低浓度硫酸阿托品滴眼液兔眼毒性试验研究_郭妍.pdf

用药学，2003(06):464-466.5 董碧莲，蔡延渠，吕莉，等.中药多糖增强免疫、抗疲劳作用的研究进展 J.中成药，2019，41(05):1119-1124.6 李容，陈华国，周欣.植物多糖免疫调节机制研究进展 J.天然产物研究与开发，2018，30(11):2017-2022，2031.7 鲍智娟，王惠杰.不同方法提取益母草多糖的比较研究 J.白城师范学院学报，2016，30(08):40-45.低浓度硫酸阿托品滴眼液兔眼毒性试验研究郭妍，安元龙，张智鹏，姜珊*，马俊佼，钟梦婷(辽宁何氏医学院药学院，辽宁沈阳 100163)摘要:目的通过急性眼毒性试验和长期眼毒性试验，评价低浓度硫酸阿托品滴眼液(0.01%)对兔眼的安全性，同时为 0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼液的开发提供理论支撑。方法采用定期测量瞳孔直径、眼压、眼部 A 超、眼底彩超、裂隙灯眼表检查及组织病理学作为观察指标，评价低浓度硫酸阿托品对兔眼急性毒性。结果未见该药物对兔眼产生毒性反应。结论低浓度硫酸阿托品滴眼液安全性较高，0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼剂可进一步开发。关键词:低硫酸阿托品滴眼液;急性眼毒性试验;长期眼毒性试验中图分类号:965文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0017-04作者简介:郭妍，女(1984 )。学历:硕士研究生。职称:副教授。主要从事药品质量及药理毒理研究。通讯作者:姜珊。职称:副教授。基金项目:辽宁省教育厅科学研究经费项目(No.SJ202002)Study on the Ocular Toxicity of Low Concentration of Atropine Sulfate EyeDrops in abbitsGUO Yan，AN Yuan-long，ZHANG Zhi-peng，JIANG Shan*，MA Jun-jiao，ZHONG Meng-ting(School ofPharmacy，He University of Liaoning，Shenyang 110163，China)ABSTACT:OBJECTIVEThe safety of atropine sulfate eye drops with low concentration(0.01%)on rabbiteyes was evaluated through acute and long-term eye toxicity tests，and theoretical support was provided for the devel-opment of atropine sulfate eye drops with concentrations ranging from 0.01%to 0.1%.METHODSThe pupil di-ameter，intraocular pressure，ocular A ultrasound，fundus color ultrasound，slit lamp ocular surface examination and his-topathology were measured regularly as observation indicators to evaluate the acute toxicity of atropine sulfate at lowconcentration to rabbit eyes.ESULTSNo toxic reaction in rabbit eyes was observed.CONCLUSIONLow con-centration atropine sulfate eye drops are safe，and the concentration range of 0.01%-0.1%can be further developed.KEY WODS:Atropine sulfate eye drops;Acute ocular toxicity test;Long-term ocular toxicity test目前控制近视进展的方法中，低浓度阿托品对青少年近视的延缓作用备受医学界关注。研究报道1-3，硫酸阿托品滴眼液控制近视进展的疗效与浓度有关，目前 0.1%、0.05%、0.025%、0.02%、0.01%浓度硫酸阿托品滴眼液报道最多，其中 0.01%浓度控制近视进展的效果较好。Sun 等4研究表明，低浓度阿托品滴眼液控制儿童近视进展的有效性具有剂量依赖性。