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蛋白质组学方法鉴定HIG-82细胞提取液和人胎盘提取物中的Sa抗原 中国协和医科大学鞋床医学专业毕业论文英文缩略词表RARheu ma to id Ar thr itis类风湿关节炎CTDCo nnec tive Tissu e Disea se结缔组织病RFRheu ma to id Fa c to r类风湿因子AKAAntik er a tin Antibo dy抗角蛋白抗体APFAntiper inu c lea r Fa c to r抗核周因子CCPCy c lic Citr u llina ted Peptide环瓜氨酸多肽2-DETwo-Dimensio na l Elec tr o pho r esis双向电泳PMFPeptide Ma ss Finger pr inting肽质量指纹谱MSMa ss Spec tr o metr y质谱ESI-MSElec tr o spr a y Io niza tio n MS电喷雾电离质谱IPGImmo bilized PH Gr a dients固相pH梯度技术CIDCo llisio n Indu c ed Disso c ia tio n碰撞诱导解离IBTImmu no blo tting Test免疫印迹法IEFIso elec tr ic Fo c u sing等电聚焦HPEHu ma n Pla c enta Extr a c ts人胎盘提取物PADPeptidy la r ginine Deimina se肽基精氨酸去亚氨基酶中国协和医科大学临床医学专业毕业论文摘要Sa抗原/抗Sa抗体系统是近年来发现的对类风湿关节炎（RA）早期 诊断有较高特异性的自身抗体系统。进一步研究Sa抗原和抗Sa抗体系统 的本质不仅有助于更好的推广其在临床上的应用,而且有助于从新的角度 理解RA的发病机制本研究用双向电泳和 Wester n Blo tting的方法分离 和确定Sa抗原，继而用质谱分析鉴定Sa抗原的生化本质。本研究首先从转染有IL-ip的HIG-82细胞和人新鲜胎盘组织两种途 径提取Sa抗原并鉴定其抗原性。HIG-82细胞提取物与抗Sa阳性血清免 疫印迹反应出现55KD阳性条带，与HPE-B的阳性反应条带55/50KD相 似。HIG-82细胞提取物与正常人血清、抗SSA/SSB抗体、抗RNP抗体 及抗Jo-1抗体均不发生反应。HIG-82细胞中含有对RA高度特异性的抗 原成分，这种抗原成分可能就是Sa抗原或相似的蛋白质。利用双向电泳分离Sa抗原粗提物，用标准血清Wester n blo tting双向 电泳凝胶来定位Sa抗原，继而在另一凝胶上进行匹配，得到含有Sa抗原 单一成分的蛋白质点。来源于HTG-82细胞的Sa抗原在2DE上表现为分 子量55KD的一组（5个）蛋白质，来源于HPE-B的Sa抗原在2DE上表 现为分子量50KD的一组（4个）蛋白质。将己被定位的蛋白质点从凝胶上切下后，经过胰蛋白酶胶内酶解后进中国协和医科大学临床医学专业毕业论文行质谱分析。LCESI-MS/MS根据肽谱和序列信息，经数据库检索，结合 蛋白质分子量和等电点信息，对胶内蛋白质进行了鉴定。其中，HIG-82 细胞提取物55KD之胶内蛋白质鉴定为a-烯醇化酶。本研究首次发现了 HIG-82细胞中含有对RA高度特异性的抗原成分（a-烯醇化酶），可能就是Sa抗原或相似的蛋白质免疫印迹与蛋白质组学技术的联合应用，为与自身抗原相关的蛋白质 组研究提供了有效的分析鉴定方法。关键词：类风湿关节炎 Sa抗原 HIG-82细胞系 免疫印迹 双向电泳 电喷雾电离质谱中国协和医科大学喳床医学专业毕业论文Identification of the Sa antigen in HIG-82 cell line and HPE by an integrated proteomics approachAbstractThe Sa a ntigen/a ntibo dy is a r ec ently desc r ibed immu ne sy stem whic h ha s a spec ific ity a nd po sitive pr edic tive va lu e o f a lmo st 98%fo r RA.By no w,a nti-Sa is detec ted by immu no blo tting u sing HPE a s a ntigenic so u r c e,whic h limits its c linic a l va