绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响.pdf

响134-07ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-10-2 52024,54(01):134-140中国兽医科学DOI:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0020中图分类号：S821.34文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 4)0 1-0绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影苗丰帅，李靖，蒋欣怡，陈宣旭，于海滨，姜平，林紫薇，赵志辉，照那木拉*（广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江524088)摘要：为了提高冻-解后精液品质，探讨绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响，笔者在冷冻保存稀释液中分别添加10 0 mol/L的绿原酸（CGA)和咖啡酸（CA），并以无添加组为对照，实施了冷冻保存实验。通过检测冻-解后精子活率、活力、生存率、质膜完整性、顶体完整性等指标评估精液品质，并检测了活性氧(ROS)水平、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、氧化产物丙二醛(MDA)、线粒体膜电位（MMP)等抗氧化指标。结果显示，在冷冻保存稀释液中添加CGA和CA可显著（P0.05)提高冻-解雷州山羊精液品质（精子活率、活力、生存率等），有效提高SOD、G SH-PX、CA T 等酶活性和MMP(P0.05)，降低了精子ROS水平和MDA的含量（P0.05），从而提高了雷州山羊精液冷冻保存效果。结果表明，在冷冻保存稀释液中添加CGA和CA能显著提高冻-解后雷州山羊精液品质和抗氧化性能，进而提高雷州山羊精液冷冻保存效果关键词：绿原酸；咖啡酸；雷州山羊；精液冷冻保存；氧化应激Effects of chlorogenic and caffeic acids on the cryopreservation ofsemen from Leizhou goatsMIAO Fengshuai,LI Jing,JIANG Xinyi,CHEN Xuanxu,YU Haibin,JIANG Ping,LIN Ziwei,ZHAO Zhihui,Zhaonamula*(College of Coastal A gricultural Sciences,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)Abstract:To improve the quality of frozen-thawed semen,this study investigated the effects of chlorogenicacid(CGA)and caffeic acid(CA)on the cryopreservation of semen from Leizhou goats.100 mol/L CGA and CAwere added to the freezing dilution solution,respectively.The group without addition served as the control,andcryopreservation experiment was conducted.The semen quality was evaluated by assessing frozen-thawed spermviability,motility,survival rate,plasma membrane integrity,acrosome integrity,and antioxidant indicators such asreactive oxygen species(ROS)level,catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-PX),malondialdehyde(MDA),and mitochondrial membrane potential(MMP).The results showed that the addition ofCGA and CA in the cryopreservation diluent significantly improved frozen-thawed semen quality(sperm