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学校代码：10023学 号：B2009169博士学位论文（专业学位）分泌蛋白质组学方法筛选新的胰腺癌肿瘤标记物Screening for new tumor markers of pancreatic cancer using secretome analysis ：北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 目录理S鹦I目录图索引.表索弓1.2缩略语表.3中文摘要.5英文摘要.7第一部分：蛋白质组学鉴定胰腺癌特异分泌蛋白质前言.9材料与方法.12结果.19讨论.20小结.26第二部分：特异分泌蛋白质作为新胰腺癌肿瘤标记物的验证研究前言.27资料与方法.29结果.35讨 论.47力、名吉.53参考文献.54文献综述.60课题资助资金.71致谢.72个人简历.73版权声明.74北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文图索引图索引图1.1 胰腺癌蛋白质组学研究流程.21图2 Apo A-H第一板ELISA实验标准曲线.36图2.2 Apo C-I第一板ELISA实验标准曲线.36图2.3 Apo A-II第二板ELISA实验标准曲线.37图2.4-Apo C-I第二板ELISA实验标准曲线.37图2.5 Apo A-II第三板ELISA实验标准曲线.38图2.6 Apo C-I第三板ELISA实验标准曲线.38图2.7 Apo C-I诊断胰腺癌的ROC曲线.41图2.8 利用ROC曲线确定Apo C-I诊断胰腺癌的Cut-o f f值.43北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文表索引表索引表L1 用于无血清器官培养的新鲜组织标本的临床病理资料.13表1.2 胰腺癌临床诊断依据.14表1.3 AJCC胰腺癌TNM分期标准（2010年第七版）.15表1.4 不同样品用于胰腺癌特异分泌蛋白质组研究的优缺点.24表2.1 各组性别组成及与PDAC组比较构成比.35表2.2 各组年龄组成及与PDAC组比较.35表2.3 各板ELISA实验回归方程.36表2,4 三组Apo A-11及Apo C-I浓度值的正态性检验结果.39表2.5 Apo A-II及Apo C-I血清浓度描述性统计结果.39表2.6 纳入病例数统计结果.40表2.7 各组Apo A-II血清浓度及均值比较.40表2.8 各组Apo C-I血清浓度及均值比较.40表2.9 各Apo C-I血清浓度作为Cuto f f值诊断胰腺癌的敏感性及特异性.41表2.10 胰腺癌临床病理因素与Apo C-I关系的单因素分析.44表2.11 胰腺癌二分类变量临床病理因素与Apo C-I的关系.45表2.12 胰腺癌多分类变量临床病理因素与Apo C-I的关系.462北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文缩略语表缩略语表英文缩写英文全称中文全称2-DETwo-dimensio nal gel electro pho resis双向凝胶电泳ApoApo lipo pro tein载脂蛋白APSAmmo nium persulf ate过硫酸钱AUCArea under curve曲线卜面积BM1Bo dy mass index体重指数CEACarcino-embryo nic antigen癌胚抗原CTCo mputer to mo graphy计算机断层扫描CTCsCirculating tumo r cells循环肿瘤细胞DTTDL-Di th i o th rei to l一硫苏糖醇ELISAEnzyme-linked immuno so rbent assay酶联免疫吸附测定ESI-MS/MSElectro spray io nizatio n tandem mass spectro metry电喷雾电离-串联质 谱EUSEndo sco pic ultraso no graphy超声内镜HDMSHigh-def initio n mass spectro metry高精度质谱分析ICATIso to pe-co ded af f inity tag同位素亲和标签IHCImmuno histo chemistry免疫组织化学IPGImmo bilized pH gradient宽范围固相pH梯度LCMLaser capture micro dissectio