小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用.pdf

中国牛业科学():科学试验小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用师志海王亚州谢 楠王文佳(.河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州.河南牧业经济学院 制药工程学院郑州)摘 要:本实验以中药提取物小檗碱为研究对象探究其对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用 实验采用常量肉汤稀释法测定小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度()随后分别选取 、.浓度小檗碱采用结晶紫染色法测定其对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的抑制率同时采用实时荧光定量 测定 、.小檗碱对金黄色葡萄球菌 基因的表达情况 结果显示小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度()为./、.浓度小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率分别为.、.和.荧光定量 测得各组金葡菌 基因的 值大小为 值(.)值(.)值()说明随着小檗碱浓度的增大对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增强呈现明显的浓度依赖性 本研究为小檗碱对金黄色葡萄球菌感染的防治提供数据支持关键词:金黄色葡萄球菌细菌生物被膜小檗碱实时荧光定量 中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:修回日期:基金项目:河南省农业科学院自主创新项目资助()作者简介:师志海()男博士副研究员主要从事牛羊疾病研究和健康养殖 金黄色葡萄球菌(.)(简称:金葡菌)是一种重要的人兽共患病病原呈革兰氏染色阳性极易引起人和动物罹患多种慢性感染性疾病 近年来金葡菌对人及畜禽的感染率逐年升高难以治愈且容易反复感染已成为威胁人类健康和畜牧业发展的重要病原菌之一 金葡菌在动物体内外均可形成生物被膜()生物被膜是复杂的、固着的微生物群落以细菌自身分泌的水化聚合物为载体黏附在生物体或非生物体表面从而抵御环境对细菌的清除作用 研究表明金葡菌包裹在其生物被膜内可以躲避抗菌药物对其的杀灭作用且同时能够逃逸宿主免疫系统与免疫细胞的吞噬作用从而进一步增强金葡菌对抗生素的耐药能力使得临床上对金葡菌的防控更加困难 因此找寻有效抑制金葡菌生物被膜形成的药物已成为防控金葡菌感染的又一方向我国应用中草药治疗细菌感染性疾病已有千年历史近年来中草药提取物的抗菌作用研究已成为国内外医药领域研究热点 小檗碱又称黄连素是从黄芩、黄连、黄柏等中药植物中提取的一种异喹啉生物碱对多种革兰氏阳性菌和阴性菌均有一定的抑制或杀灭作用 研究发现小檗碱可通过改变 菌株细胞膜脂肪酸的种类及含量显著破坏菌株细胞膜的完整性且有助于增强常用抗生素对引起奶牛乳房炎的多重耐药金葡菌的抗菌活性此外小檗碱在兽医临床能够有效治疗金葡菌引起的大鼠乳房炎金葡菌生物被膜作为金葡菌抵御逆境的一种有效生长模式研究显示一些中药提取物对金葡菌生物被膜都有一定抑制作用如穿心莲内酯、黄芩苷和大黄水提物等 小檗碱对金葡菌的抑制作用是否能够通过抑制其生物被膜的生长而起作用是本研究的重点内容 本研究以金葡菌为研究对象探讨小檗碱对金葡菌生物被膜的体外抑制作用为小檗碱应用于金葡菌感染疾病的预防及临床治疗提供数据支撑 材料与方法.实验材料与设备小檗碱(号:)购自上海源叶生物科技有限公司 金黄色葡萄球菌()为本实验室保存 胰蛋白胨大豆肉汤培养基()购自广东环凯微生物科技有限公司 结晶紫染料购自碧云天生物技术公司 购自北京全式金生物技术有限公司 光吸收酶标仪()购自上海闪谱生物科技有限公司 荧光定量 仪()购自美国 公司.实验方法.小檗碱药液制备 准确称取小檗碱药物.用无菌蒸馏水定容至 混匀超声使用.无菌针头过滤器过滤除菌制浓度为./的小檗碱溶液 保存备用.结晶紫染色液的配制 准确称取结晶紫.溶于 乙醇中制得结晶紫乙醇饱和溶液称取.