motility,viability,survival rate,etc.)of Leizhou goats(P0.05).The enzyme activities of SOD,GSH-PX,CAT and MMP were ef-fectively increased(P0.05),and the sperm ROS level and MDA content were decreased(P0.05),so the cryopreser-vation effect of Lezhou goats semen was improved.The research results indicate that the quality and antioxidant收稿日期：2 0 2 3-0 9-0 1；修回日期：2 0 2 3-10-2 1基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2 0 2 2 B0202110002）；广东省乡村振兴战略专项(2 0 2 2-XPY-00-010)；广东省自然科学基金项目（2 0 2 1A1515010867)；粤西地区畜禽资源与种质创新重点实验室基金项目（2 0 2 1A1515010867）；广东海洋大学科研启动基金项目（R17032,060302052315）作者简介：苗丰帅（1999-），男，山东菏泽人，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖，E-mail：mi a o f e n g s h u a i 16 3.c o m。*通讯作者：照那木拉（198 1-），男（蒙古族），讲师，博士，主要从事哺乳动物卵母细胞体外成熟机理、体外受精机理、体细胞克隆及基因编辑技术的研究,E-mail:。135苗丰帅等：绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响第1期properties of Leizhou goats semen are significantly improved after frozen-thawed by adding CGA and CA to thefrozen preservation diluent,thereby enhancing the cryopreservation effect of Leizhou goats semen.Key words:chlorogenic acid;caffeic acid;Leizhou goats;cryopreservation of semen;oxidative stress*Corresponding author:Zhaonamula,E-mail:.随着畜牧业的高速发展，人工授精（artificial in-semination,AI)技术及精液保存技术的研究日益受到人们的重视1-2 。雷州山羊是生长在我国广东省亚热带地区的优良肉用品种，由于长期没有进行保种及育种规划，品种退化严重，部分优良基因丢失。为了解决扩繁和种质资源保存利用技术体系等关键问题，精液保存技术得到了广泛应用。精液保存是为了延长精子的有效存活时间，扩大精液的适用范围，便于长途运输。用于人工授精的精液，一般分为短期液态保存(0 2 5)和长期冷冻保存（-196）。近年来，羊液态保存精液方法已经普及，但是存在保存时间短和无法跨地域运输利用等问题，因此冷冻保存引起了人们的注意。然而，精液冷冻过程中精子容易受到冰晶以及渗透压等各种刺激3,导致解冻后精液品质下降严重，受胎率低和产仔数少，降低生产中应用AI的比例，影响优良公畜种质资源的广泛利用。因此使用冷冻稀释液用来降低冷冻损伤是必要的。在精液冷冻保存的过程中，由于精子细胞内外环境发生剧烈变化，精子会产生大量活性氧（reac-tive oxygen species,ROS),ROS 携带着不成对的电子，具有很强的氧化性，极易与精子质膜发生脂质过氧化反应，对精子细胞内组织造成损伤，使精子失去正常的生理功能。在冷冻条件下，精子内用于消除ROS的抗氧化酶活性会大大降低,ROS的产生速率超过机体内抗氧化体系清除ROS的速率，使得精子细胞内ROS含量过高，造成精子氧化损伤，最终导致精子活率和活力降低4。外源抗氧化剂添加到精液冷冻稀释液中，能够降低精子冷冻过程中所产生的过量ROS，降低ROS对精子的氧化应激损伤程度，提高冷冻精液品质。抗氧化剂的种类很多，常见的抗氧化剂可分为酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂，对减轻过氧化损伤和维持精子活力和受精能力有着重要的作用绿原酸（chlorogenic acid,CGA)作为一种非酶类酚型抗氧化剂，存在于多种植物和果实中，如咖啡豆、苹果、槟榔、胡萝卜等,其成分中含有咖啡酸（caf-feic acid,CA)。