酶的生产与分离纯化瑶瑶ppt课件.ppt

酶的生的生产与分离与分离纯化化 1 1.酶的生的生产组织提取提取发酵生酵生产化学及生物合成化学及生物合成2 2.集中集中垄断，市断，市场全球化全球化：丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）美国杰能科（Genencor）、芬兰科特和丹麦丹尼斯克3 3.品种、品种、品种、品种、规规模不断模不断模不断模不断扩扩大大大大国际以液体、颗粒为主。国内糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大类重要产品系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产;我国7家。应用用领域不断域不断扩大大食品工业占62%4 4.酶的的发酵生酵生产：经过预先先设计，通，通过人工操作控制，利用人工操作控制，利用细胞的生命活胞的生命活动，产生人生人们所需要所需要酶的的过程程5 5.能用于能用于酶发酵生酵生产的的细胞需胞需具具备如下几个如下几个条件条件：（1）产酶量高量高（2）容易培养和管理）容易培养和管理（3）产酶稳定性好定性好（4）利于）利于酶的分离的分离纯化化（5）安全可靠）安全可靠6 6.酶的的发酵技酵技术为什么利用微生物什么利用微生物产酶？(1)种种类多、多、酶种丰富，且菌株易种丰富，且菌株易诱变，菌种多，菌种多样。(2)生生长繁殖快，易提取繁殖快，易提取酶.(3)培养基来源广泛、价格便宜。培养基来源广泛、价格便宜。(4)微微电脑，连续化、自化、自动化，化，经济效益高。效益高。(5)利用以基因工程利用以基因工程为主的主的现代分子生物学技代分子生物学技术，7 7.产酶微生物微生物产酶种种类、产量、量、发酵条件、工酵条件、工艺。主要包括主要包括细菌、放菌、放线菌、酵母菌、霉菌。菌、酵母菌、霉菌。8 8.（1）枯草芽）枯草芽孢杆菌杆菌细菌属菌属菌落粗糙，不透明菌落粗糙，不透明生生产-淀粉淀粉酶、蛋白、蛋白酶、-葡聚糖葡聚糖酶，碱性磷酸，碱性磷酸酶等。等。9 9.（2）大大肠杆菌杆菌阴性，无芽阴性，无芽孢菌落光滑菌落光滑用于谷氨酸脱用于谷氨酸脱羧酶，天，天门冬氨酸冬氨酸酶等等胞内胞内酶1010.（3）黑曲霉）黑曲霉属于真菌属属于真菌属糖化糖化酶、淀粉、淀粉酶、酸、酸性蛋白性蛋白酶、果胶、果胶酶等。等。1111.（4）米曲霉米曲霉糖化糖化酶、蛋白、蛋白酶1212.（5）根霉）根霉主要用于糖化主要用于糖化酶、淀、淀粉粉酶、转化化酶等生等生产1313.（6）毛霉）毛霉蛋白蛋白酶、糖化、糖化酶、淀、淀粉粉酶、脂肪、脂肪酶等。等。1414.（7）链霉菌霉菌葡萄糖异构葡萄糖异构酶、青、青霉素霉素酰化化酶、纤维素素酶、几丁、几丁质酶等等1515.（8）啤酒酵母）啤酒酵母转化化酶丙丙酮酸脱酸脱羧酶1616.产酶菌株的菌株的选育育 主要依据主要依据酶催化的反催化的反应性性质、作用底物的特异作用底物的特异性性、底物和底物和产物的特性物的特性以及以及酶在在细胞中所胞中所处的位的位置置。胞外胞外酶：菌落周：菌落周围的的透明圈、透明圈、颜色色变化来化来筛选。胞内胞内酶：若：若酶作用底物分子量小可透作用底物分子量小可透过细胞膜，胞膜，将将酶反反应的的产物作物作为底物，加在培养基中，根据底物，加在培养基中，根据菌落菌落颜色色变化化。而多数胞内而多数胞内酶产生菌的生菌的筛选：细胞破碎物做胞破碎物做酶源，源，经酶反反应后，根据后，根据酶反反应产物的特点来物的特点来筛选（辅酶NAD）。1717.选择性能性能优良的良的产酶微生物微生物培养基培养基设计选择合适的合适的发酵方式酵方式发酵酵过程的各种参数控制程的各种参数控制酶的的发酵技酵技术重要1818.保藏保藏细胞胞细胞活化胞活化细胞胞扩大培养大培养原生原生质体体固定化固定化细胞胞固定化原生固定化原生质体体预培养培养发酵酵发酵酵分离分离纯化化酶重要1919.主要是碳源、氮源，其次是无机主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生、生长因子因子和和产酶促促进剂等。等。重要培养基培养基2020.（1）碳源）碳源当前当前酶制制剂生生产上使用的菌种大都是只能上使用的菌种大都是只能利用利用有机碳有机碳的异养型微生物。的异养型微生物。重要吃点吃点啥？2121.