一种便捷的小粒种子表型观测方法_李明雨.pdf

一种便捷的小粒种子表型观测方法草学CAOXUE一种便捷的小粒种子表型观测方法李明雨1，吴昱果1，洪军2，刘芳2，刘志鹏1*(1 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室/兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州7300020;2 全国畜牧总站，北京100125)摘要:种子表型在植物种质资源研究中至关重要，但便捷且高精度地观测小粒种子一直以来是种子研究的难点之一。为解决此问题，本文采用便捷且低成本的智能手机改良法、普及率低且高成本的多光谱种子表型成像分析系统(简称为多光谱法)和普遍使用的扫描仪法对比观测小粒种子表型。结果表明，智能手机改良法测定的种子长度、宽度、面积及长宽比与多光谱法无显著差异(P0.05)，但扫描仪法与多光谱法、智能手机改良法间存在显著差异(P0.05)，且随着种子粒径的减小扫描仪法无法准确识别待测种子。与多光谱法和扫描仪法相比，智能手机改良法对种子颜色、表面纹饰等细节识别准确，便携性强且成本低廉，因此，在千粒重低于 2.8g 的小粒种子表型测定中推荐使用智能手机改良法，该方法适于在基层事业单位、实验站、中小企业实验员、野外科技工作者等人群中使用。关键词:小粒种子;体视显微镜;图像处理软件;种子表型中图分类号:S812文献标识码:A文章编号:20963971(2023)01001507DOI:10.3969/j.issn.20963971.2023.01.003收稿日期:20220818基金项目:国家重点研发计划重点专项项目课题(2019YFC0507702);国家自然科学基金面上项目(32071862);甘肃省重大专项子课题(19ZD2NA002)共同资助作者简介:李明雨(1994)，男，宁夏盐池人，博士研究生，主要从事牧草种质资源与分子育种研究，Email:limy19 *通讯作者:刘志鹏(1979)，男，陕西咸阳人，教授，博士生导师，主要从事牧草种质资源与分子育种研究，Email:lzp 植物表型是基因型和环境共同作用产生的，它是基因型在环境中的实际表现，也是基因功能研究和植物育种的重要桥梁13。植物表型分析是植物遗传多样性研究中的重要途径，研究植物的表型多样性不仅有助于了解植物响应生态环境和遗传变异的规律，还有助于了解生物适应和进化的方式、筛选具有经济和生态价值的性状，对植物种质资源的创新与高效利用具有促进和推动作用46。种子作为植物的繁殖体系，在物种的延续中具有重要作用，因此种子是植物表型研究的重要器官79。种子表型主要包括种子大小(种子长、宽和面积)和种子形状(长宽比和圆度)10，11，它们与植物的进化适应密切相关，比如越大的种子体内贮存的营养成分越多，萌发能力和非生物胁迫耐受性越强，而 种 子 越 小 越 有 利 于 扩 散 传 播12，13。前人研究种子表型的测定方法主要是游标卡尺直接测量法14，15，近年来，国内外各品牌的种子分析仪逐渐取代了游标卡尺10，16，17。利用种子分析仪可以更快速、精确地测定种子表型，但在测定粒径过小的种子时可能会面临测定精度不高的问题。因为仪器和方法的限制，小粒种子表型的观测一直以来是种子研究的难点之一。截至目前，关于小粒种子表型测定的新方法鲜见报道。随着计算机技术的发展，数字图像技术日趋成熟且已广泛应用于植物研究领域1820，因此利用数字图像方法快速精确测定小粒种子表型具有可行性。而且目前智能手机拍照功能发展迅速，已逐渐接近专业相机的水平。图像处理软件也被一些研究者用于植物叶面积的测量1820，但其在种子表型研究中51草学CAOXUE草业科学2023 年第 1 期总第 270 期的应用未见报道。本文选取 20 个小粒种子的物种，利用智能手机改良法观测其种子表型，并与常用的多光谱种子表型成像分析系统和扫描仪法进行对比，旨在探寻一种便捷且高精度观测小粒种子表型的方法并验证其准确性，以期为种子表型研究，尤其是农林基层事业单位、实验站和中小种子企业的日常观测，以及野外种子采集、观测工作提供服务。1材料与方法1.1试验材料选取 20 份植物种质材料(千粒重分布范围为0.0192.831g)，每份材料选取 50 粒大小一致的种子进行测定，3 次重复(见表 1)。表 120 种供试小粒种子相关信息材料名称拉丁名种子千粒重(g)材料名称拉丁名种子千粒重(g)拟南芥Arabidopsis thaliana0.0190.002籽粒苋Amaranthus hypochondriacus0.7010.007烟草Nicotiana benthamiana0.0840.002毛连菜Picris hieracioides0.9940.015湿生扁蕾Gentianopsis paludosa0.0960.002生菜Lactuca sativa var.ramosa1.0150.009小米草Euphrasia pectinata0.1030.002甘肃棘豆Oxytropis kansuensis1.0370.025朝天委陵菜Potentilla supina0.2030.010沙蓬Agriophyllum squarrosum1.1460.015秦艽Gentiana macrophylla0.2090.007白菜Brassica rapa var.glabra1.5690.013平车前Plantago depressa0.2800.004紫花苜蓿Medicago sativa1.7950.022广序剪股颖Agrostis hookeriana0.3060.005胡萝卜Daucus carota var.sativa2.0140.018冷地早熟禾Poa crymophila0.3300.004中华野葵Malva verticillata var.rafiqii2.1060.032南方菟丝子Cuscuta australis0.6230.005芝麻Sesamum indicum2.8310.0371.2试验方法1.2.1智能手机改良法将单粒供试种子和比例尺置于体视显微镜(Lei-ca ZOOM 2000，Leica，德国，重 8kg，规格为 200180350mm)下获得清晰视野(放大倍数 45)后，利用手机支架将智能手机固定于(像素 1000 万以上)目镜处拍照(获得照片分辨率为 72dpi)并添加比例尺。