CG A 具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、降血脂降血糖、调控机体免疫等多种生物活性。目前，兼具多种功效的CGA已经成为天然产物的研究热点之一，被广泛应用于食品、医药等行业，但在畜牧业应用的研究报道较少。CGA在机体内复杂的反应中，能够通过形成稳定的半醌式自由基,阻断自由基的链式反应，及时清除化学类自由基和活性氧自由基从而发挥抗氧化作用。目前研究证实CGA可以提高猪冷冻保存精液5 和羊低温保存精液6 的精液品质及抗氧化能力。CA作为CGA水解反应的产物，同样具有抗氧化性能，可以为过氧化氢提供氢原子来减少脂质过氧化自由基含量，并终止脂质过氧化反应7 。已证实CA可以提高水牛冻-解精液品质和总抗氧化能力8 ,并可以减弱DNA损伤9。然而，目前未见CGA和CA作为抗氧化剂用以提高雷州山羊精液冷冻保存效果的相关报道。本研究通过在精液冷冻保存稀释液中添加CGA和CA，评估CGA和CA对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响，探讨CGA和CA对冷冻保存雷州山羊精液品质和抗氧化性能的影响机制，为雷州山羊精液冷冻保存稀释液配方的研发和人工授精的应用提供科学依据。1材料与方法1.1主要试剂绿原酸、咖啡酸、甘油、果糖、三羟基氨基甲烷、一水柠檬酸、二甲基亚砜均购自上海麦克林生化科技有限公司。DPBS、4%多聚甲醛、TritonX-100购自生工生物工程（上海）股份有限公司。硫酸阿米卡星购自上海源叶生物科技有限公司。EQUEXSTM购自日本MiyazakiKagaku株式会社。过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所有限公司生产。ROS检测试剂盒系武汉亚科因生物技术有限公司产品。LIVE/DEADSpermViabilityKit系Ther-moFisher公司产品。线粒体膜电位（mitochondrialmembranepotential,MMP)检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司1.2主要仪器3K15台式高速冷冻离心机购自曦玛离心机（扬州)有限公司。HH.S11-2水浴锅购自广州吉迪仪器136第54卷中国兽医科学有限公司。CX31生物显微镜、IX71倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。CytoFLEX流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司。SynergyHTX酶标仪购自BioTek Instruments公司。1.3精液采集公羊由广东省雷州山羊科技创新中心提供，精液分别采自个体状况良好的6 只2 3岁的健康雷州公山羊。使用直肠电刺激方法采精，保存于33保温杯中并在30 min内带至实验室进行检测。精液活力0.8 0 以上、密度10 10 8 SP/mL以上的样本用于试验1.4精液冷冻精液冷冻稀释液为Tris-卵黄基础稀释液，第一次稀释：包括4mg/mL果糖,2 9mg/mL三羟甲基氨基甲烷，15.9mg/mL一水柠檬酸0.2 mg/mL硫酸阿米卡星和2 0%(v/v)蛋黄。将精液样本稀释至4X10SP/mL，并分别添加2 0 0 mol/LCGA和CA，常温浸泡在30 0 350 mL纯净水的玻璃烧杯中，置于5冷藏柜平衡2 h，降温到5后进行第二次稀释（第一次稀释液中添加6%甘油和0.8%EQUEXSTM），等倍稀释,并平衡10 min。平衡结束后将精液吸人冻精细管，用封口粉封口，然后将冻精细管置于聚苯乙烯泡沫板上并放在液氮表面熏蒸10 min，最后放进液氮中保存。保存1周后，从液氮中迅速取出冻精细管,投入37 恒温水浴锅中解冻2 0 s以备检测1.5检测指标及方法1.5.1精子活率和活力检测解冻后，取10 L精液样本滴在加热到38 的载玻片上，并覆盖盖玻片于200X显微镜下目测评估精子活率和活力。每次观察至少3个以上不同视野，活力评估参考Namula等0 i的方法。检测精子活率实际上就是检测精液中存活精子数量与总数量的比值。精子活力是指精子复温后在一个视野中各运动类型精子的比例。精子运动的类型有以下5种：精子蓬勃地直线向前运动（A）、精子慢速向前运动（B）、精子在原位划圈旋转运动（C）、精子在原地依靠尾部旋转做摆尾运动（D）和精子无运动或死亡(E）。这5种运动类型的指数分别为100%、7 5%、50%、2 5%和0。