lu e.In this stu dy,we pu r ified the Sa a ntigen a nd a c hieved pa r tia l c ha r a c ter iza tio n o f these pr o teins with MS.In this r esea r c h,the extr a c ts fr o m HIG-82 c ell line tr a nsfec ted with IL-ip a nd hu ma n pla c enta wer e u sed a s a ntigenic so u r c es.Sta nda r d po sitive a nti-Sa ser u m r ea c ted with 55 k Da ba nd in HIG-82 extr a c t,whic h wa s simila r to 55 a nd 50 k Da ba nds o f HPE.Seven o f the nine po sitive a nti-Sa ser u ms r ea c ted with the 55 k Da pr o tein o f HIG-82 extr a t.No ne o f the ser a with spec ific ities a ga inst Ro(SSA),La(SSB),RNP a nd Jo-1 r ec o gnized the 55 k Da pr o tein in immu no blo ts.It wa s su ggested tha t ther e wa s so me a ntigen spec ific fo r RA in HIG-82 extr a t,whic h ma y be the sa me pr o tein a s Sa a ntigen.The a ntigens then wer e sepa r a ted by two-dimensio na l elec tr o pho r esis a nd lo c a lized in po ly a c r y la mide gel by Wester n blo tting with sta nda r d pa tient ser u m.Resu lts fr o m Wester n blo tting o f 2-DE indic a ted tha t the Sa a ntigen fr o m HIG-82 extr a c t wa s a c ha in o f five spo ts o f 55 k Da,a nd the Sa a ntigen fr o m HPE wa s a c ha in o f fo u r spo ts o f 50 k Da.6中国协和医科大学岷床医学专业毕业论文The c o r r espo nding gel ba nds o r spo ts wer e exc ised ma nu a lly with a sc a lpel,digested with tr y psin,a nd su bsequ ently su bjec ted to MS a na ly sis with LC-ESI-MS/MS.The 55 k Da pr o tein o f HIG-82 extr a c t wa s fo u nd to be a lpha-eno la se.The c o mbina tio n o f immu no lo gy a nd pr o teo mic s tec hno lo gy ha s o pened a new a venu e fo r iso la tio n a nd c ha r a c ter iza tio n o f u nk no wn a u to a ntigens.Key Words:Rheumatoid Arthritis Sa antigen HIG-82 Cell Line9Western blotting,2-DE,ESI-MS7中国协和医科大学临床医学专业毕业论文.刖5类风湿关节炎(Rheu ma to id Ar thr itis,RA)是一种以多关节炎为主要临 床表现的致残性自身免疫性疾病，发病2年即可出现不可逆的骨关节破坏 而严重影响劳动力山。在RA病程的早期就使用改善病情抗风湿药物(DMARDs,Disea se Mo dify ing Antir heu ma tic Dr u gs)可 以改善病人的预后，提高长期生活质量，防止、至少延缓出现不可逆性关节破坏及功能障碍 田。