特发性肺泡蛋白沉积症血清学标记物及血清脂代谢特点.pdf

分类号：R56密级：单位代码：10422学号：20062303070硕士学位论文（专业学位）论文题目：特发性肺泡蛋白沉积症血清学标记物及血 清脂代谢特点Serum Ma rkers a nd Lipid Meta bolism in Idiopa thicPulmona ry Alveola r Proteinosis _山东大学硕士学位论文目录中文摘要.1ABSTRACT.3符号说明.6第一部分.8抗GM-CSF抗体在特发性肺泡蛋白沉积症诊断及监测中的意义.8前言.91.实验材料.101.1 主要生化试剂及抗体.101.2 试剂盒.101.3 主要仪器及设备.102.对象与方法.112.1 病历资料及标本.112.2 血清抗GM-CSF抗体测定.122.3 血清SP-D、YKL-40水平测定.142.4 血清LDH、CEA水平测定.152.5 肺功能测定.152.6 数据分析.153.实验结果.153.1 抗GM-CSF抗体及ELISA试剂盒测定.153.2 IPAP组患者人口学特征.173.3 IPAP组患者血清抗GM-CSF抗体水平明显升高.183.4 IPAP组及疾病对照组患者LDH水平升高.193.5 IPAP组CEA水平较疾病对照组升高.193.6 IPAP组及疾病对照组患者血清SP-D水平升高.193.7 IPAP组及疾病对照组患者血清YKL-40水平升高.203.8 抗GM-CSF抗体水平与疾病严重程度指标及是否需WLL治疗无关.21山东大学硕士学位论文3.9I PAP患者血清LDH、CEA、SP-D及YKL-40水平与肺功能、血气指标的关 系.224.讨论.285.结论.30第二部分.31特发性肺泡蛋白沉积症血清脂代谢特点.31前言.321.实验材料.331.1 主要生化试剂及抗体.331.2 主要仪器及设备.332.对象与方法.332.1 病历资料.332.2 肺功能测定.342.3 血脂及其他血清学指标测定.342.4 数据分析.343.试验结果.353.1 正常对照组及IPAP组特征.353.2 IPAP患者血清脂代谢特点.373.3 APAP患者血清抗GM-CSF抗体水平与血脂指标无直线相关关系383.4 血脂指标与LDH、CEA水平无直线相关关系.383.5 HDL-C与P(A-a)O2呈负相关关系.383.6 血脂指标与WLL治疗需要的关系.394.讨论.395.结论.44参考文献.45综述.49肺泡蛋白沉积症研究进展.49参考文献.57致谢.642山东大学硕士学位论文CONTENTABSTRACT in CHINESE.1ABSTRACT.3SYMBOL DESCRIPTION.6PART ON E.8Anti-GM-CSF Antibody in Idiopa thic Pulmona ry Alveola r Proteinosis.8INTRODUCTION.81.MATERIALS.101.1 Regents a nd a ntibodies.101.2 ELISA kits.101.3 Instruments.102.METHODS.112.1 Pa tients.112.2 Mea surement of serum a nti-GM-CSF a ntibody.122.3 Mea surement of serum SP-D a nd YKL-40.142.4 Mea surement of serum LDH a nd CEA.152.5 Pulmona ry function test.152.6 Sta tistics.153.RESULTS.153.1 Test of a nti-GM-CSF a ntibody a nd its ELISA kit.153.2 Demogra phic fea ture.173.3 IPAP pa tients ha ve higher serum a nti-GM-CSF a ntibody level.183.4 IPAP a nd disea se control pa tients ha ve higher serum LDH levels.193.5 IPAP pa tients ha ve higher serum CEA level tha n disea se control group 193.6 IPAP a nd disea se control groups ha ve higher serum SP-D level.193.7 IPAP a nd disea se control groups ha ve higher serum YKL-40 level.203.8 Anti-GM-CSF a ntibody is not rela ted to disea se severity ma rkers a ndca nnot predic the need for WLL trea tment.213山东大学硕士学位论文3.9 Rela tionship a mong LDH,CEA,SP-D a nd YKL-40 levels,pulmona ryfunction test a nd a