重要有机碳的主要来源有：一是有机碳的主要来源有：一是农副副产品中品中二是野生的原料二是野生的原料以石油以石油产品中品中1216碳的成分碳的成分2222.考考虑营养要求养要求、诱导作用作用、分解代分解代谢物阻遏作用物阻遏作用。淀粉淀粉酶生生产用用淀粉淀粉不用不用果糖果糖重要2323.（2）氮源）氮源有机氮源和无机氮源有机氮源和无机氮源重要一般来一般来说，动物物细胞、植物胞、植物细胞、异胞、异养型微生物、自养型微生物。养型微生物、自养型微生物。有机氮源和无机氮源配合有机氮源和无机氮源配合我有我要求我有我要求2424.只用只用铵盐或硝酸或硝酸盐为氮源氮源时，酶产量量仅为有有胨时的的30%只用有机氮源而不用无机氮源只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低量也低使用高使用高浓度有机氮源外尚需添加度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮的无机氮源。源。重要2525.（3）碳氮比碳氮比一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)低;淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等)高,在糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。2626.（4）无机无机盐常以磷酸二常以磷酸二氢钾、磷酸、磷酸氢二二钾等磷酸等磷酸盐作作为磷源磷源，以硫酸，以硫酸镁为硫源和硫源和镁源源。钙 灰色灰色链霉菌中性蛋白霉菌中性蛋白酶 pH77.5 pH57。重要2727.钠离子离子控制控制细胞渗透胞渗透压酶产量增加，以磷酸量增加，以磷酸氢二二钠及及硝酸硝酸钠等形式，例如米曲霉等形式，例如米曲霉淀粉淀粉酶重要2828.（5）生）生长因子因子 微量的物微量的物质，或生，或生长素。素。某些氨基酸、某些氨基酸、维生素、生素、嘌呤或呤或嘧啶。重要有你才有你才健康！健康！2929.（6）产酶促促进剂 产酶促促进剂一是一是诱导物，二是表面活性物，二是表面活性剂。表面活性表面活性剂能能增加增加细胞的通透性，改善氧的胞的通透性，改善氧的传递速度，保速度，保护酶的活性。的活性。重要3030.发酵方式的酵方式的选择固固态发酵法酵法液体深液体深层发酵法酵法3131.(1)pH对产酶的影响的影响一般来一般来说，培养基成分中碳，培养基成分中碳/氮氮(C/N)比高，比高，发酵液，酵液，pH低；低；C/N低，低，pH高。高。添加添加缓冲液；冲液；调节通通风量量.调节培养基的初培养基的初始始pH；pH过高糖或淀粉来高糖或淀粉来调节，pH过低氮低氮调节。3232.一般一般细菌菌为37，霉菌和放，霉菌和放线菌菌为2830，而生，而生产糖化糖化酶的最适温度的最适温度为3740。(2)温度温度对产酶的影响的影响 微生物代微生物代谢反反应、发酵中通酵中通风、搅拌速度拌速度发酵初期酵初期菌体繁殖旺盛菌体繁殖旺盛时3333.(3)耗氧量和通耗氧量和通风量量对产酶的影响的影响溶解氧而定。目前用于溶解氧而定。目前用于酶制制剂生生产的微生的微生物都物都为好气性微生物，采用自好气性微生物，采用自动测定和定和记录溶解氧的溶解氧的仪表。表。3434.(4)搅拌的影响拌的影响 有利于有利于热交交换、营养物养物质与菌体均匀接触，与菌体均匀接触，提高新提高新陈代代谢。打破空气气泡，使。打破空气气泡，使发酵液形成酵液形成湍流，提高溶氧量，增加空气利用。湍流，提高溶氧量，增加空气利用。3535.(5)泡沫的影响泡沫的影响泡沫阻碍了泡沫阻碍了CO2的排除，影响溶氧量的排除，影响溶氧量机械消泡，消泡机械消泡，消泡剂3636.食品用食品用酶发酵生酵生产实例例1、-淀粉淀粉酶的生的生产生生产菌种：菌种：细菌和曲霉，如枯草芽菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、杆菌、黑曲霉等。黑曲霉等。发酵方法：霉菌，固体曲法；酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体菌，液体深深层发酵。酵。回收方法：回收方法：盐析、有机溶析、有机溶剂沉淀和淀粉吸沉淀和淀粉吸附等。附等。3737.2、果胶、果胶酶的生的生产生生产菌种：真菌如曲霉菌、青霉菌，菌种：真菌如曲霉菌、青霉菌，细菌菌如枯草芽如枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌。杆菌、欧氏杆菌。发酵：固体曲法和液体深酵：固体曲法和液体深层发酵酵回收：水提后加入乙醇沉淀。回收：水提后加入乙醇沉淀。3838.酶的分离纯化3939.酶的的纯化化 特定的一种酶在细胞中的含量很少 酶可以通过测定活力加以跟踪4040.酶分离分离纯化的一般原化的一般原则1、可靠和快速的、可靠和快速的测活方法；活方法；2、酶原料的原料的选择；3、酶的提取；的提取；4、酶的提的提纯；5、酶的的纯度度检验。4141.酶提提取取分分离离纯化化技技术路路线发酵培养酵培养动物器官物器官植物植物组织微生物微生物提取提取胞内胞内酶胞外胞外酶细胞破碎胞破碎研磨研磨酶分离分离纯化化离心分离，离心分离，过滤分离，沉淀分分离，沉淀分离，离，层析分离，析分离，电泳分离，萃泳分离，萃取分离，取分离，结晶分离等。晶分离等。酶浓缩酶贮存存4242.机械破碎机械破碎捣碎法碎法研磨法研磨法匀匀浆法法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶有机溶剂：甲苯、丙甲苯、丙酮丁醇、丁醇、氯仿仿表面活性表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎促破碎自溶法自溶法外加外加酶制制剂法法通通过机械运机械运动产生的剪切生的剪切力，使力，使组织、细胞破碎。胞破碎。使使组织、细胞的外胞的外层结构破构破坏坏对细胞膜的作用胞膜的作用通通过细胞本身的胞本身的酶系或外系或外加加酶制制剂的催化作用，使的催化作用，使细胞外胞外层结构受到破坏，构受到破坏，细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理4343.(1)机械(匀浆)法(2)超声波法 处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理。4444.(3)冻融法 生物组织冰冻后，胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)。(4)渗透压法(5)酶消化法4545.(6)化学破碎法 有机溶剂处理 表面活性剂处理与细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。4646.酶的提取盐溶液提取酸溶液提取碱溶液提取有机溶剂提取4747.温度：一般在00C100C。pH：在酶的稳定范围内，远离等离等电点点pH。缓冲液：0.15mol/L氯化钠、0.020.05mol/L磷酸提取液体积：一般为原料体积的1-5倍。保护剂：底物、底物、辅酶、某些抗氧化、某些抗氧化剂、表面活性表面活性剂等。4848.酶的主要提取方法的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶使用的溶剂或溶液或溶液提取提取对象象盐溶液提取溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的的盐溶液溶液在低在低浓度度盐溶液中溶解溶液中溶解度度较大的大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液在稀酸溶液中溶解度大，在稀酸溶液中溶解度大，且且稳定性定性较好的好的酶碱溶液提取碱溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液稀碱溶液中溶解度大且稀碱溶液中溶解度大且稳定性定性较好的好的酶有机溶有机溶剂提取提取可与水混溶的有机可与水混溶的有机溶溶剂与脂与脂质结合牢固或含有合牢固或含有较多非极性基多非极性基团的的酶4949.酶的分离方法1 1、沉淀分离、沉淀分离2 2、离心分离、离心分离3 3、萃取分离萃取分离4 4、层析分离析分离GoGoGoGo5 5、电泳分离泳分离Go6 6、过滤与膜分离与膜分离Go5050.1 1、沉淀分离、沉淀分离溶解度降低溶解度降低从溶液中沉淀析出沉淀析出 沉淀分离方法沉淀分离方法 分离原理分离原理 盐析沉淀法析沉淀法蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶液中添加一定浓度的中性盐等等电点沉淀法点沉淀法等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点 有机溶有机溶剂 沉淀法沉淀法有机溶剂中的溶解度不同 复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，选择性性变性性 沉淀法沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶5151.p介介电常数降低常数降低、使酶蛋白脱水蛋白脱水 有机溶有机溶剂法法5252.