将照片导入到计算机中，用 Photoshop 软 件(Photoshop CC 2019，Adobe，美国)打开照片，首先根据照片中的比例尺计算得到单位像素的距离，并在图像分析设置测量比例菜单中设定测量比例，然后使用魔棒工具或磁性套索工具精确选择图片中的种子所在区域，在窗口菜单里调出“测量记录”面板，点击“测量记录”面板中的“记录测量”。测量结束后导出 TXT 格式的测量数据文件，其中包括种子面积、长度和宽度等数据。1.2.2多光谱种子表型成像分析系统测定法(多光谱法)将放有供试种子的培养皿置于多光谱种子表型成像分析系统(Videometer Lab 4，Videometer，丹麦)球体下方样品台上，采用多光谱种子表型成像分析系统在计算机上获得供试种子图像后测定种子的长度、宽度、面积及长宽比等表型。1.2.3扫描仪法采用扫描仪(EPSON V700，美国)获得待测种子图像后导入计算机，利用 WinSEEDLE 种子分析系统(egent Instrument，加拿大)对种子表型进行分析21。61一种便捷的小粒种子表型观测方法草学CAOXUE图 1采用智能手机改良法观测到的 20 种种子的形态注:图中比例尺代表 200m。2结果与分析2.13 种方法测定的种子大小比较利用 3 种方法对 20 个物种种子的大小进行测定。由图 2图 4 可知，在种子长度、宽度及面积的测定中，智能手机改良法和多光谱法间无显著差异(P0.05)，说明智能手机改良法可以准确地测定出小粒种子的大小。但扫描仪法测定的种子长度、宽度及面积显著低于多光谱法和智能手机改良法(P0.05)，且随着种子粒径减小，扫描仪法对种子的识别精度逐渐降低，直至无法准确识别出种子的大小。图 23 种方法测定的 20 种种子的长度注:图中不同小写字母代表不同测定方法间在 P0.05 水平差异显著，图 A、B 中因种子粒径过小，WinSEEDLE 法无法准确识别种子，因此不能测量。下同。71草学CAOXUE草业科学2023 年第 1 期总第 270 期图 33 种方法测定的 20 种种子宽度图 43 种方法测定的 20 种种子面积2.23 种方法测定的种子形状比较利用智能手机改良法、多光谱法和扫描仪法对20 份植物种子的长宽比进行测定。由图 5 可知，智能手机改良法和多光谱法测定的种子长宽比间无显著差异(P0.05)，说明智能手机改良法可以准确地测定出小粒种子的性状指标。但扫描仪法测定的长宽比与智能手机改良法和多光谱法测定的长宽比间存在显著差异(P0.05)，且随着种子粒径减小，扫描仪法对种子的识别精度逐渐降低，直至无法准确识别出种子。81一种便捷的小粒种子表型观测方法草学CAOXUE图 53 种方法测定的 20 种种子长宽比2.33 种方法获得的种子图像比较利用智能手机改良法、多光谱法和扫描仪法对20 份植物种子进行成像。以 20 份植物种子中千粒重较小的拟南芥和烟草、千粒重中等的沙蓬和籽粒苋、千粒重较大的中华野葵和芝麻为例，将利用 3 种方法得到的种子图像中种子大小调整到一致的比例，由图 6 可知，在对种子颜色、表面纹饰等种子细节的识别中智能手机改良法最优，扫描仪法次之，多光谱法最差。图 63 种方法获得的种子图像注:图中比例尺代表 200 m。91草学CAOXUE草业科学2023 年第 1 期总第 270 期3讨论与结论种子分析仪虽然可以快捷、准确测定种子表型，但其测定结果往往受种子粒径大小的影响较大，测定粒径偏小的种子表型时识别不准确会产生误差，另外种子分析仪价格昂贵且不便携带，这些因素限制了种子分析仪在种子表型测定中的应用。游标卡尺测定种子表型虽操作简单，但测定时更易受种子粒径大小的影响导致测定精度低，无法应用到小粒种子表型测定中。随着科技发展，数字图像技术被广泛应用于植物研究领域1820，利用图像处理软件测定种子表型的方法不受种子粒径大小限制，只要获得清晰的种子图像，即可随时随地对种子面积、长度、宽度和长宽比等指标进行测定，操作简便且测定精度高，可广泛用于各类植物种子的表型测定。本试验中，多光谱法对种子识别准确，测量精度高，可一次测量多粒种子的表型，但其价格昂贵，携带不便且测量时不能获得种子高清照片，对种子细节的识别表现较差;而扫描仪法虽价格相对较低，且测量时可一次扫描多粒种子分析表型，但其在小粒种子表型的测量中识别精度低甚至无法准确识别待测种子，此方法不适用于千粒重低于 2.8g 小粒种子表型的测定;而智能手机改良法成本低廉、操作简便、测量精度高，可获得种子高清照片，对种子颜色以及表面纹饰等细节识别准确，且此方法所需体视显微镜便于携带，观测不受地点限制(见表2)。综上，在千粒重低于 2.8g 的小粒种子表型观测中，推荐使用智能手机改良法。此方法可在农林基层事业单位、中小型种子公司的日常观测及种子工作者的野外种子采集工作中广泛推广应用。表 2本研究中各种方法的特点方法成本最大成像面积测量精度成像分辨率种子细节识别程度单次可测量种子数测量时间智能手机改良法1 万7高高高单粒较长多光谱法60 万254高较低较低多粒短扫描仪法3.5 万624低较高较高多粒较短参考文献 1 史维杰，郝雅洁，赵明霞，等 基于三维重建技术的植物表型分析 J 物联网技术，2019，9(09):8486 2 苏世平，李毅，种培芳，等 河西走廊不同红砂天然群体种子表型性状相关性研究 J 草业学报，2013，22(01):8794 3 李文英，顾万春 蒙古栎天然群体表型多样性研究 J 林业科学，2005，(01):4956 4 王永康，吴国良，赵爱玲，等 枣种质资源的表型遗传多样性 J 林业科学，2014，50(10):3341 5 游晓庆，陈慧，李晓辉，等 不同种源掌叶覆盆子种子和果实表型性状及发芽率研究 J 南方林业科学，2019，47(03):1619+34 6 郭松，李在留，薛建辉，等 不同种源掌叶木果实和种子表型性状多样性分析及综合评价 J 