rtery blood ga s test in IPAP group.224.DISCUSSION.285.CONCLUTION.30PART TW O.31Lipid Meta bolism in Idiopa thic Pulmona ry Alveola r Proteinosis.31INTRODUCTION.321.MATERIALS.331.1 Regents a nd a ntibodies.331.2 Instruments.332.METHODS.332.1 Pa tients.332.2 Pulmona ry function test.342.3 Serum lipids a nd other ma rkers.342.4 Sta tistics.343.RESULTS.353.1 Demogra phic fea ture.353.2 Lipid meta bolism in IPAP pa tients.373.3 Anti-GM-CSF a ntibody is not rela ted to serum lipids in APAP pa tients 383.4 Serum lipids a re not rela ted to LDH a nd CEA.383.5 HDL-C is nega lively corella ted with P(A-a)O2.383.6 Serum lipids ca nnot predict the need for WLL trea tment.394.DISCUSSION.395.CONCLUTION.44REFERENCE.45REVIEW.49PULMONARY ALVEOLAR PROTEINOSIS.49REFERENCE.57ACKNOWLEDGEMENTS.64山东大学硕士学位论文特发性肺泡蛋白沉积症血清学标记物及血清脂代谢特点 中文摘要第一部分目的：建立血清抗GM-CSF抗体定量检测方法，了解特发性肺泡蛋白沉积 症(idiopa thic pulmona ry a lveola r proteinosis,IPAP)患者血清抗 GM-CSF 抗体水 平及其与LDH、CEA等血清学指标及肺功能、血气指标的关系，探讨其在该病 诊断及监测中的意义。方法：从IPAP患者血清中提取抗GM-CSF抗体，用BCA 法测浓度后以其作标准品用ELISA法测定30例PAP患者、25例正常人及15例 疾病对照组患者血清中抗GM-CSF抗体水平。用ELISA方法测定各组血清SP-D、YKL-40水平。分析各血清学标记物的组间差异、各标记物间的相关性以及它们 与肺功能、血气等指标的关系。结果：IPAP组患者血清抗GM-CSF抗体浓度为 83.41 57.88ng/ml,较正常对照组及疾病对照组升高，该抗体水平与血清LDH、CEA、SP-D、YKL-40.P(A-a)O2x Sa O2.TLCO%无线性相关关系(P0.05)。IPAP 组血清LDH、CEA水平升高，与Sa Ch、TLCO%呈负相关关系，与P(A-a)Ch呈 正相关关系(P0.05).血清SP-D、YKL40水平也升高，其中SP-D与LDH、CEA呈正相关关系，与Sa Oz呈负相关关系(P0.05),需WLL治疗组血清LDH、CEA水平较不需WLL治疗组升高，而Pa O?、Sa O2 较不需WLL治疗组低(P0.05)o结论：本研究中血清抗GM-CSF抗体对IPAP 诊断的灵敏度、特异度均为100%,临床诊断价值很高，但与疾病严重程度无关，对是否需要WLL治疗也无评估价值。血清LDH、CEA、SP-D水平与疾病严重 程度相关，其中LDH、CEA可作为是否需要WLL治疗的评价指标。第二部分山东大学硕士学位论文目的：了解特发性肺泡蛋白沉积症患者血清脂代谢特点，探讨其与LDH、CEA、肺功能、血气等指标的关系，并明确自身免疫性肺泡蛋白沉积症血清抗 GM-CSF抗体与血脂代谢的关系，探讨血脂指标在PAP诊断及监测中的意义。方法：分析62例非糖尿病IPAP患者及100例正常人血脂水平。用ELISA法测 定30例APAP患者血清抗GM-CSF抗体水平。分析血脂指标与LDH、CEA、抗 GM-CSF抗体、肺功能及血气指标的相关性。结果：IPAP组62例患者中有55 例(88.7%)存在一项或多项脂代谢异常，血清TC(5.391.12mmol/l)较正常 对照组(5.050.97mmol/l)升高，LDL-C(3.47 1.01mmol/l)较正常对照组(3.170.89mmo/l)升高，HDL-C(1.11 0.97-1.30mmol/l)较正常对照组(1.22L05-1.41 减低，LDL/HDL 及 TC/HDL 比值(分别为 3.171.13 与4.811.36)较正常对照组(分别为2.630.87与4.181.12)升高(P均0.05)。HDL-C与P(A-a)O2之间存在负 相关关系(P0.05)o需WLL治疗组与不需WLL治疗组之间无脂代谢 差异(P0.05).结论：IPAP 患者 TC、LDL-C、LDL/HDL 及 TC/HDL 比值较正 常对照组升高，HDL-C水平较正常对照组降低，HDL-C与P(A-a)Oz负相关，但 与其他疾病严重程度指标无相关关系，对该病的诊断价值及对治疗的评估价值均 较低。