草酸铵溶于 无菌蒸馏水中充分混匀后制得 草酸铵水溶液 取 结晶紫乙醇饱和溶液和 草酸铵水溶液混匀静置 后过滤制得 结晶紫染色液 保存备用.金葡菌菌悬液制备将冷冻保存的金葡菌菌种划线接种到血琼脂平板上 培养 后制作细菌抹片并进行革兰氏染色观察细菌性质及形态结构 将形态结构鉴定正确的菌落接种到营养琼脂上待琼脂板上长出单菌落后挑取单菌落接种到 培养基中 培养 将培养菌液进行平板计数根据平板计数结果计算菌液浓度后使用普通肉汤将菌液稀释成 /.最小抑菌浓度测定采用肉汤稀释法测定小檗碱对金葡菌的最小抑菌浓度()用无菌蒸馏水倍比稀释小檗碱药液并分装试管之后将活化后的金葡菌菌液加入试管使小檗碱的终质量浓度分别为:第 支试管/第 支试管 /第 支试管./第 支试管./以此类推同时设仅含菌液的试管为阴性对照仅含药液的试管为阳性对照仅含肉汤的试管为空白对照将试管放入 恒温培养箱中静置培养 观察试管中是否有沉淀产生无沉淀产生的最低药物浓度为小檗碱对金葡菌菌液的.小檗碱对金葡菌生物被膜抑制率的测定将不同浓度的小檗碱溶液与金葡菌菌液混匀至试管中使小檗碱终浓度分别为 、和.向试管中加入剪裁好的.无菌输液管片实验设仅含菌液的试管为阴性对照仅含药液的试管为阳性对照仅含肉汤的试管为空白对照将试管放入 恒温培养箱中静置培养 采取结晶紫染色法测定小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制情况 取出输液管片冲去浮菌移至洁净无菌的 孔板中每孔添加 甲醇固定输液管片 后弃去室温干燥 加入 的结晶紫染液染色 弃去染色液再用无菌蒸馏水清洗 次除去浮色室温干燥 每孔用 无水乙醇脱色 除去输液管片 下测定各孔吸光度按照下列公式计算抑制率细菌 生 物 被 膜 抑 制 率 (阴性 实验)(阴性).小檗碱对金葡菌的抑制作用将“.”中、.实验组试管中的菌液进行菌落计数观察各实验组中金葡菌的生长状况.荧光定量测定金葡菌生物被膜 基因的转录表达.引物设计与合成根据 中金葡菌 基因的保守序列使用 .设计一对特异性引物引物序列如表 所示引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成表 引物序列引物名称序列()产物长度/.细菌 提取各实验分组及处理同“.”分别取 、.实验组试管中的菌液./离心 弃去上清液向菌泥中加入 处理水采取水煮法提取金葡菌模板 第 期师志海等:小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用.实时荧光定量 实时荧光定量 检测金葡菌 基因的转录水平 以提取的 为模板按照 试剂盒的反应体系进行扩增即 ()().上、下游引物各.()模板 .扩增条件为预变性 共 个循环 反应结束后得到扩增曲线、熔解曲线及 值 每个样品作 个重复 结果.小檗碱对金葡菌的 本实验采用常量肉汤稀释法测定小檗碱对金葡菌的最小抑制浓度 阴性对照组试管中有肉眼可见沉淀且液体浑浊阳性对照组和空白对照组试管无肉眼可见沉淀且液体清亮 可见第 根试管中出现沉淀(图)小檗碱对金葡菌的 为./图 小檗碱对金葡菌的.小檗碱对金葡菌生物被膜抑制率阴性对照组即仅含金葡菌组结晶紫染色后颜色较深阳性和空白对照组经结晶紫染色后基本为透明色(图)、和.小檗碱组染色后颜色呈逐渐加深趋势表明小檗碱浓度越高其对金葡菌生物被膜的生长抑制作用越强 处测得各孔吸光度见表 实验组吸光度远小于金葡菌菌液组且随着小檗碱浓度的不断增大吸光度逐渐减小(图)表明小檗碱对金葡菌生物被膜的生长有明显的抑制作用、和.浓度的小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制率分别为.、.和.且随着小檗碱浓度不断升高抑制率不断增大表明小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制作用呈现浓度依赖性图 各实验组结晶紫染色情况表 吸光度值实验组药物对照阴性对照空白对照 .小檗碱药液金葡菌菌液营养肉汤.中国牛业科学 第 卷图 小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制作用.小檗碱对金葡菌的抑制作用对、.实验组试管中的金葡菌进行涂板计数肉眼观察可见 和.实验组金葡菌数量多不可数 实验组金葡菌数量较前 组减少(图)表明随着小檗碱浓度的不断增大金葡菌数量逐渐减小说明小檗碱对金葡菌增殖的抑制作用呈现浓度依赖性与“.”