精液中精子活力的计算公式为：精子活力=（AX100%+B75%十C50%+DX25%+EX0)/1001.5.2精子存活率检测存活率采用SYBR-14进行荧光染色测定，取2 0 0 L精液以2 0 0 0 r/min离心3min，弃上清并用DPBS洗涤一次，再用1mLDPBS进行重悬，加人5L1:50稀释的SYBR-14荧光染料，36孵育10 min，D PBS洗去多余染料后再重悬，加人5L碘化丙啶（propidiumiodide，PI）荧光染料，36孵育10 min，最后进行流式检测1.5.3精子质膜完整性检测J质膜完整性采用低渗肿胀试验（hypotonic swelling test,HOST)进行测定，取10 L精液与90 L含9mg/mL果糖和4.9mg/mL二水柠檬酸钠的低渗溶液混合，在38 水浴锅中孵育30 min后，每份样品取10 L并与10 L伊红染液混合后进行涂片。自然干燥后于40 0 显微镜下观察卷尾率，每次观察2 0 0 个精子以上。1.5.4精子顶体完整性检测顶体完整性采用考马斯亮蓝G250染色方法进行测定，取10 0 L精液以2000r/min离心3min，加人10 0 LDPBS洗涤2 次。将洗涤后的精子加入1mL4%多聚甲醛固定10 min，2000r/min离心10 min,弃上清并使用1mLDPBS洗涤一次，最后使用2 0 LDPBS进行重悬，涂片后浸泡在考马斯亮蓝染液30 min,冲洗后自然晾干,并于40 0 X显微镜下观察顶体着色情况，每次观察2 0 0 个精子以上。顶体区为蓝色且无破损为顶体完整，顶体区着色较淡或破损为顶体不完整1.5.5精子酶活性检测精子解冻后，取2 0 0 L精液，2000r/min离心后弃上清，与6 0 0 LTritonX-100混合，置于4环境中裂解2 0 min后，412 0 0 0 r/min离心10 min，保留上清液备用。CAT活性按照CAT试剂盒(A007-1)说明书进行检测。将试剂一和试剂二于37 水浴10 min,取1mL试剂一和0.1mL试剂二与0.1mL精子裂解液混合，并立即置于37 水浴锅1min。再与1mL试剂三和0.1mL试剂四混合，取2 0 0 L置于96 孔板中，在40 5nm处检测吸光度。SOD活性按照SOD试剂盒（A001-3)说明书进行，将精子裂解液与试剂在96 孔板中混匀，37 水浴2 0 min后测定450 nm处的吸光度GSH-PX活性按照GSH-PX试剂盒（A005-1)说明书进行测定。测定前将试剂一于37 水浴10min,取0.2 mL1mmol/LGSH与0.1mL精子裂解液混合，37 水浴5min，再加入0.1mL试剂一,37 水浴5min，最后加入2 mL试剂二混匀，350 0 r/min离心10 min，取1mL上清液作显色反应。室温静置15min后取2 0 0 L置于96 孔板中，测定412 nm处的吸光度。1.5.6丙二醛检测MDA含量按照MDA试剂盒(A003-1)说明书进行检测。将0.1mL精子裂解液与4mL工作液一混合，95水浴40 min，取出后流水冷却，350 0 r/min离心10 min，取2 0 0 L上清置于96 孔板中，测定512 nm处的吸光度。137苗丰帅等：绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响第1期1.5.7活性氧检测精子解冻后按照ROS试剂盒(KTB1910)说明书进行测定，使用DPBS稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 mol/L，将精子悬浮于DCFH-DA工作液中，置于37 培养箱内避光孵育30min，每隔35min颠倒混匀一次，使用DPBS清洗2 次后并重悬沉淀。流式细胞仪使用激发波长488nm，发射波长52 5nm，检测荧光强弱1.5.8线粒体膜电位检测精子解冻后按照MMP试剂盒(E-CK-A301)说明书进行操作。精液和JC-1工作液混匀,37 孵育2 0 min,4下用JC-1缓冲液离心洗涤3次,加人1mLJC-1缓冲液重悬,经流式细胞仪获取数据，MMP通过绿色荧光强度和红色荧光强度的比值来表示1.6数据统计与分析实验均重复4次以上。使用GraphPad8.0对数据进行作图分析。利用SPSS26.0按LSD(leastsignificancedifference）对所有数据进行方差分析（ANO-VA)以检测结果的显著性，并采用Tukey法对每组数据进行多重比较。数据表示为平均数土标准误(meanSEM)。P0.05表示差异不显著。2结果与分析2.1绿原酸和咖啡酸对雷州山羊冷冻保存精液品质的影响CGA和CA对冻-解后雷州山羊精子活力和活率的影响如图1所示，冷冻保存稀释液中添加CGA和CA可以显著提高冻-解精子活率和活力（P0.05）。CGA和CA对冻-解后雷州山羊精子存活率、质膜完整性和顶体完整性的影响如图2 所示。结果显示,CGA和CA可以显著提高精子的存活率（P0.05)。2.2绿原酸和咖啡酸对雷州山羊冷冻保存精子抗氧化性能的影响在精液冷冻稀释液中添加CGA和CA对冻-解后雷州山羊精子CAT、SO D、G SH-PX酶活性的影响结果如图3所示。