基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒.doc

(完整word)基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒一、目的对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。二、引物NIC引物引物名称碱基组成目的片段大小备注FluAFluA-M-F30TTCTAACCGAGGTCGAAACG235bp甲型流感病毒M基因通用检测引物FluAM-R264ACAAAGCGTCTACGCTGCAGH1HAH1 F1147AAGAGCACACATAATGCCAT527bpH1N1亚型检测通用引物H1 R1673CCATTRGARCACATCCAGHuH1HAH1HA F768ACTACTGGACTCTGCTGGAAC327bp人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物H1HA R1094CAATGAAACCGGCAATGGCTCCSWH1HA1SWH1 F786AATAACATTAGAAGCAACTGG153bp此次甲型H1N1亚型流感病毒引物SW-H1 R920AGGCTGGTGTTTATRGCACCRnasePRnaseP FAGA TTT GGA CCT GCG AGC G约80bp与realtime PCR中RnaseP引物一致RnaseP RGAG CGG CTG TCT CCA CAA GT三、材料及仪器1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog 74104）2、巯基乙醇（SIGMA Mercaptoethanol Lot 062K0115)3、70%乙醇4、RT-PCR Kit:QIAGEN One step RTPCR Kit（catalog 210212）5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111)6、检测引物7、Axygen 1。5mL离心管，货号:MCT-150-C8、Axygen 0.2mL PCR管,货号：PCR02C9、Axygen 10L，100L，200L，1000L带滤芯枪头10、10L，100L，200L,1000L加样器11、可调转速14K离心机：12、旋涡混合器：13、生物安全柜:二级生物安全柜14、PCR仪：15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 10168516、核酸染料：17、电泳液：5TBE电泳缓冲液 cat No。 9009032718电泳槽、电泳仪四、实验步骤（一）RNA提取1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1。5mL离心管分装，每管500L（在体系配制区操作）。2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100L加入RLT液管中，充分混匀.3、每管分别加入5L -巯基乙醇，混匀后依次加入600L 70%的乙醇,充分混匀。4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记.取步骤（3）中的混合液600L加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm，离心15s，弃离心液。6、于滤柱中加入700L Wash Buffer RW1液，12000rpm,离心15s。7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500L Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500L Wash Buffer RPE液，1300014000rpm，离心2min。9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入3050L的Rnasefree Water，室温静置13min.10、12000rpm,离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20以下保存。注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。（二）反应体系配制1、实验设计：检测标本RNA质控参数：阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）阳性对照:已知病毒RNA2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）1)按下表加入试剂：PCR反应体系组 分体 积（L）RNase Free Water5RT-PCR Buffer11。9n5n10mM dNTP Mixture1nEnzyme Mix1nRNase Inhibitor0。1n上游引物0.5n下游引物0。5nTotal20n对每一个建立的反应确定反应数(n=拟进行的PCR管数,包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1)如果包括对照，样品的数量(n）为1到14，那么N=n+1；（2）如果包括对照，样品的数量(n）大于15，那么N=n+2。2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20L,分别做好标记。 3）加RNA模板（在核酸提取区)将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5L无菌水),然后分别加标本RNA(每管5L)，最后加入阳性对照RNA(每管5L）。3、RT-PCR反应将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：温度 （oC）时间循环数601min14210min5030min9515min9430s355230s721min727min14保存4、RT-PCR产物检测1）2。0琼脂糖凝胶制备:称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液(1TBE）100mL,轻轻混匀后加热,使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至5060左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡).待胶温度降至50左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约3060min)之后,将梳子拔出。2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1TBE)浸过胶面即可。3）PCR产物各取10L,加入2L上样缓冲液（6Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内(先加Marker（DL2000）5L，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。4）电泳电压100V，约3040min后看结果.5)将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相.5、结果判断在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：PCR引物待检样品1待检样品2待检样品3待检样品4待检样品5待检样品6FluA_+/-H1HA_+/-HuH1HA_+_+/SWH1HA1_+_+/RnaseP+_结果判断非甲型流感病毒甲型流感病毒非H1N1亚型人季节性H1N1亚型流感病毒猪H1N1亚型流感病毒送国家流感中心复核送国家流感中心检测标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题