n激光捕获微切割技术LC-MS/MSLiquid chro mato graphy tandem mass spectro metry液相色谱串联质谱LPLLipo pro tein lipase脂蛋白脂酶MOLDI-TOF-MSMatrix-assisted laser deso rptio n io nizatio n time-o f-f light mass spectro metry基质辅助激光解吸离 子化-时间飞行质谱MRIMagnetic Reso nance Imaging磁共振成像3北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文缩略语表MRMMultiple reactio n mo nito ring多反应监测MSMass spectrum质谱PDACPancreatic ductal adeno carcino ma胰腺导管腺癌PETPo sitro n Emissio n Co mputed To mo graphy正电子发射计算机断 层扫描RT-PCRQuantitative reversetranscriptio n-po lymerase chain reactio n反转录聚合酶链式反 应SDSSo dium Do decyl Sulf ate十二烷硫酸钠SDS-PAGESubstrate-so dium do decylsulf ate-po lyacrylamide gel electro pho resis基质钠十二烷基硫酸 聚丙烯胺凝胶电泳siRNASho rt interf ering RNA干扰短RNATMATissue micro arrays组织微阵列VLDLVery lo w density lipo pro tein极低密度脂蛋白北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文中文摘要中文摘要背景和目的 胰腺癌被誉为“癌中之王”，其发病率及死亡率基本相等，放化疗效 果差，手术是可能治愈胰腺癌的唯一手段。然而由于胰腺癌早期诊断困难，大多数 患者就诊时已处于局部晚期，失去了手术切除的机会。为了提高胰腺癌的总体疗效，需要加强胰腺癌的早期诊断。在胰腺癌众多的诊断手段中，肿瘤标记物对于早期发 现、诊断最具有现实临床意义。CA19-9是胰腺癌目前公认最佳的肿瘤标记物，但 其敏感性和特异性仍不能令人满意。蛋白质组学近二十年来发展迅速，在肿瘤标记 物的筛选中也得到了广泛应用。本研究的目的即运用蛋白质组学的研究方法，筛选 建立胰腺癌特异分泌蛋白质组数据集并验证部分特异分泌蛋白质，以期寻找到提高 胰腺癌早期诊断效果的新的肿瘤标记物。方法 我们通过运用无血清器官培养方法培养2例新鲜胰腺癌组织及4例正常胰腺 组织。培养成功后取上清液离心、浓缩、收集培养上清中的分泌蛋白质，将浓缩收 集到的分泌蛋白质分别以“鸟枪法液相色谱串联质谱”及“聚丙烯酰胺凝胶电泳-高精度质谱分析”进行鉴定，建立胰腺癌特异分泌蛋白质组数据集。其后选取胰腺 癌患者血清69例、疾病对照病例血清32例、正常志愿者血清21例，以ELISA方 法验证Apo A-II及Apo C-I两个分泌蛋白质在三组血清中的表达差异，分析其作为 新胰腺癌肿瘤标记物的诊断能力。结果 收集1例胰腺癌组织、1例癌旁胰腺组织、1例混合正常胰腺组织的培养上 清中的分泌蛋白质，运用鸟枪法液相色谱串联质谱研究策略对三份样品分别各进行 三次平行鉴定，三次均能鉴定到的分泌蛋白质数目分别为110.5和9。运用聚丙烯 酰胺凝胶电泳-高精度质谱研究策略分析了 2例胰腺癌、1例正常胰腺组织、1例正 常胰腺组织混合培养的培养上清分泌蛋白质，分别鉴定到515、252、89、179个分 泌蛋白质。两种蛋白质组研究策略所得到的分泌蛋白质经过差减分析，一共得到570 个胰腺癌特异分泌蛋白质.以此建立胰腺癌特异分泌蛋白质组数据集。继之，我们 对数据集当中的Apo A-II及Apo C-I两个分泌蛋白质用ELISA方法在69例胰腺癌 血清、32例疾病对照血清、21例正常志愿者血清中验证，结果显示胰腺癌组及正 常志愿者组血清Apo A-II浓度差异无统计学意义（P 0.05）,而胰腺癌组血清Apo C-I 浓度高于正常志愿者组，差异具有统计学意义（P 0.05),and the average serumlevels o f Apo C-I is higher in 69 PDAC cases than in 21 health cases(PV0.05).The cut-o f f value o f Apo C-I