但由于近90%的患者存在血脂代谢异常，较正常对照组升高，该指标在 IPAP患者的治疗中需得到关注。关键词：特发性肺泡蛋白沉积症；抗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体；乳 酸脱氢酶；癌胚抗原；脂代谢山东大学硕士学位论文Serum Markers and Lipid Metabolism in Idiopathic PulmonaryAlveolar Proteinosis ABSTRACTPART ON EBa ckground:Pulmona ry a lveola r proteinosis(PAP)is a ra re lung disea se cha ra cterized by PAS positive lipoproteina ceous ma teria l a ccumula tion in the pulmona ry a lveoli,of which a utoimmune or idiopa thic type a ccounts fbr a bout 90%.Anti-GM-CSF a ntibody is reported to possess high sensitivity a nd specificity in the dia gnosis of IPAP.We esta blished the qua ntita tive method of testing the a ntibody in China a nd a na lyzed its va lue in IPAP.Methods:Anti-GM-CSF a ntibody wa s purified from a n IPAP pa tient.Mea sure the concentra tion using the BCA protein mea suring kit a fter testing purity a nd a ctivity with SDS-PAGE a nd Western blot respectively.Then the serum a ntibody,SP-D a nd YKL-40 levels of 30 IPAP pa tients,25 hea lthy volunteers a nd 15 pa tients of other lung disea ses were tested by ELISA method.LDH,CEA,a rtery blood ga s test a nd pulmona ry function test results were collected a nd a na lyzed.Then the difference between the groups a nd the rela tionship between the two of the ma rkers wa s tested.Results:The level of serum a nti-GM-CSF a ntibody wa s higher in IPAP pa tients tha n in hea lthy volunteers a nd disea se control pa tients a nd did not correla te with serum LDH,CEA,SP-D,YKL-40,P(A-a)O2,Sa O2 or TLCO%(P0.05).IPAP pa tients ha d higher serum LDH,CEA,SP-D a nd YKL-40 levels.LDH,CEA correla ted well with Sa O2,TLCO%,P(A-a)O2 a nd serum SP-D level.Pa tients who 山东大学硕士学位论文needed WLL trea tment ha d higher serum LDH a nd CEA levels but not a nti-GM-CSF a ntibody,SP-D a nd YKL-40 levels(P0.05).Besides,Sa O?a nd Pa Oi were lower a nd P(A-a)O2 wa s higher in these pa tients(P0.05).Conclusion:The sensitivity a nd specificity of a nti-GM-CSF a ntibody in IPAP dia gnosis were both 100%,a nd this test should be recommended in clinica l dia gnosis of PAP.But the level of this a ntibody did not correla te with disea se severity a nd could not be used to predict the need for WLL trea tment.Serum