结果显示，CGA和CA可以显著提高精子中CAT、SO D、G SH-PX酶活性（P0.05)。除此之外,CGA对 GSH-PX和CAT酶活性的提升效果要优于CA(P0.05)。CGA和CA对雷州山羊冷冻保存精子MDA含量、ROS水平和MMP的影响结果如图4所示，冷冻保存稀释液中添加CGA或CA均可显著降低精子中MDA含量、ROS水平和MMP（P 0.0 5）,其中CGA的效果更显著。3讨论与结论人工授精是现代生物技术的一种，能够充分发挥公畜的遗传潜力，而精液冷冻是人工授精的重要环节，为人工授精提供了精子库。但人工授精要保证精液在冻-解后的受精能力，因此需要减少冷冻过程中精子结构受到的损伤。由于精子膜富含多不饱和脂肪酸，再加上细胞质中缺少抗氧化酶，使得膜脂质对ROS的敏感度会更高，导致膜流动性会降低,改变膜蛋白的活性,造成精子活力降低11。ROS是新陈代谢的副产品，主要在精子本身和稀释液中产生，少量的ROS对细胞生长调节、信号传递和抗微生物防御等方面具有重要的作用。一旦过多产生和累积ROS，引起过氧化应激，可能通过一系列反A100-aB1007%/50-50FreshCTCGACAFreshCTCGACA图1CGA和CA对冻-解后精子活率和活力的影响Figure 1 Effects of CGA and CA on sperm motility and motility after frozen-thawedA为精子活率检测结果;B为精子活力检测结果。不同字母表示差异显著(P0.05)。A shows the sperm motility test results;B shows the results of sperm motility test.Different letters indicated significant diference(P0.05).138第54卷中国兽医科学ABCaa60-aa100-40-aa40bb502020-00Fresh CT CGA CAFresh CTCGA CACTCCACA图2 CGA和CA对冻-解后精子质膜完整性、顶体完整性和存活率的影响Figure 2 Effects of CGA and CA on plasma membrane integrity,acrosomal integrity and survival rate in sperm after frozen-thawedAC分别为质膜完整性、顶体完整性、精子存活率检测结果。不同字母表示差异显著（P0.05)。A-C shows the results of plasma membrane integrity,acrosome integrity and sperm survival rate respectively.Different letters indicated significantdifference(P0.05).ABC(./4715-a40-aa3-b30102205-110C000CTCGACACTCGACACTCCACA图3CGA和CA对冻-解后精子酶活性的影响Figure 3Effects of CGA and CA on enzyme activity in sperm after frozen-thawedAC分别为CAT、SO D 和GSH-PX酶活性检测结果。不同字母表示差异显著(P0.05)。A-C shows the results of CAT,SOD and GSH-PX enzyme activities respectively.Different letters indicated significant difference(P0.05).ABC(-Tu.Jowu一二M2580003-aaa20600015-bb2bb4.000-101-5-2.000-000CTCGACACTCGACACTCGACA图4CGA和CA对冻-解后精子MDA、RO S和MMP的影响Figure 4Effects of CGA and CA on MDA,ROS,and MMP in sperm after frozen-thawedAC分别为MDA、RO S和MMP检测结果。不同字母表示差异显著（P0.05）。A-C shows the detection results of MDA,ROS,and MMP respectively.Diferent letters indicated significant difference(P0.05).应导致轴丝蛋白质磷酸化降低，影响精子运动能力和精子膜的流动性。另外ROS的主要成分HO2,能透过细胞膜扩散到细胞内抑制一些酶的活性，使精子抗氧化防御能力降低，导致膜磷脂的过氧化损伤。因此需要在精液冷冻稀释剂中加人抗氧化剂用来抵抗ROS对精子的损伤、减少精子DNA片段化12 。