因此，早期诊断RA对于选择合适的治疗方案具有指导意义。现行 的美国风湿病学会(Amer ic a n Co llege Rheu ma to lo gy,ACR)RA的诊断标准 中主要依靠临床症状、X线以及类风湿因子(RF)检测。当符合此标准 时病人常已出现骨关节破坏，且RF虽然是一项重要的血清学指标，但并 不特异，且在病程早期常为阴性82。因此，寻找RA的特异抗体是多年 来临床风湿病学家的愿望，同时这种探索也是进一步了解RA发病机制的 一条途径。研究发现：除RF夕卜，其它自身抗体”“刃，包括抗角蛋白抗体(Antik er a tin Au to a ntibo dy,AKA)*习、抗核周因子(AntipeHnu o l6 Fa c to r,APF)16网和抗RA3 3抗体【回I对诊断ra和估计预后有一定价值。近年发 现一种新的自身抗体抗Sa抗体对RA较特异，1994年Despr es等卬1 报道抗Sa抗体对RA诊断的特异性高达98.9%,其在RF阳性和阴性RA 8中国物和医科大学临床医学专业毕业论文患者的阳性率分别为50%和27%,且在早期RA患者中阳性率为23.5%。另外，抗Sa抗体可能是严重RA的血清学指标，与HLA-DR4联合使用 可以极大地提高对RA预后的判断口叫Sa抗原的生化性质尚不清楚。Mena r d（叼等通过从胎盘纯化Sa抗原 的方法得到了部分Sa抗原的氨基酸序列，发现Sa抗原与人Vimentin（Mw 53 600D,PI 5.06）的氨基酸高度同源，这改变了以前认为Sa抗原与抗 fila ggr in自身免疫系统不同的观点。研究显示瓜氨酸是RA血清抗fila ggr in 相关抗体识别的主要抗原决定簇。另一方面，Mena r d1423等研究发现Sa 抗原的抗原表位也与瓜氨酸密切相关。他们通过IBT在ECV3 04细胞系 中发现与Sa相关的特异性条带，而用兔多克隆抗瓜氨酸抗体也同样能出 现这一条带。进一步的研究发现小牛血清白蛋白、总组蛋白、碱性髓鞘蛋 白等在体外被PAD（肽基精氨酸去亚氨基酶，peptidy la r ginine deimina se）瓜氨酸化后都能产生RA特异性的抗原表位。他们由此通过PCR克隆了 vimentin基因，并且在体外用PAD对其表达重组体进行瓜氨酸化，通过 差异吸附证明了它就是Sa抗原（待发表）。另外，Esc a lo na等通过免疫亲和层析纯化人胎盘提取物，在IBT 上表现为分子量68、50、46KD的三条带。他们用Pr o c ise 494测序仪（Per k in-Elmer公司）对这些抗原进行了部分序列分析，结果发现68KD 条带的氨基酸序列与DEPKXEVP相关，其中X表示可变氨基酸，但是在 SwissPr o t和Tr EMBL数据库中没有检索到任何与这一序列相关的资料；9中国协和医科大学临床医学专业毕业论文而50KD条带抗原无法直接测序，他们认为可能是由于氨基末端处于封闭 状态。最近，我们科宣天明利用双向电泳和免疫印迹法初步确定Sa抗原 为一组(6个)具有相近分子量(mW)和不同等电点(pl)的蛋白质混 合物。将每个蛋白质点用胰蛋白酶酶解成肽段后，用MALDI-TOF-MS结 合肽质量指纹谱的方法进行鉴定，在ExPASy数据库检索的结果显示这 六个蛋白质点中有五个与锌指蛋白(zinc finger pr o tein)有关，t*与蛋 白激酶 C(pr o tein k ina se C)有关。究竟Sa抗原与Vimentin之间有什么样的关系？为什么免疫印迹中的 Sa抗原条带具有多态性？Sa抗原的生化本质究竟是什么？带着这些问 题，我们应用免疫印迹与蛋白质组学技术相结合的方法进一步研究Sa抗 原/抗Sa抗体系统。Sa抗原最初在人脾中发现，后发现其在人胎盘中含量更丰富、更易 获得，且抗原降解少，故目前Sa抗原几乎均来自HPE。Sa抗原还存在于 RA患者滑膜血管翳，同时在滑液中可检测到抗Sa抗体!2旬。基于这一认 识，除了按照传统方法从人胎盘提取Sa抗原外，我们试图提取滑膜来源 的Sa抗原。但是滑膜组织来源困难，量又少，不太适合本研究，所以我 们选择了 MFG-hIL-1P neo HIG-82细胞，即逆转录病毒重组体 MFG-hIL-ipneo转染的兔滑膜成纤维细胞系(HIG-82)。HIG-82细胞株 明来自兔膝关节滑膜组织，可以被IL-1等刺激因素激活，激活的细胞能 够分泌胶原酶(c o lla gena se明胶酶(gela tina se)、前列腺素E2(PGE2)10中国协和医科大学蛤床医学专业毕业论文等，一方面能促进软骨细胞增生，另一方面也能促进自我生长【49。