影响有机溶剂沉 淀法分离的因素 温度 pH 离子强度 蛋白质浓度p 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等异丙醇、甲醇等 。选择有机溶剂的标准必须与水完全混溶;不与蛋白质发生反应；要有较好的沉淀效应；溶剂蒸汽要无毒，且不易燃。5353.阴阴 极极阳阳 极极pH=pIpHpI带正正电荷荷带负电荷荷净电荷荷为零零导电率率溶解度溶解度渗透渗透压粘度粘度达到最低达到最低等等电点沉淀法点沉淀法原因原因:在等在等电点点时，蛋白，蛋白质分子以双极离子存在，分子以双极离子存在，总净电荷荷为零零,颗粒无粒无电荷荷间的排斥作用的排斥作用,易凝集成大易凝集成大颗粒，粒，因而最不因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。定，溶解度最小，易沉淀析出。电泳分泳分离离沉淀分离沉淀分离5454.pH=pI 溶解度最小溶解度最小 等等电点沉淀与分离点沉淀与分离大部或全部沉淀下来大部或全部沉淀下来pHpI蛋白蛋白质的分离的分离沉淀出来的蛋白沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解可保持天然构象，能再溶解于水并具有生物活性。于水并具有生物活性。5555.离心分离离心分离离心力离心力使不同大小、不同密度的物质分离。颗粒大小、密度和特性的不同粒大小、密度和特性的不同离心的形式离心的形式：p 离心沉降p 离心过滤p 离心分离和超离心5656.超速离心机超速离心机高速离心机高速离心机沉降离心机沉降离心机5757.萃取分离萃取分离利用物质在两相中的溶解度不同。两相中的溶解度不同。两相一般互互不相溶不相溶 有机溶有机溶剂萃取萃取双水相萃取双水相萃取超超临界萃取界萃取反胶束萃取反胶束萃取 5858.有机溶有机溶剂萃取萃取 常用的溶常用的溶剂：醇、：醇、酮、丁醇、苯酚等。、丁醇、苯酚等。萃取条件：萃取条件：00C100C。接触。接触时间尽可能短尽可能短。5959.双水相萃取双水相萃取 （two-aqueous phase system extractiontwo-aqueous phase system extraction）p利用生物物利用生物物质在双水相体系中的在双水相体系中的选择性分配性分配。p影响分配的因素：影响分配的因素：双水相的性双水相的性质、分离物、分离物质的性的性质、离子性离子性质、环境因素境因素 6060.层析分离利用混合物中各利用混合物中各组分的分的物理化学性物理化学性质的差的差别，使，使各各组分以不同程度分布在两个相中，并以不同速分以不同程度分布在两个相中，并以不同速度移度移动。6161.欲分离的混合溶液自柱欲分离的混合溶液自柱顶加入加入 洗脱洗脱剂。解吸、吸附、再解吸、再解吸、吸附、再解吸、再吸附吸附 吸附层析6262.吸附剂与洗脱剂的选择洗脱洗脱剂的的选择 极性种类有：醇、醇、酮、酚等、酚等。洗脱洗脱剂的的选择要注意下列各点：要注意下列各点：p洗脱洗脱剂不会与吸附不会与吸附剂起化学反起化学反应，不会使吸附，不会使吸附剂溶解；溶解；p洗脱洗脱剂对混合液中的各混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，分的溶解度大，粘度小，流流动性好性好p纯度度6363.离子交换剂上的可解离基可解离基团（活性基（活性基团）对各种离各种离子的子的亲和力不同和力不同阳离子交阳离子交换剂阴离子交阴离子交换剂 离子交离子交换层析析6464.凝胶凝胶过滤分子分子筛层析析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同 凝胶凝胶层析析6565.凝胶过滤(gel filtration chromatography)溶质分子的大小操作方便，不会使物质变性，反复使用凝胶层析剂的容量比较低6666.原理6767.