is 2 1.69j.Lg/ml,and its sensitivity and specif icity is 76.2%and 57.1%respectively.Co mbinatio n o f Apo C-I and CAI9-9 f o r diagno sising PDAC 7北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文英文摘要co uld enhance the sensitivity and specif icity to 95.59%and 84.38%respectively.Conclusion Secreted pro teins dateset is dif f erent between PDAC gro up and health vo lunteer gro up.PDAC tissues can pro duce specif ic secreted pro teins into the culture so lutio n that co uld be identif ied by mass spectro graphy analysis.Serumlevels o f Apo A-II has no signif icant dif f erence between PDAC and health vo lunteer gro up.And the average serumlevels o f Apo C-I is higher in PDAC,which indicated Apo C-I can be used as tumo r marker o f PDAC.Key words 1 Pancreatic ductal adeno carcino ma；Pro teo mics；Apo A-II；Apo C-I；Tumo r marker8北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分第一部分蛋白质组学鉴定胰腺癌特异分泌蛋白质前三胰腺癌在发达国家发病率较高，上世纪自50年代到80年代，胰腺癌的死亡率 在发达国家一直呈上升态势，80年代后开始逐渐下降。一项 WHO发布的包含35 个欧洲国家和19个其他地区国家1980-2007年统计信息的数据显示(Bo setti,et al.,2012)：2007年，胰腺癌死亡率最高的地区为波罗的海周边、中东和东欧国家，男女分别为9.5/10万及6/10万。另据最新报道(Ratho d,etaL,2011),美国2010年间 共有36800人死于胰腺癌，居癌症死因的第四位。随着我国经济和社会的高速发展、人民生活水平的迅速提高及生活习惯的改变，我国胰腺癌的发病率也呈现逐渐上升 的趋势，部分大城市己达到发到国家水平。据国内报道(顾凯等.,2009),1973年至 2006年，上海市区男性和女性胰腺癌的标化发病率分别上升62.20%和75.54%。2002 年至2006年,上海市共诊断8190例胰腺癌,总粗发病率为12.17/10万,标化发病率为 6.22/10万。胰腺癌居上海市男性肿瘤发病率的第8位、女性的第7位，男女发病比 为1.18：1。其中71.06%的病例集中在年龄65岁组，尤以8084岁组的发病率最高。诊断明确的病例中，最主要发生于胰头(75.54%),诊断时期利多为IV期(64.41%)。大部分胰腺癌的病理组织类型都是胰腺导管腺癌(PDAC,Pancreatic ductal adeno carcino ma),其对放化疗均不敏感，死亡率高，总体5年生存率目前不足5%(Vincent,et al.,2011),治疗情况不容乐观。目前对于胰腺癌有效率最高的化疗药物 为吉西他滨，但其有效率也仅是30%左右。且由于胰腺癌位置深在，周围脏器众多，影响放疗靶区的设定及放疗剂量的提升，胰腺癌组织本身对放疗亦不太敏感，因此 体外放疗的总体疗效不佳。外科手术行根治性切除是目前唯一能治愈胰腺癌的方 法。但胰腺癌尤其是占胰腺癌比例大部分的胰头癌，患者就诊时80%-85%是局部进 展不可切除期或晚期(Vincent,et al.,2011),外科手术治疗困难。此时即便是行扩大 切除联合血管重建术，其术后疗效亦不佳，且手术伴有较高的围手术期并发症发生 率及死亡率(Mo llberg,etaL,2011)。因此，要提高胰腺癌的整体治疗效果，早诊早治 是关键。胰腺癌早期临床表现主要包括腹胀、腹部不适、消化不良、脂肪泻及血糖异常 等(汪毅等.,2007),但均无特异性，容易误诊漏诊，因此早期诊断有赖于各项辅助检 查。