基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒.doc

(完整word)基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物

NIC引物
引物名称
碱基组成
目的片段大小
备注
FluA
FluA-M-F30
TTCTAACCGAGGTCGAAACG
235bp
甲型流感病毒M基因通用检测引物
FluA—M-R264
ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
H1HA
H1 F1147
AAGAGCACACATAATGCCAT
527bp
H1N1亚型检测通用引物
H1 R1673
CCATTRGARCACATCCAG
HuH1HA
H1HA F768
ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
327bp
人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
H1HA R1094
CAATGAAACCGGCAATGGCTCC
SWH1HA—1
SW—H1 F786
AATAACATTAGAAGCAACTGG
153bp
此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
SW-H1 R920
AGGCTGGTGTTTATRGCACC
RnaseP
RnaseP F
AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
约80bp
与real—time PCR中RnaseP引物一致
RnaseP R
GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT

三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog ＃74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β—Mercaptoethanol Lot 062K0115)
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit:QIAGEN One step RT—PCR Kit（catalog ＃210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111)
6、检测引物
7、Axygen 1。5mL离心管，货号:MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管,货号：PCR—02—C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL,1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜:二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No。 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1。5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀.
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记.取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm,离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase—free Water，室温静置1～3min.
10、12000rpm,离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
阳性对照:已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
1)按下表加入试剂：
PCR反应体系
组 分
体 积（μL）
RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer
11。9×n
5×n
10mM dNTP Mixture
1×n
Enzyme Mix
1×n
RNase Inhibitor
0。1×n
上游引物
0.5×n
下游引物
0。5×n
Total
20×n

对每一个建立的反应确定反应数(n=拟进行的PCR管数,包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1)如果包括对照，样品的数量(n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量(n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL,分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区)
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水),然后分别加标本RNA(每管5μL)，最后加入阳性对照RNA(每管5μL）。

3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反应程序如下：

温度 （oC）
时间
循环数
60℃
1min
1
42℃
10min
50℃
30min
95℃
15min
94℃
30s
35
52℃
30s
72℃
1min
72℃
7min
1
4℃
保存

4、RT-PCR产物检测
1）2。0％琼脂糖凝胶制备:称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液(1×TBE）100mL,轻轻混匀后加热,使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡).待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min)之后,将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE)浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL,加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内(先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30~40min后看结果.
5)将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相.

5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：
PCR引物
待检样品1
待检样品2
待检样品3
待检样品4
待检样品5
待检样品6
FluA
_
+
+
+
+
+/-
H1HA
_
_
+
+
+
+/-
HuH1HA
_
_
+
_
_
+/—
SWH1HA—1
_
_
_
+
_
+/—
RnaseP
+
+
+
+
+
_
结果判断
非甲型流感病毒
甲型流感病毒
非H1N1亚型
人季节性H1N1亚型流感病毒
猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核
送国家流感中心检测
标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题