与动物性来源的抗氧化剂相比，植物性来源的抗氧化剂具有来源广泛、提取过程中不容易受到高温影响、抗氧化能力稳定等特点13,植物性抗氧化剂中具有抗氧化活性的成分包括维生素C、多酚（类黄酮、酚139苗丰帅等：绿原酸和咖啡酸对雷州山羊精液冷冻保存效果的影响第1期酸等)和类化合物，其中多酚是主要的抗氧化剂，而酚酸中苯甲酸和肉桂酸苯环上的羟基基团具有清除自由基的活性14。CGA除自身具有抗氧化作用外还具有协同抗氧化作用,其与-生育酚、-胡萝卜素、芦丁等具有良好的协同抗氧化作用，而且在协同效果方面CGA在脂溶性自由基体系要优于水溶性自由基体系。本研究结果显示，添加CGA和CA对精子活率、活力和存活率均有显著提高。研究表明CGA或CA不仅对精子的活力和前进运动性能具有有利影响15,而且可以提高还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH)的水平。GSH是一种重要内源性抗氧化物,可以增强清除ROS的能力16 ,并且与能量代谢有关，二者呈剂量依赖性方式抑制谷氨酸脱氢酶，以降低ATP水平17 。质膜在保护细胞内环境稳态和调节细胞膜表面反应的生物过程起着决定作用18 ,另外质膜在顶体反应和精卵结合中占据重要作用，而HOST实验使低渗溶液进人精子后，导致尾部盘绕或肿胀，以此确定膜的完整性19。但是本研究结果显示,添加CGA或者CA对精子质膜完整性和顶体完整性的改善效果不显著。不过在Wang等19 对公羊精子的研究中，在添加CGA的当日，对照组和实验组中质膜和顶体完整性均无显著差异，但随着时间的增加，CGA对质膜和顶体的保护作用才显露出来。因此，时间因素或许是导致本实验添加CGA或CA未对质膜完整性和顶体完整性产生影响的原因。冷冻保存条件下，ROS通过诱导精子细胞膜内多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化而生成MDA,进而影响精子质膜的完整性。另外,CAT、SO D、G SH-Px是反映精子抗氧化能力的重要酶系，在精子氧化与抗氧化平衡中起着至关重要的作用。研究发现，50g/mL的CGA和10 0 mol/LCA对SOD、CA T、GSH-Px等抗氧化酶活性具有提升作用,并且可以降低MDA的含量(9.2 0 1。本实验结果中，冷冻稀释液中添加CGA和CA可以有效提高抗氧化酶如CAT、SOD、G SH-PX的活性，同时降低精子内ROS水平和MDA的含量，降低精子线粒体膜电位，显著抑制精子线粒体去极化。这说明CGA和CA的添加有助于提高精子内部抗氧化酶的活性，并减少ROS产生的自由基。本研究结果表明，雷州山羊精液冷冻保存时，在冷冻保存稀释液中添加CGA和CA能够显著提高冻-解后精子活力、活率和存活率，但对精子质膜完整性和顶体完整性的改善效果不明显。另外CGA和CA有效提高了抗氧化酶SOD、CA T、G SH-PX的活性,降低精子内ROS水平和MDA的含量，降低精子线粒体膜电位并显著抑制精子线粒体去极化。参考文献(References)1KUIPER M,SPENCER M,KANYIMA B M,et al.Using on-de-mand dry ice production as an alternative cryo-genic cold chain for bovine artificial insemina-tion outreach in low-resource settingsJ.Trans-lational Animal Science,2020,4(2):1196-1205.2KNOx R V.Artificial insemination in pigs todayJ.Theriogenology,2016,85(1):83-93.3SIEME H,OLDENHOF H,WOLKERS W F.Mode of action of cry-oprotectants for sperm preservationJ.Animal Repro-duction Science,2016,169:2-5.4张利坤，井辛宇，白腾，等.抗氧化剂对家畜精液冷冻保存效果的影响研究进展J.畜牧兽医杂志，2 0 18,37(5):37-41.ZHANG Likun,JING Xinyu,BAI Teng,et al.Research progressof effects of antioxidant on cryopresevatio of live-stock semenJ.Journal of Animal Science and Veteri-nary Medicine,2018,37(5):37-41.(in Chinese)5RABELO S 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