临床用于胰腺癌辅助检查的手段包括肿瘤标记物、超声、腹部CT(Co mputer to mo graphy).MRI(Magnetic reso nance imaging)EUS(Endo sco pic ultraso no graphy)PET/CT(Po sitro n emissio n co mputed to mo graphy),此外 尚有处于实验室暂未用于临 床的诊断方法循环肿瘤细胞(CTCs,Circulating tumo r cells)o CT、PET/CT EUS、9北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分MRI由于费用高、有创、操作复杂等原因，不适合广泛应用于胰腺癌的早期诊断。超声虽然费用可接受，操作简便，但对于早期胰腺癌及小胰腺癌的诊断性价比依然 很低。日本14家医疗机构(Maguchi,et aL,2006)在对423905例正常人行超声检查时 仅仅发现了 39例胰腺癌，其中12例为肿瘤直径V2 cm的小胰腺癌，检出率仅为 0.0028%o CTCs有国外学者报道(de Albuquerque A,et aL,2012)诊断胰腺癌敏感性为 47%,特异性为100%。显然这样的敏感性还不能达到要求，且CTCs目前尚不成熟，除了美国FDA批准应用于乳腺癌外，并不能直接应用于胰腺癌的临床诊断。因此，肿瘤标记物对于胰腺癌的早期诊断至关重要。对于胰腺癌而言，CA19-9是目前公认最佳的肿瘤标记物。CA19-9是1979年 Ko pro wski等(Ko pro wski,et al.,1979)用人结肠癌细胞株SW1116免疫小鼠后，取其 脾细胞与大鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体1116NS19-9所 识别的一种糖抗原。该抗原在组织中主要以单涎酸神经节成脂形式出现，可在正常 的胰腺导管上皮表达。当导管上皮细胞发生癌变时，一些调控粘蛋白表达的基因发 生活化，促使CA19-9表达明显升高，加上分泌途径中的胰腺小导管和胰管被肿瘤 细胞所阻塞，使CA19-9逸入癌灶周围的基质中，进而流入血液，导致胰腺癌患者 血清中CA19-9含量升高。CA19-9是目前应用最广泛的胰腺癌肿瘤标记物，同时亦 是Lewis血型抗原标志。人群中约有5%-10%Lewis阴性患者因不含有去氧半乳糖 转移酶(Fuco syl transf erase),故不能产生CA19-9而导致假阴性。因此，理论上讲，CA19-9对胰腺癌诊断的最大敏感性为90%95%。Delvillano等(Del,et al.,1983)在 1983年首先报道了 CA19-9对胰腺癌诊断的敏感性为79%,Mo rris-Stif f等(Mo rris-Stif f,et aL,2009)报道的敏感性为84.9%；国内倪晓光等(倪晓光等.,2008)报道 CA19-9诊断胰腺癌敏感性为80%,董家鸿等(任师颜等.,2008)报道为82.86%,周江 蛟等统计的(周江蛟等.,2011)CA19-9诊断可切除胰腺癌的敏感性为71.9%。需要注 意的是，CA19-9是一种消化道肿瘤相关抗原，除了胰腺癌患者CA19-9明显升高外，其他消化道肿瘤如胃癌、大肠癌，壶腹癌、肝癌，尤其是肝外胆管细胞癌亦可升高。2007 年，Go o nnetilleke 等(Go o netilleke and Siriwardena,2007)回顾分析 1990-2005 年 发表的文献，纳入22项研究，病例总数达到2282例，结果显示CA19-9对胰腺癌 的特异度平均为82%(68%-91%)。此外，CA19-9作为胰腺癌筛查是一个非常不理想 的标记物，韩国三星医疗中心(Kim,et al.,2004)用CAI9-9筛查了总数70940例的无 症状人群，其中CA19-9升高者1063例，但仅有4例为胰腺癌，且仅有2例为可切 除胰腺癌，检出率仅为0.0000564%。单独应用CA19-9诊断胰腺癌的敏感性及特异性不能让人满意，国内外不少学 者联合应用不同肿瘤标记物诊断胰腺癌，但未能有突破性进展。新胰腺癌肿瘤标记 物的研究也层出不穷，如血清淀粉样蛋臼A(Firpo,et al.,2009)、Mic-l(Ko o pmann,et al.,2006).GFBP-l(Wo lpin,et al.,2007),但诊断能力均未有能超越 CA19-9 者。