赵兵新等5通过对 0.005%硫酸阿托品滴眼液临床有效性和安全性研究得出，0.005%硫酸阿托品滴眼液对延缓儿童近视临床效果不明显，建议从略高质量分数如 0.01%开始。本实验旨在评价 0.01%硫酸阿托品滴眼液非临床安全性。项目组选择 0.01%和 0.1%两个浓度开展阿托品滴眼液急性眼毒性实验和长期眼毒性试验，考察低浓度阿托品滴眼液对兔眼的毒性反应，为后续研究不同浓度阿托品滴眼液控制近视奠定研究基础。1材料与方法1.1药品、试剂与仪器硫酸阿托品滴眼液(沈阳何氏眼产业集团有限公司提供，0.01%浓度，批号:20210301;0.1%浓度，批号 20210401);0.5%盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因，18C16N);HE 染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，P0098);中性树脂(北京索莱宝科技有限公司);0.9%氯化钠注射液。眼科裂隙灯(重庆康华科技有限公司，SLM 型);手持式眼底照相机(苏州微清医疗器械有限公司);接触式眼压计71Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023(瑞士 i-care);眼 A/B 超仪(索维 SW-2100);瞳孔测量卡尺;轮转式切片机(徕卡显微系统有限公司);自动包埋机(LEICACM1860);正置荧光显微镜(Nikon ECLIPSE Ni)。1.2实验动物选取健康幼年大耳白兔 30 只6，雌雄各半，体重 1.4 2.0 kg，辽宁长生生物股份有限公司提供，许可证号:NO.SCXK(辽)2020-0001。由辽宁何氏医学院动物实验中心饲养，室内温度 25 左右、相对湿度 50%60%、光照12 h/12 h 昼夜循环;实验动物自由摄食、生存环境适宜。经一般健康检查和眼科基础检查合格的大耳白兔，进入适应期观察。实验过程中项目组自觉遵守实验动物福利伦理相关法规和各项规定，并接受伦理委员会和实验动物室管理者的监督与检查。1.3急性眼毒性试验1.3.1分组方法:选取 15 只大耳白兔，随机分成 3 组:空白对照组(N)，给药组为 0.01%浓度组(L)和 0.1%浓度组(H)，每组 5 只，并进行耳孔标识和笼卡标识。1.3.2给药方法:0.01%浓度组和 0.1%浓度组分别滴入0.01%和 0.1%硫酸阿托品滴眼液，空白对照组滴入 0.9%生理盐水。每组兔双眼结膜囊给药，1 次 0.05 mL，轻合眼睑约10 秒。连续给药 2 h，每次间隔 15 min。于给药后第 1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 进行眼压、瞳孔直径、眼表检查和眼底检查。在最后一次检测完成后，摘取眼球，观察眼部是否有病理性变化。1.4长期眼毒性试验1.4.1分组方法:选取 15 只大耳白兔，分组方法同“1.3”项下分组方法。1.4.2给药方法:每组用药同“1.3”项下给药方法。各组于每日 900、1500 两个时间点给药，连续给药 4 周。每 1 周进行1 次眼部检测，包括眼压、瞳孔直径、眼部 A 超、眼表检查和眼底检查。在最后一次检测完成后，摘取眼球，观察眼部是否有病理性变化。1.5检测方法1.5.1瞳孔直径测定:使用瞳孔测量尺测量兔双眼瞳孔直径，并记录数据。1.5.2眼压测定:首先在兔眼球表面滴入 1 滴盐酸丙美卡因滴眼液，进行眼表麻醉，然后使用接触式眼压计进行兔双眼眼压测定，每只眼测定 3 次，要求 3 次测量值置信区间为 95%，记录每组数据，结果取其平均值。1.5.3眼部 A 超:兔眼球表面滴入 1 滴盐酸丙美卡因滴眼液进行眼表麻醉后，使用眼 A/B 超仪测定兔眼中央前房深度(ACD)、晶体厚度(LENS)、玻璃体腔长度(VIT)、眼轴长度(AL)，通过测量数值判断硫酸阿托品滴眼液对眼部的影响。1.5.4眼表检查:兔眼表麻醉后，使用眼科裂隙灯对兔眼进行眼表拍照，观察兔眼瞳孔边界是否清晰，角膜是否平滑、透明，结膜是否充血，前房及晶体是否出现浑浊。1.5.5眼表刺激性:根据 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则 眼刺激反应分值标准，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值;积分 03 为无刺激性，4 8 分为轻度刺激性，9 12 分为中度刺激性，13 16 分为强度刺激性。本实验中急性眼毒性试验组在给药后观察 1 周内兔眼刺激反应，长期眼毒性试验组于每周观察一次兔眼刺激性反应。详细记录每次检查兔眼部异常反应，根据眼刺激反应分值标准计算眼刺激反应分值，判断眼刺激程度。1.5.6眼底检查:兔眼表麻醉后，使用手持式眼底照相机进行眼底拍照，观察兔眼玻璃体腔是否浑浊，眼底是否充血，视盘边界和动静脉走形是否清晰。