植物资源与环境学报，2018，27(04):1120 7 Dong，Jahufer M Z Z，Dong D K，et al Characterisationof the morphological variation for seed traits among 537 germ-plasm accessions of common vetch(Vicia sativa L)usingdigital image analysis J New Zealand Journal of Agricul-tural esearch，2016，59(4):422435 8 陈丽君，邓小梅，丁美美，等 苦楝种源果核及种子性状地理变异的研究 J 北京林业大学学报，2014，36(01):1520 9 杜会聪，蒋雅婷，张莹，等 浙江省蜡梅野生种群种实表型性状变异及其与土壤相关因子的关系 J 植物资源与环境学报，2018，27(02):7784 10 侯维海，王建林，旦巴，等 不同生态因子条件下西藏青稞种子表型性状的相关分析 J 核农学报，2017，02一种便捷的小粒种子表型观测方法草学CAOXUE31(10):20632071 11 Evers AD，Cox I，Shaheedullah MZ，et al Predictingmilling extraction rate by image analysis of wheat grains J Aspects of Applied Biology，1990，(25):417426 12 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Yuguo1，Hong Jun2，Liu Fang2，Liu Zhipeng1*(1 State Key Laboratory of Grassland Agroecosystems/Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation，Ministry of Agriculture and ural Affairs/College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China;2 National Livestock Husbandry Station，Beijing 100125，China)Abstract:Seed phenotype plays an important role in plant phenotype research However，convenient and highprecision observation ofsmall seeds has always been one of the difficulties in seed research In order to solve this problem，the convenient and lowcost improvedmethod of smart phone，the low popularity and highcost multispectral seed phenotype imaging analysis system(abbreviated as MultispectralMethod)，and the commonly used scanner method were used to comparatively observe the phenotype of small seeds in this paper The resultsshowed that there was no significant difference between the length，width，area and aspect ratio of the seeds measured by the improvedmethod of smart phone and Multispectral Method(P0.05)However，there are significant differences among the scanner method，theMultispectral Method and the improved method of smart phone(P0.05)，and with the decrease of seed size，the scanner method couldnot accurately identify the seeds to be tested Compared with Multispectral Method and scanner method，seed color and surface decorationcan be accurately identified by the improved method of smart phone，which was portable and lowcost Therefore，the improved method ofsmart phone was recommended for phenotypic determination of small seed whose 1000 seed weight is less than 2.8 g The method was suit-able to be used in the population of experimenters，field science and technology workers in grassroots institutions，experimental stationsand small and mediumsized enterprisesKey words:small seeds;stereo microscope;image processing software;seed phenotype12