LDH,CEA a nd SP-D levels correla ted well with disea se severity a nd serum LDH,CEA might be a predictor of the need for WLL trea tment.PART TW OBa ckground:To study the lipid meta bolism cha ra cters of IPAP pa tients a nd to a na lyze its va lue in PAP dia gnosis a nd trea tment.Method:Serum lipids of 62 non-dia betic IPAP pa tients a nd 100 hea lthy volunteers were tested a fter a n overnight fa sting.Anti-GM-CSF a ntibody level of 30 APAP pa tients wa s mea sured by ELISA method.The correla tion of lipids a nd other ma rkers were a na lyzed.Results:55 of 62 IPAP pa tients(88.7%)suffered from impa ired lipid meta bolism.The TC a nd LDL-C levels(5.39 1.12mmol/l a nd 3.47 1.01 mmol/1 respectively)wa s higher in IPAP pa tients tha n in hea lthy volunteers(5.050.97mmol/l)(P 0.05).HDL-C level(1.11 0.97-1.30 mmol/1)wa s lower in IPAP pa tients tha n in hea lthy volunteers(P0.05).The lipid level except HDL did not correla te with disea se severity ma rkers such a s LDH,CEA,P(A-a)O2,Sa O2 or TLCO%(P0.05).The IPAP pa tients were divided into two groups a ccording to the need fbr WLL trea tment.There were no differences in lipid meta bolism between the two groups.Conclusion:IPAP pa tients were likely to suffer from impa ired serum lipid 山东大学硕士学位论文meta bolism.They ha d higher serum TC,LDL,LDL/HDL a nd TC/HDL levels,but these ma rkers were not rela ted to disea se severity a nd could not be used a s predictors of the need for WLL trea tment.HDL-C level wa s lower in IPAP pa tients,a nd nega tively correla ted with P(A-a)O2 but not with other disea se severity ma rkers.Key words:idiopa thic pulmona ry a lveola r proteinosis;a nti-GM-CSF a ntibody;la cta te dehydrogena se;ca rcino-embryonic a ntigen;lipid meta bolism5山东大学硕士学位论文符号说明缩略语英文名中文名AMAlveola r ma cropha ge肺泡巨噬细胞APAPAutoimmune pulmona ry a lveola r自身免疫性肺泡蛋白沉proteinosis枳症BSABovine serum a lbumin牛血清白蛋白CEACa rcino-embryonic Antigen癌胚抗原DBGDia stolic blood pressure舒张压ELISAEnzyme-linked immunosorbent a ssa y酶联免疫吸附实验FBGFa sting serum glucose空腹血糖HC1Hydrogen chloride盐酸HDL-CHigh Density Lipoprotein高密度脂蛋白HGBHemoglobin血红蛋白HRPHorse ra dish peroxida se辣根过氧化物酶IPAPIdiopa thic pulmona ry a lveola r特发性肺泡蛋白沉积症proteinosiskDaKiloda lton千道尔顿KL-6Kerbs von Lungren 6 a