转染有 IL-lp的HIG-82细胞常用于关节炎动物模型的造膜过程，所以我们认为 这种细胞可能含有与RA滑膜组织相似的成分。20世纪90年代发展起来的双向电泳(2DE)和生物质谱(ma ss spec tr o metr y,MS)是目前最好的分离和鉴定蛋白质的技术，已经被广泛的 用到功能基因组和蛋白质组研究中。目前蛋白质组研究的手段主要是高通 量2DE进行蛋白质分离，再用专业计算机软件进行图象分析，然后通过 MS技术(包括ESI-MS和MALDI-TOF-MS)及蛋白质数据信息处理技术 对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。双向电泳利用蛋白质的两种不同物理 化学性质将蛋白质混合物进行分离。首先，根据等电点(pl)的差异将不 同蛋白质在第一向进行分离，称为一向等电聚焦(iso elec tr ic fbc u sing,IEF)；然后根据分子量的差异进一步使蛋白质在第二向进行分离，称为二向 SDS-PAGE电泳。经过两步分离后能在一张凝胶上产生数千至上万个点，而每一个点基本上对应于样品中单一蛋白质组份，并且可以得到特定蛋白 质的等电点、分子量以及含量等信息。80年代出现的固相pH梯度技术(immo bilized pH gr a dients,IPG)使不同批次不同实验室的双向电泳具有 很好的重复性，从而使蛋白质组研究和蛋白质组数据库的建立成为可能。我们利用双向电泳分离Sa抗原粗提物，用标准血清Wester n blo tting 双向电泳凝胶来定位Sa抗原，继而在另一凝胶进行匹配，这样可以得到 含有Sa抗原单一成分的蛋白质点。将己被定位的点从凝胶上切下胶内酶n中国协和医科大学Ha床医学专业毕业论文解后进行质谱分析。这里我们采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱（LC-ESI-IT-MS/MS）,ESI-MS/MS的优点在于不仅获得每一肽段的分子 量，还可测定肽段的氨基酸序列，从几个肽段的序列信息即可鉴定蛋白质，比肽质量指纹谱（PMF）专一。在ESLMS/MS分析中，多肽混合物被ESI 源电离后，第一级MS选择特定m/z的多肽离子通过并进入碰撞活化室，与惰性气体碰撞发生碰撞诱导解离（Co llisio n Indu c ed Disso c ia tio n,CID）生成碎片离子，即N端碎片离子系列（b系列）和C端碎片离子系列（y 系列），第二级MS对裂解生成的碎片离子进行分析，得到肽段的MS/MS 图谱，应用Sequ est软件与数据库中多肽的理论MS/MS裂解图谱进行比 较，就可以得到肽段的氨基酸序列。分析肽谱和各肽段的氨基酸序列，经 数据库检索，结合双向电泳分离获得的蛋白质分子量和等电点信息，可以 对待测蛋白作出鉴定。另外，基于LC-MS分析混合蛋白质的能力，我们同时进行单晌 SDS-PAGE分离Sa抗原粗提物，然后根据 Wester n blo tting确定的分子量，将目标蛋白条带切下，胶内酶解后直接进行质谱分析。中国协和医科大学临冰医学专业毕业论文材料和方法一、从人胎盘提取Sa抗原（DE52阴离子交换层析）A.主要试剂1.氯化钠（Na Cl）（北京化工厂）2.三羟甲基氨基甲烷（Tr is）（北京方润生物中心）-3.氢氧化钠（Na OH）（北京化工厂）4.叠氮钠（Na N3）（北京化工厂）5,盐酸（HC1）（北京化工厂）6.DE52 200mM Na Ch 0.02%Na N3)3)洗脱液 B(PH7.4,50mM Tr is,3 00mM Na CL 0.02%Na N3)4)洗脱液 C(PH7.4,50mM Tr is,LOM Na CL 0.02%Na N3)4.透析液(含0.15mMPMSF的蒸储水)、5.样品裂解液(Ur ea 8M,Thio u r ea 2M,CHAPS 4%,PMSF DTT LOmM)6.Bmdfbr d贮存液：3 50 mg考马斯亮蓝G-250染料100 ml 95%乙醇200 ml 88%磷酸7.Br a dfo r d 工作液：425 ml ddH2O15 ml 95%乙醇3 0 ml 88%磷酸3 0 ml Br a dfo r d 贮存液Wha tma n 1号滤纸过滤D.实验步骤中国协和医科大学临床医学专业毕业论文1.DE52的活化：100克DE52在1500ml活化液1中浸泡20分钟，布氏漏斗抽滤，并用蒸镭水洗 至中性（PH 8.0）,抽滤至干。移至烧杯中，1500 ml活化液2浸泡20分钟，抽滤，并用蒸储水洗至中性（PH 6.0）,抽干移至烧杯中，匀浆缓冲液平衡过夜。