蛋 10北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分白质组学概念上世纪末被提出来后，由于其整体、动态、敏感、高通量的固有优点，被广泛应用于肿瘤标记物的研究当中(倪晓光等.,2003;Chen,et al.,2007,Sun,et aL,2007)并取得了进展。我们的研究目的及思路如下：1 获取新鲜胰腺癌及其癌旁组织2例，同时获取其他正常胰腺组织4例，分别进行无血清器官培养。培养成功后取上清液离心、收集浓缩培养上清液中的分泌 蛋白质；2 将收集浓缩到的分泌蛋白质分别以“鸟枪法液相色谱串联质谱(Sho tgun LS-MS/MS,Sho tgun Liquid chro mato graphy and tandem mass spectro metry)及“聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Substrate-so dium do decyl sulf ate-po lyacrylamide gel electro pho resis)-高精度质谱分析(HDMS,high-dif enitio n mass spectro metry)进行鉴定，建立胰腺癌特异分泌蛋白质组数据库。11北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分材料和方法一.实验材料1主要仪器(1)LTQ-MS/MS 质谱仪(2)Nano LC-MS/MS 及 HDMS(3)液相色谱系统：-GE Ettan MDLC(4)振荡平台:1296-003 DELFIAPLATESHAKEThermo Finnigan Inc 美国Waters Inc.美国GE Healthecare Inc.美国Wal lac Inc.芬兰(5)超纯水净化器：Milli-QPlusMillipo reInc.美国(6)细胞培养箱NAPCOInc.美国(7)pH 仪：PB10 型Sarto riusInc.德国(8)-80低温冰箱SANYOInc.日本(9)高度冷冻离心机BeckmanInc.美国(10)电子天平：BS110S(U)PROTEAN 3垂直蛋白 电泳仪(12)XCell SureLo ckTM Mini-Cell 电泳槽(13)C18Trap 柱(14)图像扫描仪(15)微量移液器：Gilso n(16)雪花状制冰机：Ro ss(17)各种规格Tip头、离心管(18)GENEQUANT pro 分光光度计(19)倒置相差显微镜Go ettingen Inc.德国 Bio-Rad Inc.美国 Invitro gen Inc.美国 Agilent tech Inc.美国 上海中晶公司中国 Gilso n Inc.法国 Ro ss Temp Inc.美国 Ax ygen Inc.美国 GE Healthecare Inc.美国 Niko n Inc.日本12北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分2主要试剂(l)LHC-9无血清培养基Investro gen Inc.美国(2)NuPAGE Bis-Tris Mini GelsInvestro gen Inc.美国(3)预染 Bench MarkInvestro gen Inc.美国(4)Leibo vitz5L-15 培养试剂Sigma-Aladrich.美国(5)细胞培养添加剂如胰岛素、微量元素等Sigma-Aladrich.美国(6)考马斯克蓝R250BBI Inc.美国(7)丙烯酰胺及十二烷基磺酸钠BBI Inc.美国(8)琼脂糖、灵肽素、抑肽酶、IAA、NP-40、AEBSFFluka Inc.瑞士(9)聚偏氟乙烯(PVDF)膜Amersham Bio sci Inc.美国(lO)Amico n 离心过滤器(5,000Dalto ns MWCO)Millipo re Inc.美国(11)表皮生长因子EGF重组蛋白BD Trans Lab 美国(12)组织冻存管BD Inc.美国(13)10cm细胞培养IHLBD Inc.美国(14)Co o massie Plus蛋 白定量试剂盒PIERCE Inc.美国(15)测序级胰蛋白酶Am re sco Inc.美国3实验标本来源收集在中国医学科学院肿瘤医院腹部外科临床诊断为胰腺癌、术前未经任何放 化疗、住院并手术切除的新鲜组织标本7例，其中2例为PDAC组织，5例为正常 胰腺组织。7例组织标本的临床病理信息见表1,临床诊断依据见表1.2,分期依据 2010年第七版美国癌症联合会(AJCC)胰腺癌TNM分期，见表1.3。