ntigenLDHLa cta te dehydrogena se乳酸脱氢酶LDL-CLow Density Lipoprotein低密度脂蛋白ODOptica l Density光密度OLBOpen lung biopsy开胸肺活检PAGEPolya cryla mide Gel Electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PASPeriodic a cid-Schiff过碘酸-希夫PBSPhospha te-buffered Sa line磷酸盐缓冲液PVDFPolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯Recombina te huma n重组人粒细胞巨噬细胞rhGM-CSFGra nulocyte-ma cropha gecolony-stimula ting fa ctor集落刺激因子6山东大学硕士学位论文SBGSystolic blood pressure收缩压SDSSodium Dodecyl SuLfa te十二烷基磺酸钠SP-ASurfa cta nt protein A肺泡表面蛋白ASP-DSurfa cta nt protein D肺泡表面蛋白DTCTota l Cholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯VATSVideo-a ssisted Thora coscopic Surgery电视辅助胸腔镜手术WLLWhole lung la va ge全肺灌洗YKL-40/CHI3L1Huma n chitina se 3-like 17山东大学硕士学位论文第一部分抗GM-CSF抗体在特发性肺泡蛋白沉积症诊断及监测中的意义山东大学硕士学位论文前言肺泡蛋白沉积症（PAP）是一种以肺泡腔内PAS染色阳性物质沉积为主要病 理特征的呼吸系统罕见疾病。1958年由Rosen等首次报道。可分为自身免疫性（a utoimmune PAP,APAP,因抗GM-CSF自身抗体存在致肺泡巨噬细胞功能异常 所致），继发性（继发于其他病因如造血系统疾病、感染等）及先天性（与粒细 胞-巨噬细胞集落刺激因子受体等的基因突变有关）三种临床类型，其中APAP 占该病总数的90%以上。该病临床表现差异明显，患者可无症状，也可出现呼 吸衰竭而危及生命，全肺灌洗（WLL）是目前治疗该病的主要手段。1994年，Dra noffG等发现GM-CSF基因敲除小鼠出现与PAP患者相似的病理特征，为该 病的研究拉开了新的帷幕。此后，GM-CSF抗体的发现为自身免疫性肺泡蛋白 沉积症的诊治提供了新的靶点里GM-CSF在肺泡巨噬细胞（a lveola r ma cropha ge,AM）的分化及功能调节中发挥重要作用，中和抗体的存在致AM清除肺泡表面 活性物质功能障碍，从而导致肺泡腔内PAS染色阳性物质的沉积。据文献报道，当血清抗GM-CSF抗体低于临界点（约5yg/ml）时，GM-CSF的生物学活性及 相关功能与抗体浓度呈负相关，但当其高于临界点时，GM-CSF生物学活性及相 关功能（包括AM清除肺泡表面活性物质的能力）则降到最低，APAP的危险性 随之升高网。目前针对此发病机制的治疗如GM-CSF替代治疗、血浆置换、CD20 单抗等已逐步开始应用。多项研究表明血清抗GM-CSF抗体水平在APAP的诊 断中具有很高的灵敏度和特异度（分别为93.8%-100%、91%-100%）8-10o但国 内抗GM-CSF抗体的定量测定方法尚未建立。此研究旨在建立血清抗GM-CSF 抗体的定量检测方法，并测定近年来于北京协和医院就诊的IPAP患者血清抗 GM-CSF抗体水平，了解其在IPAP诊断中的灵敏度及特异度，探讨其与其他血 清学标记物及肺功能等指标的关系。山东大学硕士学位论文1.实验材料1.1 主要生化试剂及抗体1.注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(特尔立)由厦门特宝生物工程 股份有限公司提供。2.Norma l Goa t Serum购自北京中杉金桥生物技术有限公司。3.HRP la beled goa t a nti-huma n IgG(H&L)-Affinity Pure 购自 ImmunoRea gents 公司。4.3,3,5,5-Tetra methylbenzidine;TMBUS-TMB 购自 R&D Systems 公司。5.HRP stop solution 购自 R&D Systems 公司。6.ELISA包被液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。7.PBS 干粉(Ca tNo.P1010)购自 Sola rbio 公司。8.Tween 20 购自 Sigma 公司。9.BSA购自北京普利莱基因技术有限公司。10.SDS-PAGE染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250,454mL 50%甲醇溶液,46mL 冰乙酸；脱色液：75mL冰乙酸，875mL去离子水，50mL甲醇。