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶脂糖凝胶 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶 6868.生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆一而又可逆的亲和力酶与底物与底物酶与与竞争性抑制争性抑制剂抗原与抗体抗原与抗体酶RNARNA与互与互补的的RNARNA分子或分子或片段片段RNARNA与互与互补的的DNADNA分子分子或片段或片段 亲和层析6969.根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价共价亲和和层析析 疏水疏水层析析金属离子金属离子亲和和层析析免疫免疫亲和和层析析染料染料亲和和层析析 凝集素凝集素亲和和层析析 7070.分配分配层析析利用各组分在两相中的分配系数不同固定相、流固定相、流动相相 在流动相的带动流经固定相 动态分配。纸上上层析析 分配薄分配薄层层析析 分配气相分配气相层析析7171.电泳分离泳分离使用的支持体的不同：薄薄层电泳泳 纸层析析 薄膜薄膜电泳泳 凝胶凝胶电泳泳 自由自由电泳泳 等等电聚焦聚焦电泳泳 本身所本身所带的的净电荷量荷量、颗粒形粒形状状颗粒大小粒大小、电场强度度、溶液溶液pHpH值、离子离子强度度、支持体的特支持体的特性性7272.过滤与膜分离与膜分离借助于借助于过滤介介质，滤纸、滤布、布、纤维过滤非膜非膜过滤：采用高分子膜以外的物：采用高分子膜以外的物质作作为过滤介介质 膜膜过滤：采用各种：采用各种高分子膜高分子膜为过滤介介质 7373.膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地性地让小于小于其孔径的物其孔径的物质颗粒或分子通粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜分离加加压膜分离膜分离 微微滤超超滤反渗透反渗透电场膜分离膜分离 电渗析渗析 离子交离子交换膜膜电渗析渗析 扩散膜分离散膜分离 透析透析7474.酶分离、纯化的评价酶的产量是以活力单位表示，比活力、总活力7575.酶活力的活力的测定定酶活力活力(Enzyme activity)：酶催化反催化反应的能力，的能力，酶的含量。的含量。1 min催化催化1mol底物底物转化化为产物的物的酶量量为该酶的一个活力的一个活力单位位(国国际单位位)，温度，温度为25，其它条件其它条件(pH、离子、离子强度度)采用最适条件。采用最适条件。重要7676.酶的的总活力活力为样品的全部品的全部酶活力。活力。总活力活力=酶活力活力 总体体积(mL)或或 =酶活力活力 总质量量(g)7777.比活力比活力(Specific activity)：单位蛋白位蛋白质 所所含有的含有的酶活力活力。酶纯度度重要7878.回收率回收率(Yield percent)：提：提纯前与提前与提纯后后酶的的总活力活力之比。之比。酶的的损失程度失程度提提纯倍数倍数：提：提纯前后两者前后两者比活力比活力之比。之比。酶活力是一般采用活力是一般采用测定定产物的生成量物的生成量7979.酶纯度的度的评价价电泳法泳法层析法析法沉降法沉降法分光光度分光光度计法法结晶法晶法免疫法免疫法8080.1、电泳法：泳法：仅有一条区有一条区带2、层析法：析法：经层析后各部分比活力一致析后各部分比活力一致8181.3、免疫化学法：免疫、免疫化学法：免疫电泳泳4、超速离心沉降分析法、超速离心沉降分析法5、分光光度法：根据、分光光度法：根据A280/A260应为的比的比值确定，确定，纯酶的比的比值为1.756、结晶法晶法8282.酶的保存方法 底物、抑制剂和辅酶，不稳定状态 稳定状态。巯基酶，加入SH保护剂。GSH、DTT Ca2+保护淀粉酶，Mn2+稳定溶菌酶，Cl稳定透明质酸酶。8383.后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析8484.主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求8585.感感谢您的您的观看和下看和下载The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field8686.