2.Sa抗原的提取（所有操作均在4进行）：1）将50克新鲜的人胎盘剪成2y mm小块，匀浆缓冲液漂洗3次除去血液，加 入4倍体积的匀浆缓冲液，在预冷的组织匀浆器中匀浆（避免过度剧烈匀浆，2500r pm,匀浆30秒，静置2分钟，共10次）。2）磁力搅拌器搅拌60分钟，lOOOOr pm离心60分钟，取上清液在匀浆缓冲液中 透析18小时，每6小时换液一次。3.低压层析阴离子交换法纯化Sa抗原：1）取100g活化后的DE52装柱（46c mx2.4c m,容积200ml）,用匀浆缓冲液平 衡层析柱至UV值及电导值均保持稳定。将透析后上清液50ml加入柱中，流 速0.5ml/mim 用匀浆缓冲液洗涤直至UV值及电导值均保持稳定，收集蛋白 峰（UV0.2）出现的滤过液。2）分别用洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C进行阶段梯度洗脱，流速3 ml/min,直 至UV值及电导值均保持稳定，收集各蛋白峰（UV0.2）出现的滤过液、计 算回收率。3）再用匀浆缓冲液平衡，直至UV值及电导值均保持稳定，以备DE52下次使用。4.冷冻干燥1）将B滤液装入透析袋中，在预冷的含0.15mM PMSF的2升透析液中透析24-3 6 小时（每6小时更换一次透析液）以充分脱盐。2）将已脱盐的液体冷冻干燥24小时，粉剂抗原密封包装，-80口冰箱保存。5.制备HPE-Sa溶液1）称取20mg粉剂HPE-Sa抗原初提物在1ml样品裂解液中充分溶解。2）4下15000r pm离心3 0min,取上清，分装180保存。6,Br a dfo r d法测定蛋白浓度。15中国协和医科大学临床医学专业毕业论文1）将蛋白质溶液转移至1.5 ml Eppendo r f管中（最大体积100 pl）2）补加PBS至终体积为100 W3）加入1 ml Br a dfo r d工作液震荡混匀4）在2 01沁后测八5”值，测量在1 hr内完成二、从HIG-82细胞提取Sa抗原A.主要试剂1.氯化钠（Na CD（北京化工厂）2.氯化钾（KC1）（北京化工厂）3.磷酸氢二钠（Na zHPO4T2H2。）（北京化工厂）4.磷酸二氢钾（KH2P。4）（北京化工厂）5.F12（Ha m）培养基（GIBCOBRL）6.胎牛血清（FBS）（Hy Clo ne）7.胰蛋白酶（GIBCO）8.青霉素钠（华北制药股份有限公司）9.硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）B.主要器材1.MFG-hIL-1 p-neo-HIG-82细胞由美国匹兹堡大学医学院矫形外科Fer gu so n实 验室要庆平博士惠赠。2.恒温 CO2 孵箱（SHELDON MANUFACFACTURING INC）3.超净台（北京仪器设备一厂）4.相差显微镜（OLYMPUS日本）5.高速低温离心机（Hita c hi,20PR-52日本）C.溶液的配制1.F-12（Ha m）培养基：将DMEM粉末10g,Na HCO3 1.176g溶于800ml双蒸水中，加入青、链霉素母液各10mL调节PH至727.4。双蒸水定容至1L，用装有16中国协和医科大学船床医学专业毕业论文0.22pm滤膜的滤器过滤后分装，4保存。2.培养液：F-12培养基+10%FBS+100u l/ml青、链霉素。3.D-Ha nk s 液：Na Cl 8g,KC1 0.4g,Na2HPO4-7H2O 0.09g,KH2Po4 0.06g,Na HCO3 0.3 5g溶于IL双蒸水中，室温搅拌4小时，装瓶备用。4.消化液：胰蛋白酶粉末0.25g,溶于100mlD-Ha nk s液中，G.22ru微孔滤膜过 滤后分装，-2Q口保存。工 细胞裂解液（Ur ea 8M,Thio u r ea 2M,CHAPS 4%,PMSF L5mM,DTT 60mM,Chy mo sta tin,Leu peptin,Anti pa n,Pepsta ntin（CLAP）各 5Rg/ml）6.PBS（8g Na Cl,0.2g KC1,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2 PO4 力口入 800ml H2O 中，HC1调PH值至7.4,定容至IL。）D.实验步骤1.MFG-hIL-1 p-neo-HIG-82 细胞的复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37口水浴中溶解，离心除去冻存液，加入 含10%胎牛血清的F12培养液洗涤2次，转入培养瓶内。2.