11.抗 GM-CSF 抗体提取 Coupling Buffer：0.2M Na HCO3,0.5M Na Cl,PH 8.3：Buffer A：0.5M 乙醇胺,0.5MNa Cb PH 8.3；Buffer B：0.1M 醋酸钠,0.5M Na CL PH 4；Stora ge Buffer：0.05M Na 2HPO4,0.1%Na N3,PH 7o1.2 试剂盒1.SP-D,YKL-40 ELISA 试剂盒购自 R&D Systems 公司。2.BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。1.3 主要仪器及设备1.Hi-Tra p NHS a ctiva ted column(Bed volume 5ml)购自 GE Hea lthca re 公司。2.Amicon Ultra-15 Centrifuga l Filter Units(MWCO 30kDa)购自 Millipore 公io山东大学硕士学位论文司。3.96孔酶标板(Costa r)4.酶标仪(BIO-RAD,680)5.台式离心机(SORVALL,SUPER T21)6.台式恒温振荡器(DDHZ-300)7.电热恒温水箱(Thermo)8.DEM-HI型自动酶标洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司)9.0.22 u m 滤膜(MiUex-GP)10.Milli-Q plus 超纯水制备机(Millipore)11.电子分析天平(Sa rtorius)12.电子天平(Sa rtorius,TE212-L)13.磁力搅拌器(QILINBEIER,GL-3250C)14.PH 计(Sa rtorius)15.电泳仪(BIO-RAD)16.微量移液器(Eppendorf Resea rch)17.X线摄影暗匣(AX-H)18.自动X线胶片洗片机(2600C,上海申贝)19.4C冰箱(BOSCH)20.-80C超低温冰箱(SANYO)2.对象与方法2.1 病历资料及标本30例IPAP患者均来自2006年3月至2013年3月于北京协和医院就诊的患 者，通过支气管镜肺活检(TBL B)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、胸腔镜(VATS)或开胸肺活检(OL B)明确诊断，所有患者均无先天性肺泡蛋白沉积症及导致继 发性肺泡蛋白沉积症的相关病史。所有患者均未曾接受吸入或皮下注射rh GM-CSF治疗。15例疾病对照组为CT表现为磨玻璃影等与PAP易混淆的疾病 11山东大学硕士学位论文患者，来自同期于我院呼吸科住院患者，其中8例为结缔组织病相关性弥漫性肺 实质病变(其中2例为皮肌炎，1例为类风湿性关节炎合并肺抱子菌肺炎，1例 为混合性结缔组织病，1例为未分类结缔组织病继发性机化性肺炎，3例为结缔 病可能性大)，4例为特发性肺纤维化(IPF,其中1例合并巨细胞病毒感染)，2 例为结节病，1例为非特异性间质性肺炎(NSIP)。25例正常对照组血清标本取 自我院同期合格健康体检者。血标本采集后1500rpm离心5分钟，血清分装后 于-80C冰箱储存待检。所有患者均签署知情同意书及标本捐赠同意书。本实验 获得北京协和医院伦理委员会批准。2.2 血清抗GM-CSF抗体测定2.2.1 自IPAP患者血清中提取抗GM-CSF抗体根据文献报道从IPAP患者血清中提取抗GM-CSF抗体口工(1)按说明书要求用1.05mg注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(特尔 立)包被 Hi-Tra p NHS a ctiva ted column(Bed volume 5ml)。试剂使用前用 0.22pm 滤过膜过滤除杂质。将1.05mgrhGM-CSF溶解于5mL包被液。打开顶盖，在柱 子上方滴一滴ImM冰HC1以防气泡形成。将HiTra p luer connector连接于柱子 上方。去除尾端封口。用3*10mLlmM冰HC1以5mLzmin(2滴/秒)的速度洗 脱异丙醇。然后以上述速度注入2倍体积Coupling Buffer,再以相同速度注入配 体溶液。25c静置 30min 后先后注入 3*10mL Buffer A,3*10mL Buffer B,3*10mL Buffer A,室温静置 30min 后先后注入 3*10mL Buffer B,3*10mL Buffer A,3*10mL Buffer B,最后注入10mL中性PBS调节PH,包被过程即完成。若暂时不用可 加Stora ge Buffer后贮存于4冰箱。(2)将PAP患者血标本离心(4000rpm,30min)分层，上清用0.22pm孔径 的滤膜过滤除菌，用去离子水稀释5倍。(3)用10体积(50mL)PBS平衡柱子后，用注射器以l-5ml/min的流速将 25ml过滤后的血清标本上样柱子。(4)用50ml PBS洗脱未结合的蛋白后，结合到柱子上的蛋白用25ml的 12山东大学硕士学位论文lOOmM的甘氨酸盐酸盐(pH 2.7)洗提，然后用Amicon Ultra-15 MWCO 30kDa 浓缩提出物：将15mL样品加入Amicon Ultra filter,配平后4000*g离心20min(用非固定转头离心机)，离心后立即吸出浓缩物，以保证抗体活性。