1.5.7病理检查:将新鲜眼球组织取下后放入眼球固定液Davidoson 液中固定 72 h，眼球固定液=115(体积比)，使眼球完全被浸没且能自由移动。固定完成后，沿眼球矢状面切开，将组织结构相对完整的一半置于包埋盒中进行脱水。系列溶剂按时间先后排序分别为 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、石蜡。各溶剂中分别放置40 min，以确保脱水完全。完成脱水、石蜡包埋冷冻后，即可使用轮转式切片机进行 5 m 厚度切片。切片铺展于载玻片，置烘干机烘干。HE 染色前需要完成脱蜡复水，使用上述系列溶剂，排序需倒置，从二甲苯至 70%乙醇，各溶剂中分别放置 5 min，以去除石蜡，便于染色。苏木素和伊红分别染色后，进行脱水，使用中性树脂封片，正置显微镜下观察，400观察，采用 Nikon NIS Elements 图像分析系统观察角膜、结膜、虹膜、视网膜等组织结构变化情况。1.6统计学分析应用统计分析软件 GraphPad Prism 8 和Microsoft Excel 2010 进行数据处理分析，定量资料采用均数 标准差(x s)表示。2结果2.1瞳孔直径急性眼毒性试验中，给药前兔眼瞳孔直径平均值在(6.75 0.51)mm，与给药前及空白对照组相比，0.01%浓度组和 0.1%浓度组兔眼瞳孔直径在给药后逐渐增大，于 2 h 达到峰值，4 h 内能维持较高散瞳状态，瞳孔直径平均值为(9.74 0.44)mm，兔眼瞳孔直径随给药时间的变化情况见图 1。实验结果表明:0.01%浓度组和 0.1%浓度组均能在给药后 2 6 h 内，发挥散瞳作用，说明药物正常发挥药效。在此基础上，对硫酸阿托品滴眼液眼部刺激性和毒性反应进行评价与分析。图 1瞳孔直径81海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期2.2眼压急性眼毒性试验中，给药前兔眼平均眼压为(10.56 0.44)mmHg，给药后连续监测 72 h，监测药物对兔眼压的影响。数据统计分析结果见表 1。结果表明，给药组与空白对照组比较，P 0.05，无统计学意义，说明低浓度硫酸阿托品滴眼液对正常眼眼压无影响，未造成眼压升高或降低。表 1眼压变化情况(x s，mmHg)组别0 h1 h2 h4 h6 h12 h24 h48 h72 hN10.12 1.2811.33 1.2511.67 0.8911.00 1.3010.67 1.4511.82 1.2612.42 1.0110.89 2.1510.24 0.95L11.01 1.6510.72 1.3010.96 1.2412.06 1.5211.00 1.7511.86 0.8612.23 1.5611.71 1.5811.31 1.25H10.56 1.2610.99 1.8612.23 1.3610.23 0.9811.32 2.0110.89 1.6512.42 1.8710.52 2.0510.86 1.492.3眼部 A 超长期眼毒性试验中，分别于第 0 周，2 周，4周测定各组兔眼部 A 超，检测药物对兔眼轴长度、房水深度等各项生理条件的影响。给药组与空白对照组比较，中央前房深度(ACD)、晶体厚度(LENS)、玻璃体腔长度(VIT)、眼轴长度(AL)各组数据均无统计学意义，P 0.05，结果见表2。说明低浓度硫酸阿托品滴眼液对兔眼部基本生理条件不会产生影响。表 2眼部 A 超数值(x s)T/G0 WACDLENSVITAL2 WACDLENSVITAL4 WACDLENSVITALN2.67 0.185.79 0.1114.88 0.2723.33 0.482.38 0.175.77 0.1315.04 0.2123.12 0.562.57 0.255.75 0.1412.96 0.4521.28 0.86L2.4 0.075.88 0.0914.95 0.8123.23 0.632.51 0.115.92 0.1213.59 0.75 22.01 0.8552.56 0.195.81 0.1613.46 0.7521.83 0.75H2.34 0.125.67 0.1014.45 0.7722.46 0.752.43 0.135.93 0.1413.7 0.8922.06 0.922.35 0.175.95 0.2114.48 0.5622.78 0.95注:ACD:中央前房深度(mm);LENS:晶体厚度(mm);VIT:玻璃体腔长度(mm);AL:眼轴长度(mm);T:周数;G:组别2.4眼表检查急性眼毒性试验和长期眼毒性试验中，均完成对各组给药前与给药后裂隙灯眼表检查。急性毒性试验给药 72 h 后检查结果显示，各组兔眼角膜平滑、透明，结膜未见充血，前房水及晶体未出现浑浊。长期毒性试验给药 4 周后眼表检查结果与急性毒性试验眼表检查结果一致，说明低浓度阿托品滴眼液对眼表无明显刺激性反应。