细胞传代MFG-hIL-1 p-neo-HlG-82 细胞系在 F-12 培养基+10%FBS+100u l/ml 青、链霉素，370,5%CO2的培养条件下，每3天换液,每57天按1:41:5传代。细胞长满V-培养瓶底后，弃去培养液，PBS清洗，加入少许消化液，室温放置2分钟，加入 2-3 mL培养液，吸管吹打细胞，使其完全从瓶壁脱落，再加入足量培养液，分别 装入4-5个培养瓶中。3.从HIG-82细胞中提取抗原1）待培养瓶中的细胞长满后，弃去培养液，PBS清洗，加入少许消化液，室温 放置2分钟，加入2-3 mL培养液，吸管吹打细胞，使其完全从瓶壁脱落，转 移至离心管，至收集到IO?细胞数时，可提取蛋白。2）2500r pm离心2。分钟，弃上清液。再加入PBS清洗，2500r pm离心20分钟，弃上清液，重复23次。3）加入细胞裂解液300口1,转移至0.5ml EP管中，冰浴振荡1小时。17中国协和医科大学临珠医学专业毕业论文4）4口，15Q00r pm离心1小时，吸取上清，即可得HIG-82提取液，-80口保存。4.Br a dfo r d法测蛋白质浓度三、Western blotting鉴定抗原性A.主要试剂1.丙烯酰胺（电泳级）（Sigma）2.N,K.亚甲双丙烯酰胺（广州化学试剂厂）3.Tr is 碱（Gibc o br l）4.SDS（十二烷基磺酸钠）C Sigma）5.TEMED（Sigma）6.过硫酸胺（Ser va公司）7.甘油（北京化工厂）8.溟酚蓝（上海化学试剂总厂）9.甘氨酸（北京市方润生物中心）10.浓盐酸（北京化工厂）11.甲醇（北京化工厂）12.冰乙酸（北京市化学试剂厂）13.DTT（Mer c k）14.低分子量 Ma r k er（Amer sha m）15.脱脂奶粉（荷兰）16,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体（Ja c k so n,中山公司）17.氨基黑（Sigma）18.PVDF膜（0.45u m）（PALL）19.3,3-二氨基联苯胺（DAB）（Sigma）20.30%过氧化氢（北京化工厂）21.Tween-20（Amr esc o）18中国协和医科大学临床医学专业毕业论文B.主要器材L 各种抗体阳性血清均来自协和医院风湿免疫内科2.微型凝胶电泳装置（Ther m。EC250-90）3.水平摇床（北京市六一仪器厂，WD-9405B）4.方向摇床（海门市麒麟医用仪器厂，TS-92）5.PCR 仪（PTC100,MJ）6.半干转印仪（Bio-Ra d）7.滤纸（Wha tma n 3 号）8.塑封机、塑封袋C.溶液的配制L 3。%丙烯酰胺（将3 0g丙烯酰胺和0.8g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于体积为100ml 的水中。用滤纸或滤器过滤除菌，置棕色瓶中保存于4口）2.10%SDS（lOgSDS加去离子水定容至100mD3.分离胶缓冲液：1.5M,PH8.8 Tr is-HCI（在80ml水中加Tr is碱18.167g,用浓 盐酸调pH至8.8,定容至100ml）4.积层胶缓冲液：0.5M,PH6.8 Tr is-HCl（在80ml水中加Tr is碱6.05g,用浓盆 酸调pH至6.8,定容至100ml。）5.10%过硫酸胺（APS）（0.1内溶于1向,4gSDS,16ml 甘油，0.16g 澳酚蓝加水定容至40ml）8.电泳缓冲液（5x）（去离子水中溶解15.1g Tr is碱和72g甘氨酸，然后加入50ml 10%SDS储存液，加水定容至1000ml）9.固定液（50ml乙醇+10ml冰乙酸+40ml去离子水）10.胶体考马斯亮蓝染液（Co llo ida l Co o ma ssie Blu e）终浓度用量(1000ml)磷酸（85%）2%(w/v)14ml19中国协和医科大学雁床医学专业毕业论文硫酸钱6%(w/v)60gG-2500.1%(w/v)1g1）称G-2501g于20ml水中充分溶解2）量取14ml磷酸（85%）于900ml去离子水中3）称60g硫酸锈于2）磷酸溶液中完全溶解4）缓慢逐滴加入20ml G-250溶液，边加边搅拌5）定容至1L11.转移缓冲液（称取2.9g甘氨酸、5gTr is碱、0.3 7g SDS,并加入200ml甲醇,加水定容至1升）12.TBS（Tr is 50mM Na Cl 150mM,PH 7.5）13,封闭液（含5%脱脂奶粉、0.05%Tween20的TBS）14.洗涤液（含0.1%Tween20的TBS）15.底物液（6mgDAB溶于l0mlTBS中，使用前加入104 30%比02）16.