表1.1用于无血清器官培养的新鲜组织标本的临床病理资料编号性别年龄病理及分化程度TNM 分期(AJCC7th)培养组织1M56中低分化PDACIIA(T3N0M0)N/T2F48中低分化PDACIIA(T3N0M0)T3F51B细胞淋巴瘤NAN4M43壶腹癌NAN5F46正常胰腺NAN6F61胰腺浆液性囊腺瘤NAN注：M=Male,F=Famale；NA=No t assessment；N=no rmal pancreatic tissue；T=pancreatic tumo r tissue.13北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分表1.2胰腺癌临床诊断依据临床表现（1）不明原因的梗阻性黄疸；（2）近期出现无法解释的体重下降10%;（3）近期出现不能解释的上腹或腰背部疼痛；（4）近期出现模糊不清又不能解释的消化不良症状，内镜检查正常；（5）突发糖尿病而又无诱发因素，如家族史、肥胖；（6）突发无法解释的脂肪泻；（7）自发性胰腺炎的发作；（8）如果病人是嗜烟者应加倍怀疑；影像学（1）B超提示胰腺有低密度区.胰管扩张及胆总管和胆囊肿大；（2）CT提示胰腺局部增大和占位性病变；（3）胰胆管磁共振造影（MRCP,Magnetic Reso nance Cho iangio pancreato graphy）提示有胰管或同时胆管的狭窄、扩张，胰腺占位性病变；（4）超声内镜（EUS,Endo sco pic ultraso no graphy）提示有胰腺区低密度占位性病 变；肿瘤标记物CA19-937U/L；手术探查手术中探查探及实物性肿块14北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分表1.3 AJCC胰腺癌TNM 分期标准（2010年第七版）原发肿瘤（T）Tx：原发肿瘤无法评估；T0：无原发肿瘤证据；Tis：原位癌;T1：肿瘤局限于胰腺，最大直径W2cm；T2：肿瘤局限于胰腺；最大直径2cm；T3：肿瘤侵犯除腹腔干及肠系膜上动脉的周围组织；T4：肿瘤侵犯腹腔干及肠系膜上动脉（不可切除）；周围淋巴结（N）Nx：周围淋巴结无法评估；N0:无周围淋巴结转移；N1：有周围淋巴结转移；远处转移（M）Mx：远处转移无法评估；M0：无远处转移；Ml：有远处转移；分期(Staging)TNM。期TisN0MOIA期T1NOMOIB期T2NOMOUA期T3NOMOIIB期T1N1MOT2N1MOT3N1MOHI期T4任何NMOIV期任何T任何NMl二.实验方法1新鲜组织标本的处理和无血清器官培养取自中国医学科学院肿瘤医院腹部外科的手术患者，在手术切除离体10分钟 内，由外科医生先切取新鲜的正常胰腺组织，然后切取生长良好的新鲜胰腺癌组织 花生大小，分别放入含1%青链霉素的L-15培养基的无菌瓶中，即时送往实险室。在 洁净的工作台中，加入10ml洗液，将正常胰腺组织及胰腺癌组织取出，放置于平皿 中洗净。用无菌手术刀片将胰腺癌及正常胰腺组织切成2mm3左右大小的小组织块，15北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分放入已经涂好胶原并划好沟槽的平皿中，4冰箱内静置2-3小时使组织块贴壁。从 冰箱内取出平皿后，小心滴加经过改良的LHO9无血清培养基（含表皮生长因子、转铁蛋白、胰岛素等），滴加时小心，以防将贴壁的组织块冲起。加完后将培养皿 放入培养盒中，充入含有50%、45%C 2和5%CO2的混合气体，密封好培养盒。将 培养盒放置在36.5、4%CO2孵箱之内的摇床上，摇摆频率3-4次/分，培养48-72小 时（本实验步骤在中国医学科学院肿瘤研究所病因及癌变研究室程书钧院士的实验 室内完成2培养上清中分泌蛋白质的收集和浓缩收集培养上清，在高速低温离心机上以4、5000g离心5分钟去除死细胞及组 织碎片，将离心后所得上清液转入超滤浓缩管（Millipo re Amico nTM Centrif ugal Filter Devices,5,000NMWL）,以5000g、4离心45分钟超滤浓缩及除盐。弃滤出液，用预冷灭菌的去离子水洗涤蛋白质并重复离心两次，至细胞培养上清为无色透明 状，浓缩约25倍左右。经浓缩的蛋白质少量分装后保存于-80（由孙玉琳博士完成）（孙玉琳,2008）3 Bradford法蛋白定量蛋白定量的具体方法参照Co mmassie Plus蛋白定量试剂盒说明书。首先将BSA 标准蛋白质稀释成不同的浓度，绘制曲线拟合的标准曲线。然后，取适当稀释比例 的蛋白质样品加入以上反应体系，同法测定样品蛋白质的吸光度值，根据曲线计算 待测样品的蛋白质浓度。