用15ml PBS溶解提取物，重复上述过程，以调整其pH至7.4。(5)提取物浓度用BCA法测定：将蛋白标准品倍比稀释，将待测样本稀释2 倍，每孔加入25可标准品或稀释样本，与200川工作液(50体积BCA Rea gent 与1体积Cu Rea gent混合)混匀，37c放置30min,测定562nm吸光度值，根 据标准曲线算出待测样本浓度。(6)溶解于PBS的lmg/ml的抗体储存于-80C冰箱，或用含1%BSA和0.1%tween20的PBS稀释至50ng/mL储存于-20C冰箱。2.2.2 用SDS-PAGE法检测多克隆抗GM-CSF抗体纯度(1)配置凝胶板：按表配置10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(含B-疏基乙醇)。(2)蛋白样品中加入1/4体积5*Loa ding buffer,100变性lOmin。(3)上样 20Hl(约 19pg)(4)正确连接电泳装置，以120V电压电泳至溟酚蓝染料到达分离胶底部后 关闭电源。(5)切去浓缩胶，将分离胶置于染色液中染色4h,然后用脱色液脱色直至蛋 白区带清晰。2.2.3 用Western Blot法检测抗GM-CSF抗体生物学活性(1)配置凝胶板：按表配置10%SDS聚丙烯酰胺凝胶。(2)将注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(特尔立)稀释至0.75mg/ml 后力口入1/4体积5*Loa dingbuffer,做复孔，每孔上样20位。(3)正确连接电泳装置，以120V电压电泳至漠酚蓝染料到达分离胶底部后 关闭电源。(4)取出玻璃板，切去浓缩胶，将分离胶置于预先配好的转膜缓冲液中。(5)戴手套切一块略大于浓缩胶的PVDF膜，在100%甲醇中浸泡Imin左 13山东大学硕士学位论文右后将其铺于浓缩胶上，胶、膜两侧各铺一块海绵及两块滤纸，胶面朝向负极安 装转膜装置。(6)转膜，恒定电流350mA,1.5h。(7)将PVDF膜置于5%脱脂奶粉封闭液中4c封闭过夜。(8)加一抗：将PVDF膜置于1:500稀释的提取抗体中，室温振荡孵育lh。(9)用1*TBST洗膜5min*4次后，加二抗：将膜置于1:1000稀释的辣根过 氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgGF(a b，)2抗体溶液中，室温振荡孵育lh。(10)用 1*TBST 洗膜 5min*4 次。(11)按说明书将显色液A、B等体积混匀，并将配制好的显色液均匀滴加于 膜结合蛋白的一侧。(1 2)3min后吸尽过多的显色液，置于X射线显影暗夹中，曝光5min。2.2.4用ELISA法测定提取抗体浓度及血清抗GM-CSF抗体浓度用包被液将注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(特尔立)稀释至Ipg/ml,酶标板中每孔加入100W，4c孵育过夜，用含0.1%Tween20的PBS溶液洗板3 次后，每孔加入200山封闭液(即含1%羊血清及2%Tween20的PBS溶液)，室 温静置lho洗板3次后备用。待测PAP患者血清用含1%BSA和0.1%tween20 的PBS稀释6000倍，正常对照组血清稀释500倍，每孔加入100可标准品或待 测血清，置于振荡器上振荡混匀室温孵育90min。用含0.1%Tween20的PBS溶 液洗板4次，每孔加入5Rg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG F(a b?)2抗体溶液100W，于室温下振荡孵育lh。洗板后每孔加四甲基联苯胺(TMB)底 物lOOpl,室温避光10min后每孔加终止液1001,于450nm波长下读取其吸光 度(A)值。根据二项式标准曲线算出各待测血清中抗GM-CSF抗体浓度。2.3 血清SPD、YKL40水平测定SP-D、YKL-40 ELISA试剂盒购自R&D Systems公司。根据说明书要求，用ELISA法测定IPAP组、正常对照组及疾病对照组血清SP-D及YKL-40水平。14山东大学硕士学位论文2.4 血清LDH、CEA水平测定血清LDH、CEA测定于采血当天由北京协和医院检验科完成。LDH正常范 围为 97.00-270.00U/L,CEA 正常范围为 0-5.0ng/ml。2.5 肺功能测定PAP患者肺功能在采血0-14天内由北京协和医院呼吸科肺功能实验室完成。TLCO(predictedforHb)校正值由以下公式计算：男：TLCO(predicted for Hb)=DLCO(predicted)*(1.7*Hb)/(10.22+Hb)女：TLCO(predicted for Hb)=DLCO(predicted)*(1.7*Hb)/(9.38+Hb)2.6 数据分析数据处理及统计分析用SPSS Sta tistics 17.0完成。经正态性检验后，正态分 布资料组间均数