氨基黑染液（0.1%氨基黑/25%异丙醇八0%乙酸）17.氨基黑脱色液（25%异丙醇/10%乙酸）D.实验步骤1.单向聚丙烯酰胺凝胶电泳（1-DSDS-PAGE）1）根据厂家说明书安装玻璃板。、2）确定所需凝胶溶液的体积（下表），在小烧杯中配制一定体积的分离胶溶液。SDS-PAGE 12%分离胺和5%浓缩胶的配制3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注积层胶所需的空间（梳配方成分12%分离胶(10ml)5%浓缩胶（5ml）去离子水333430%丙烯酰胺4.00.83Tr is-HCRk SM,PH8.8)2.5Tr is-HCl(0.5M,PH6.8)一0.63一 _-10%SDS0.10.0510%过硫酸胺0.10.05TEMED0.0040.00520中国协和医科大学临床医学专业毕业论文子的齿长再加1c m）。用加样枪在丙烯酰胺溶液上覆盖一层饱和正丁醇，将凝 胶垂直放置于室温下。4）分离胶聚合完全后（30分钟），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部 数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能除去凝胶上的液体，再用滤纸的边缘 吸尽残留的液体。5）按上表配方配制积层胶，缓缓倒入已聚合的分离胶上，立即在积层胶溶液中 插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的 空隙，将凝胶垂直放置于室温下。6）当积层胶发生聚合时，可把样品置于1SDS凝胶加样缓冲液中（临用时每10g 体系中加入1MDTT2kD,于PCR仪中100加热4分钟以使蛋白质变性。7）积层胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子，立即用电泳缓冲液洗涤加样 槽以除去未聚合的丙烯酰胺。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入电泳 缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。8）用微量加样器按预定顺序加样，每加完一个样品应在下槽缓冲液中洗涤加样 注射器，在所有不用的样品孔中加上等体积的SDS加样缓冲液。9）将电泳装置与电源相接，开始为恒压3 0V,当样品进入分离胶后，把电压提 高到8CM00V,继续电泳直至溟酚蓝到达分离胶底部（约3小时），然后关闭 电源。10）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，将凝胶翻入固定液中固定1-2 小时。11）胶体考马斯亮蓝染液室温染色过夜。12）回收染液以备后用，凝胶用去离子水漂洗脱色。2.电转印1）当SDS-PAGE行将结束时，用蒸储水淋洗石墨板，然后用不被吸收的纸巾擦 干电极板上粘附的液滴。2）戴上手套,切6张Wha tma n 3 MM滤纸和1张PVDF膜，其大小都应与凝胶 大小完全吻合，用软铅笔在膜上作好标记。中国协和医科大学临床医学专业毕业论文3）PVDF膜先用甲醇固定10分钟，然后与6张3 MM滤纸一起浸泡在转移缓冲 液中。4）戴上手套按如下方法安装半干转移装置：a.平放底部电极（阳极），石墨一 边朝上。b.在这一电极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3 MM滤纸，逐张 叠放，精确对齐，然后用一玻璃管作滚筒以挤出所有气泡。c.把PVDF膜放 在3 MM滤纸堆上，要保证精确对齐，而且在3 MM 滤纸与硝酸纤维素滤膜之 间不留有气泡。d.从电泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝胶的玻璃，把凝 胶转移到一盘转移缓冲液中略为漂洗一下然后准确平放于PVDF膜上，排除 所有气泡。e.把最后3张3 MM滤纸放在凝胶上方，同样须确保各层精确对 齐并不留气泡。5）将靠上方的电极（阴极）放在夹层物上，石墨一边朝下。连接电源。根据凝胶面 积0.65mA/c m2接通电流，电转移L52小时6）断开电源并拔下槽上插头、从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层。把凝胶 转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，以便检查蛋白质转移是否 完全。