 主行为与探究行为；避暗实验则采用经典的“step-through”方案，利用 鼠类的避暗习性及对电刺激的记忆而设计，通过避暗实验来测量小鼠记忆 的成绩。这两种实验与Morris水迷宫实验均是评价学习记忆能力，研究 与年龄相关的大脑退行性变化的经典行为学实验。在本次研究中，旷场实验结果显示，老年小鼠各项指标如方格间穿行 时间，正中央格停留时间，竖起或修饰时间等与青年对照组相比有显著变 化，避暗实验结果显示各老年组小鼠24小时停滞实验的潜伏期与青年对 照组比较有显著性的减少，提示17月龄老年小鼠学习记忆能力减退，可 能存在与年龄相关的大脑退行性改变。经不同浓度RGE喂养4周后的老年 小鼠，其正中央格停留时间与竖起或修饰时间、24小时停滞实验的潜伏 期较老年对照组小鼠有显著性改善。中医认为，与年龄相关的大脑神经退行性变化多属中医的“呆病”、“文痴”、“痴呆”、“健忘”等范畴。其病位在脑，与心肝脾肾功能失调关 系密切。精血津液亏虚，脏腑组织萎废是人类在进入老年期前其最主要的 改变，随着时间的推移逐渐出现阴虚气弱、阴损及阳以及痰浊血瘀之变。因此，“及至老年，天真渐绝，只有孤阳 提示阴虚可能是机体进入老年时期的主要矛盾。而.六七十后阴不足以配阳，孤阳几欲飞越”051,10惑地黄提取物对衰老小泉行为学及大胜遗行性病变的影响及机制提示若阴虚状态一直没有解除，则可能会发展到超出机体的调节能力，内 虚随着年龄的增加，机体由精血津液亏虚，阴不化气而致阴虚气弱，脏腑 功能减退而气阴两虚，进而阴阳失调，阴虚火旺，津血运行失常，痰瘀内 生，虚实错杂，后期则阴损及阳，阴阳两虚。因此，阴精盛衰与衰老的发 生发展密切相关，可能贯穿衰老过程始终，并在机体衰老过程的不同阶段 和不同器官、功能状态的动态变化中发挥重要的作用。“故补阴之药，自 少至老，不可缺也”（14滋阴补肾可能是延缓衰老最重要的手段。地黄是玄参科植物地黄的根部，是重要的补益肾阴中药I。对地黄抗 衰老作用的研究报道多数来自六味地黄及其类方，如杞菊地黄丸、麦味地 黄丸等。研究主要集中探讨地黄对生物体寿命及衰老伴随的学习记忆损害 的作用。六味地黄丸、杞菊地黄丸、麦味地黄丸三个以地黄为主的方剂均 可延长家蚕龄期，提示三方均有延缓衰老的作用“刀；六味地黄汤也具有延 长果蝇生存期、改善老年阴虚大鼠学习记忆能力的作用网；其他以地黄 为主的中药复方也有延长生物体寿命的作用，如二龄蚕康饮（含熟地黄）能显著延长小鼠生存时间201.衰老的一个重要表现是脑退化性变化，常以认知损害为主要特征，地黄复方制剂对衰老过程中的大脑退化性变化有着良好的作用。对快速老 化模型小鼠SAMP8的实验显示，SAMP8记忆获得和记忆保持能力、条件性 回避反应能力及空间记忆能力均明显衰退，长期给予六味地黄汤可提高 SAMP8记忆获得和记忆保持能力，改善其空间记忆能力并部分改善其条件 性回避反应能力；在对老年阴虚大鼠模型的研究中发现六味地黄汤对老 年阴虚大鼠模型的学习记忆能力有改善作用，主要表现为Morris水迷宫 逃避潜伏期延长。除复方制剂外，单独应用熟地黄同样具有改善衰老相 关认知损害的作用，如崔等发现熟地黄能减少丘脑弓状核损毁大鼠跳台实 验的错误次数、延长潜伏期；在Morris水迷宫实验中，熟地黄能缩短大 鼠寻找平台的潜伏期，提高穿越平台的效率，从而全面提高学习记忆能力，因此，熟地黄及以其为主药的方剂多能提高衰老动物学习记忆能力，治疗老年性痴呆训，延长动物寿命在本次实验中，应用熟地黄制作的11湖北中医学院2009届博士学位论文RGE能有效改善自然衰老小鼠的学习记忆能力，起到延缓衰老，特别是改 善与衰老进程有关的大脑退行性变化的的作用，这可能与熟地黄补益肾阴 的功效改善了贯穿于机体自然衰老过程的阴虚状态有关。参考文献1 Turnheim K.When drug therapy gets old:pharma-cokinet ics and pha rmacodynam i c s in the elderly.Experimental Gerontology.2003;38(8):843-853.2 U.S.Census Bureau.Aging Population:World 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