结果相一致图 不同 浓度小檗碱对 抑制作用.金葡菌生物被膜 基因的转录表达荧光定量 扩增金葡菌的 基因扩增产物在 值为 处出现单一波峰无引物二聚体和非特异性扩增峰(图)扩增曲线呈“”形基线期平整指数期明显平台期基本平整(图)各实验组 基因的 值见图 由图 和 图 分 析 可 知 ()()(.)(金葡菌组)即较之于金葡菌组模板.组所含模板量减少 组次之 组最少说明小檗碱干预下金葡菌生物被膜 基因转录水平有所降低小檗碱浓度越高 基因转录水平越低表明小檗碱对金葡菌的生长有明显的抑制效果图 基因熔解曲线第 期师志海等:小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用图 基因扩增曲线图 各实验组 基因的 值 讨论细菌生物被膜是一群复杂的、固着的微生物群落它们能够附着在细胞表面也可作为聚集体牢固地埋在细胞外基质中 生物被膜通过编码耐药基因、阻止抗生素进入、降低生长速度和对抗宿主免疫系统等过程而引起抗生素耐药性产生生物被膜的细菌分离株往往表现出比非生物膜产生株更大的多重耐药性 研究显示 个革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌分离株中有.的分离株能够形成生物被膜另外 的革兰氏阳性分离株是能够产生生物被膜 生物被膜的形成是多种超级细菌发展的原因如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素金黄色葡萄菌、耐药克雷伯菌和产生金属 内酰胺酶的铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌感染常呈持续性和顽固性其中金葡菌形成的生物被膜与抗生素耐药性相互依赖相互作用是导致疾病慢性发展的原因之一 临床分离株检测显示 株金黄色葡萄球菌中 株(.)为耐甲氧西林金葡菌()株(.)为对甲氧西林敏感的金葡菌()其中 菌株的生物膜产量较 菌株更多且生物膜厚度更厚鉴于生物被膜在金葡菌感染疾病发展历程中的重要角色开发能够抑制生物被膜形成或根除或分散预先已形成的生物被膜的治疗策略已成为防控金葡菌感染的又一方向 近年来启发于中国传统中药防治金葡菌感染的应用史使用中草药提取物抑制金葡菌生物被膜形成、增殖及发展的研究已成为医药研究领域的热点如中药复方三黄汤、何首乌水提物、酸枣提取物和银杏果皮提取物等均能通过破坏 生物被膜的形成从而抑制耐药金葡菌感染 本研究发现小檗碱对金葡菌生物被膜形成的抑制作用呈现剂量依赖性浓度越高对生物被膜的抑制效果越好其中 的小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制率可达.另外实时荧光定量检测小檗碱对金葡菌 基因的表达情况显示不同浓度小檗碱作用金葡菌后小檗碱浓度越高金葡菌 基因的表达越低 小檗碱对金葡菌生物被膜的抑制作用与其对金葡菌增殖的抑制作用相一致说明小檗碱对金葡菌的抑制作用与抑制金葡菌生物被膜的形成直接相关 有报道指出小檗碱体外对耐甲氧西林金葡菌有较好的抗菌作用能够有效减少金葡菌生物被膜的形成 加之小檗碱毒副作用小、价格廉价且易提取等优点因此小檗碱可作为抗金葡菌感染尤其是耐药金葡菌感染的新型抗菌药物市场应用前景很大参考文献:.():.:.():.():.():.:.():.中国牛业科学 第 卷 .:.祝司霞.穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌生物膜的体外抑制作用.广东医学 ():.:.元炼 张姣 刘兰妹 等.中药提取物对金黄色葡萄球菌生物膜作用的研究.天然产物研究与开发 ():.綦国红 张佳怡 杨志萍 等.茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生的影响.食品工业 ():.尤理想 赵青 周敏 等.细菌生物膜检测方法改进与应用.实验技术与管理 ():.闻子钰 梁昊 顾一心 等.细菌核酸提取方法对荧光定量 检测差异分析.中国病原生物学杂志 ():.:.().:.():.()().().:.():.:.():.():.():.:.():.(.):(.).().()./.(.)(.)().:第 期师志海等:小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用