7）切下结合有Ma r k er的PVDF膜，氨基黑染色至显色（1-2分钟），脱色液脱色，观察转印效果。、3.免疫印迹反应1）封闭：已转印的PVDF膜在含有5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2小时。2）弃去封闭液，洗涤液清洗后把PVDF膜切成小条，做好标记。3）把PVDF膜放入可以加热封接的塑料袋中，按膜面积加入O.SmVc m?的封闭液 和阳性血清（一抗，稀释度1:30）,尽可能排除气泡后客封袋口，平放于摇摆 平台上室温摇动2小时。4）剪开塑料袋，弃去液体，洗涤液漂洗3次，每次10分钟。5）把PVDF膜放入塑料袋中,按膜面积加入0.5ml/c m2的封闭液和辣根过氧化物 酶标记的羊抗人IgG抗体（二抗，稀释度1:5000）,平放于摇摆平台上室温摇 动2小时。22中国协和医科大学临床医学专业毕业论文6）重复步骤4）。7）显色：加入底物液，轻轻摇动观察反应，待阳性血清显色清晰后立即加入PBS 终止反应。最后用去离子水漂洗，风干。8）根据蛋白标准低分子量Ma r k er鉴别每个血清标本的55/50KD显色条带。四、双向电泳（2DE）与免疫印迹（Western bloting）A.主要试剂1.Ur ea(Sigma)2.CHAPS(Sigma)3.IPG c o ver flu id(Amer sha m)4.碘乙酰胺(Sigma)5.低分子量 Aga r o se(Sigma)B.主要器材1.IPGpho r TM 等电聚焦系统(Amer sha m Pha r ma c ia bio tec h)2.Ho efer TM SE 600 垂直电泳系统(Amer sha m Pha r ma c ia bio tec h)3.冷凝循环水装置4.扫描仪(UMAX)C.溶液的配制1.重泡涨液(Rehy dr a tio n bu ffer)Fina l c o nc entr a tio nAmo u ntUr ea(FW 60.06)8M12 gCHAPS2%(w/v)0.5gDo u ble distilled H2Olb 25ml分装贮存于-20口。2.平衡液 SDS equ ilibr a tio n bu ffer)Fina l c o nc entr a tio nAmo u nt1.5 M Tr is-HCl pH 8.850 mM6.7 mlUr ea(FW 60.06)6M72.07 gGly c er o l30%(v/v)60 ml23中国协和医科大学临床医学专业毕业论文分装10m管贮存于-20 口。3.凝胶贮存液（Gel sto r a ge so l口tio n）SDS(FW 288.3 8)2%(v/v)4.0 gDo u ble distilled H2OTo 200 ml4.琼脂糖封顶液(Aga r o se sea ling so lu lio n)Fina l c o nc entr a tio nAmo u nt1.5 M Tr is-HCl pH 8.8lx50ml10%SDS0.1%2mlDo u ble distilled H2OTo 200 mlD.实验步骤1.第一相：等电聚焦1）上样体系：11c m胶条（PH3-10）Fina l c o nc entr a tio nAmo u ntAga r o se,LMP0.5%0.1g0.2%Br o mo pheno l Blu eAbo u t 500 glelec tr o pho r esis bu ffer(l x)20 ml2）上样体系准备好以后，在旋涡混合器上振荡混匀，12,000 r pm离心去除振荡 产生的气泡。从酸性端开始上样，逐渐向碱性端移动连续滴加，加样时避免 产生气泡。从酸性端撕去胶条的保护膜，用眼科慑夹住胶条碱性端末端无胶 处，将其胶面向下缓慢放入胶槽中，放的过程中也要避免产生气泡。使液体 在胶槽两个电极间连续分布，且一定要没过电极。放好胶条后在其上加适量 IPG Co ver Flu id,保证为一连续油层将其下的胶条和液体完全盖住 盖上盖 将其放在电泳仪电极平板上，保证胶槽的两电极与平板电极接触。3）电泳条件Fina l c o nc entr a tio nAmo u nt(gl)Pr o teinRehy dr a tio n bu fferDTT(2M)20mM2kliIPG bu ffer0.5%(v/v)1M10.2%Br o mo pheno l Blu eTr a c e0.5 plTo ta l vo lu me200HStepVo lta geStep du r a tio nSI3 0 V12