4培养上清分泌蛋白质的Shotgun LC-MS/MS分析将来自于一例胰腺导管腺癌（1T）一例正常胰腺组织（1N）及混合正常胰腺 组织NP1（包含IN、3N、4N）的条件培养基上清液浓缩蛋白经Sho tgun LC-MS/MS 研究策略重复三次分析。首先将16年酶切产物经过反相高效液相色谱分离，线性洗 脱获得的组分直接进入ESI离子源系统进行质谱鉴定，质谱数据由SEQUEST软件解 析。5培养上清分泌蛋白质的SDS-PAGE HDMS分析5.1 SDS-PAGE 分离先配制5%的积层胶及12%的分离胶。将两例PDAC（IT,2T）一例正常胰腺 组织（1N）.一例混合的正常胰腺组织NP2（包含3N、5N、6N）的培养上清浓缩蛋 白质各60年，与1 XLaemmli上样缓冲液（0.25M Tris-HCl PH=6.8、0.5%溟酚蓝、10%SDS 50%甘油、10%B-毓基乙醇）混合后，煮沸10分钟。蛋白质产物变性后 16北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分加样，以积层胶80V、分离胶120V的恒定电压电泳，直至漠酚蓝跑出凝胶。电泳缓 冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mM Tris-HCK 250mM 甘氨酸、0.1%SDS）。将 聚丙烯胺凝胶放入染色液（45%甲醇、10%乙酸、2.5%考马斯亮蓝R-250）染色2小 时后，用脱色液（45%甲醇、10%乙酸、40%去离子水脱色至显示清晰的蛋白条 带。用去离子水洗涤凝胶两次，每次5分钟。5.2 切胶及胶内酶解用蒸储水清洗凝胶，将聚丙烯胺凝胶按分离的蛋白泳道切成5163个条带，再把 每一条带切成Imn?的小块，每一条带切成的小块收集在不同的离心管内。如果凝胶 片仍然是蓝色的，则将其放入100-1503的1。mMNH4HCC）3进行再水化，并加热至 37o 10至15分钟后，再加入等体积的乙礴。涡旋该溶液30秒，然后离心，除去上 层清液并用乙月青收缩凝胶。用真空离心机抽干凝胶碎片。如果考马斯亮蓝染色依然 存在，则重复上述脱色步骤。用150山水清洗凝胶碎片5分钟。离心凝胶碎片并除去 上层清液。向凝胶碎片中加入乙精（凝胶片的3至4倍体积）并等待10至15分钟，直 到凝胶碎片收缩并变成白色。用真空离心机抽干凝胶碎片。加入胰酶消化液（40mM NH4HCO3、4mMCaCl2s 12.5%胰酶），4下使凝胶重新泡胀30-45分钟后，取出多 余的消化液并补加5-25似的缓冲液（42 mM NH4HCO3 4.2mMCaCl2）使其覆盖上层 凝胶并保持潮湿的酶切环境，于37。消化6小时。离心并除去上层清液，用15M的 100mMNH4HC03清洗15分钟，然后离心并除去上清液。用乙月青使凝胶脱水。除去 上层清液，并用真空离心机抽干凝胶碎片。用尽可能少的含有12.5ng/W胰岛素（w/v）的50mM NH4HCO3消化缓冲液，对凝胶颗粒进行再水化，并于4温育30至45分钟。如果凝胶碎片在15至20分钟内吸收了所有液体，则再向凝胶碎片中添加缓冲液。在 37C下将凝胶温育16小时。为了回收肽，向消化混合物中加入50a甲酸和乙睛的混 合液（2.5%甲酸、50%的乙睛），并用超声波振动10分钟。对适当体积（即浸没凝 胶片所需体积的两倍）的消化混合物执行2至3次萃取，充分提取多肽。每次清洗后，使用凝胶移液吸头将上层清液转移至Eppendo rf 微量试管内。混合所有提取多肽 上清，真空离心干燥。5.3 NanoLC-HDMS MS/MS分析将来自不同条带的所有酶解肽段都经Nano LC-MS/MS o n AcquityTM Nano UPLC system 和Synapt高精度质谱分析（HDMS,High-def initio n mass spectro metry）o 肽段混合物经过Luna 3um Cl 8柱（100X 4.6mm）进行色谱分离。流动相A为0.025M 乙酸钱水溶液（PH=4.5）,流动相B为O.O25M乙酸钱甲醇溶液。流动相B线性梯度从 25%到50%,时间为9分钟。流动相速度为ImL/min。17北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分由C18柱流出的洗脱组分由纳升级电喷雾接口喷出，电压为3.5kV,检测方式为正 离子。HDMS采用数据依赖的二级质谱扫描模式，质量检测范围为m/z 100-2,000o 每次扫描（2秒）后一次选择质谱中强度最强的两个离子峰进行二级质谱分析（1秒）。非包被毛细管电压设置为2300V。