什么是感受态及其他问题.doc

(word完整版)什么是感受态及其他问题1。什么是感受态？细菌处于0，0。1M CaCl2低渗溶液中，使菌细胞膨胀成球形，处于容易吸收外源DNA的状态，该状态称为感受态.2。 什么是转化?转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。3. 什么是质粒？独立于染色体之外的共价闭合环状DNA.4. 什么是基因重组？从广义上讲，任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂复合的基因交流。5。冷冻离心机的使用及注意事项(1） 开机设定：为了减少仪器的损耗，设定的加速度和减速度要低，最好设为3。（2 )温度：开机后可以先2500rpm空转，直到达到设定温度为止。（3) 开盖:尽量缩短开盖时间,因为时间太长，一方面使离心机内温度升高较大，另一方面也会增加离心机内的水汽凝结,加重了离心机的损耗。(4） 上转子:上转子时切忌用力过大，上的过紧，如果很紧的话会造成缓冲环的损耗。(5) 平衡:现在的冷冻离心机都有自动平衡功能，但是还是要平衡的,这样可以延长离心机的寿命.(6） 放离心管：一定要对称放置，尤其是1。5ml的管子离心时，因为这种转子样品孔很多,容易放错。（7) 转速的设定：离心机都有最高转速限制，不通转子的最高转速不一样,转子越小最高转速越高,注意不要超过最高转速.（8) 善后工作：离心完毕后一定要把离心机的转子卸下来，擦干离心机里的水滴，然后在关机。电动机的轴承加注润滑脂；检查整流子和电刷的磨损情况，有磨损过度的应立即更换。6.移液器的使用及注意事项（1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气.(2）为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时,吸头内壁会残留一层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。(3）浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量,可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。（4）可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20时重0。9982g.（5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。（6）移液器未装吸头时，切莫移液。 所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。 数字清清楚楚在显示窗中, 旋转到所需量程 (7)在设置量程时，请注意（8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体(如浓酸、浓碱、有机物等）。(9)严禁使用移液器吹打混匀液体。（10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度.同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作7。转化率及转化总数的计算统计每个培养皿中的菌落数. 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率(转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg） 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数8. 简述影响转化效率的因素提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： (1）. 细胞生长状态和密度： 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0。5时,细胞密度在5107 个/ml左右（不同的菌株情况有所不同),这时比较合适.密度过高或不足均会影响转化效率.（2)。 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA）.转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低.1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 (3)。 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR。),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 （4)。 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦.9。碱性裂解法提取质粒DNA的基本原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12。0-12。5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4。8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去.10。质粒有几种构型,转化率如何？细菌质粒DNA有可以相互转化的3种不同构型，即线状、环状、超螺旋。微生物常常通过质粒倡导从而在自然条件下发生基因重组，常见的方式有：接合、传导、转化.超螺旋转化率最高。11. 加入溶液，的目的和作用？碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液I使细胞悬浮，并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯合，抑制DNase的活性；溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒；溶液III使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性。12.酶切的基本原理限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段. 13. 影响酶切效果的主要因素（1）内切酶（2）(3)反应缓冲液（4）酶解温度与时间14.酶切时的注意事项（1）浓缩的限制性内切酶可在使用前以1限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。(2）购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀,再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。（3）尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10，否则酶活性将受到甘油的抑制。（4)通常延长时间可使所需的酶量减少,在切割大量DNA时可用.在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。（5）注意星号酶切活力。15.琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度.DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应.不同DNA,其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带.琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系.凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子.溴化乙锭（EB)为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EBDNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比.用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。16.溴化乙锭对DNA染色的原理及注意事项溴化乙锭（EB)为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EBDNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境.17.电洗脱法回收凝胶中的DNA的基本原理将电泳分离后含目的片段的琼脂糖切割下来, 装于透析袋中,继续在高电压下电泳，这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于分子量大,不能透过透析袋,从而保留于透析袋中。取出透析袋中含的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。18为什么电泳结束时要反向电压,电洗脱后的如何去除？电洗脱法回收凝胶中的DNA时在电泳结束时反向电泳1分钟，目的是使附着于透析袋上的DNA存在于透析袋中的电泳液中。电洗脱后的 去除主要是采用酚、氯仿抽提纯化。19。DNA片断回收过程中的注意事项(1）透析袋的处理（2）切胶时要尽可能的贴近DNA（3）尽可能的排完透析袋中的空气(4）透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行)， 加入适量缓冲液将透析袋浸没（5）电泳结束时要反向电泳1分钟左右20。植物基因组DNA提取的原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来.再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液.21.细胞提取液中包含的溶液及作用细胞提取液：1. 100mmol/L Tris.HCL pH8。0 (缓冲液，保护DNA） 5mmol/L EDTA pH8。0 （离子螯合剂，保护DNA) 500mmol/L NaCl 1。25 SDS （表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来） 1mol/L 巯基乙醇 (抗氧化剂以降低植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响） 2. 5mol/L KCl （高盐环境,利于DNA沉淀）22.PCR扩增基因的基本原理原理类似于DNA的天然复制过程.人工合成与待扩增的DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后,可将目的DNA扩增上百万倍.3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25-30个循环后DNA可扩增10 610 9倍。 23.外源基因在大肠杆菌中的诱导表达的实验原理将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合,从而不能进行外源基因的转录及表达,此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-BD半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。24. 重组子鉴定的方法（1）利用抗生素初步筛选（2)利用蓝白反应初步筛选（3）酶切方法（4）PCR方法(5）测序方法其中方法1，2方便快捷，但假阳性较高；方法3，4是常规方法，也存在假阳性；方法5最可靠，但费用较高。25。 简述蓝白筛选的原理许多载体（如系列)有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码半乳糖苷酶端的序列。当无外源基因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷酶表达， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子