应用Gluf ibrino peptide校准二级质谱模式下的仪器。应用PLGS2.3软件生成离子峰列表，每次LC-MS/MS扫描都自动形成一个单独的PKL 文件。6数据库检索及生物信息学分析应用互联网Masco t数据集（在线网址：http:/www.matrix science.co m/）检索，设置参数为：数据库为NCBInr,允许一个胰酶漏切位点、一级质谱和二级质谱容差 为0.2Da、检索设定肽序列氨基酸可变修饰为Methylthio（C）及Carbo x ymethyl（C）、分 类学设置为人类，数据格式PKL。Masco t蛋白打分大于37且至少包含1个肽段的蛋白 作为鉴定结果。应用Unipro t（在线网址：http:/www.unipro t.o rg）蛋白数据库对鉴定 蛋白做Gene Symbo l、功能、信号肽、细胞定位、分子量分析。18北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分结果Shotgun LGMS/MS鉴定结果采用建立的无血清器官培养体系，收集并浓缩了来自于正常胰腺和胰腺癌组织 的分泌蛋白质，随后采用了Sho tgun LC-MS/MS策略，分析了 1例胰腺导管腺癌的胰 腺癌（1T）及其癌旁组织（1N）,以及3例胰腺等量混合的NP1（IN、3N、4N）的分 泌蛋白质。每个条件培养基样本重复分析了三次以确定鉴定方法的可重复性，并获 得高可信度的分泌蛋白质。三次平行分析分别在NP1条件培养基内鉴定到45、49和 49个蛋白质，1N条件培养基内鉴定到28、22及21个蛋白质；1T条件培养基内鉴定到 277、287及271个蛋白质。3个样本的三次平均重合率约为27%。约49%的蛋白质鉴 定到两次以上。二 SDS-PAGE HDMS鉴定结果采用SDS-PAGEHDMS蛋白质组技术策略，分析了两例PDAC（IT、2T）一例 正常胰腺组织（1N）、混合的正常胰腺组织NP2（包含3N、5N、6N）的培养上清浓 缩蛋白质。SDS-PAGE分离后切胶，胰酶酶解后经过Nano LCMS/MS o n AcquityTM Nano UPLC system和Synapt高精度质谱分析。应用Masco t检索二级质谱数据库，确 定蛋白质鉴定结果。NP2、IN、IT、2T培养上清中分别鉴定到179、89、515和252 个蛋白质。其中1N和NP2重复鉴定的蛋白质为28个，1T和2T重复鉴定的为76个。三 胰腺癌特异分泌蛋白质组数据集的建立为了保证鉴定的正常胰腺组织及胰腺癌组织的分泌蛋白质的高可信度，鉴定的 蛋臼质必须满足以下条件方可纳入胰腺癌特异分泌蛋白质组数据集：（1）Sho tgun LC-MS/MS研究路径中，三次均能够重复鉴定的蛋白质；（2）SDS-PAGEHDMS技 术策略由于HDMS的高精度特性，因此该体系鉴定到的蛋白质均视为高质量蛋白 质，纳入数据集。Sho tgun LC-MS/MS路径中IT、IN和NP三次平行试验重复鉴 定的蛋白质数目分别是110、5和9,则正常胰腺组织分泌蛋白质鉴定数目为14,胰腺癌组织分泌蛋白质鉴定数目为110o SDS-PAGE HDMS研究路径中正常胰腺组 织分泌蛋白质鉴定数目为240,胰腺癌分泌蛋白质数目为691。两组路径数据合并，正常胰腺分泌蛋白质中去除两组重复鉴定的5个后剩余数目为249,胰腺癌去除重 复鉴定的72个后剩余数目为729。经过对比分析，发现159个蛋白质同时在正常胰 腺及胰腺癌分泌蛋白质组中出现，予以去除后，最终确定其余570个蛋白质为胰腺 癌特异分泌蛋臼质组。19北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文第一部分讨论一 蛋白质组学的发展及其胰腺癌研究的流程蛋白质组一词最早是由澳大利亚Macquarie大学的 Wilkins和 Williams在1994 年提出，最早见诸于文献是在1995年3月的Electro pho resis(Witzmann,et al.,1995)杂志上。国内中文首次提到蛋白质组概念的文献(陈竺,1996)为卫生部陈竺部长发表 在生命科学的世纪之交的生命科学与中国生命科学界一文。十余年来，蛋 白质组学发展迅猛，广泛应用于生命医学研究的各个领域。蛋白质组(Pro teo me)的定义为：一个基因组、一个细胞、一种组织或一个生物 体在特定的时间和空间上所表达的全套蛋白质。蛋白质组学则是蛋白质组概念的延 伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律，分析细胞全部蛋白质的 结构、功能和相互作用，蛋白质组学能动态、整体、定量地研究