长期眼毒性试验眼表检查拍照见图 2。图 2长期眼毒性试验眼表检查照片注:N-空白对照组;L-0.01%浓度组;H-0.1%浓度组2.5眼表刺激性急性眼毒性试验和长期眼毒性试验结果表明，0.01%浓度组和 0.1%浓度组兔眼角膜、结膜及虹膜处均未见异常，眼周围未见渗出物，与空白对照组相比无显著差异，眼刺激评分均小于 3。说明 0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼液对兔眼无刺激性反应。2.6眼底检查急性眼毒性试验和长期眼毒性试验中，均完成对各组给药前与给药后眼底检查。急性毒性试验给药 72 h后检查结果显示，各组兔眼玻璃体腔未出现浑浊，视网膜未见充血，视盘边界清晰、动静脉走形无异常。长期毒性试验给药4 周后眼底检查结果与急性毒性试验眼底检查结果一致，说明低浓度阿托品滴眼液对眼底无明显刺激性和毒性反应。长期眼毒性试验眼底检查拍照见图 3。图 3长期眼毒性试验眼底检查照片注:N-空白对照组;L-0.01%浓度组;H-0.1%浓度组91Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 20232.7病理检查急性眼毒性试验和长期眼毒性试验中，各组均完成兔眼球病理检查。病理切片显微观察显示，给药组角膜上皮无破损，角膜上皮细胞排列均匀，角膜基质层无炎症因子浸润，结膜、虹膜和睫状体处未见充血、无新生血管，前后房区域内无纤维膜增殖(见图 4)。视网膜内界膜、内丛状层、内核层、外核层等各层边界清晰(见图 5)。病理检查结果表明，低浓度硫酸阿托品滴眼液不会对兔眼造成组织病理性改变。图 4长期眼毒性试验角膜病理图片(400)注:N-空白对照组;L-0.01%浓度组;H-0.1%浓度组图 5长期眼毒性试验视网膜病理图片(400)注:N-空白对照组;L-0.01%浓度组;H-0.1%浓度组;GCL:神经节细胞层、INL:内核层、ONL:外核层3讨论3.1考虑目前研究较多且疗效较好的硫酸阿托品滴眼液浓度为 0.01%、0.02%、0.025%、0.05%、0.1%，实验设立空白对照组、0.01%浓度组和 0.1%浓度组，此分组能在减少实验动物数量前提下，完成 0.01%0.1%浓度阿托品滴眼液对兔眼部的安全性评价。3.2实验设计双眼给药方式，而非左右眼自身对比法，因考虑到药物虽属于眼结膜囊局部给药，但药物会通过眼部静脉入血进入体循环，到达双眼，采用双眼给药方式，能更准确判断药物对眼底的损伤情况。3.3临床上眼部给药不良反应以眼内炎症居多。包括眼角膜、结膜、虹膜炎症细胞浸润、出血、水肿、角膜及视网膜新生血管形成、血管炎症、晶状体异常及视网膜神经退变等眼部常见的组织病理改变7。结合临床用药安全性，低浓度阿托品滴眼剂非临床安全性评价侧重于考察药物对眼组织角膜、结膜、虹膜、视网膜等产生的功能性或器质性损伤。通过设计急性眼毒性实验和长期眼毒性实验，全面考察该药物对兔眼的刺激性和毒性反应。实验结果表明，0.01%浓度组和 0.1%浓度组在兔眼毒性试验中未发现眼表异常和组织病理性改变，预估低浓度阿托品滴眼液临床应用中相关不良反应的风险较低。本实验为 0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼剂的开发奠定了基础。参考文献1 Fu A，Stapleton F，Wei L，et al.Effect of low-dose atropine on myopiaprogression，pupil diameter and accommodative amplitude:low-dose at-ropine and myopia progression J.Br J Ophthalmol，2020，104(11):1535-1541.2 Wei SF，Li SM，An WZ，et al.Safety and efficacy of low-dose atropineeyedrops for the treatment of myopia progression in Chinese children:arandomized clinical trialJ.JAMA Ophthalmol，2020，138(11):1178-1184.3 Myles W，Dunlop C，McFadden SA.The effect of long-term low-doseatropine on refractive progression in myopic Australian school childrenJ.J Clin Med，2021，10(7):1444.4 Ji-Sun Moon，Sun Young Shin.The diluted atropine for inhibition ofmyopia progression in Korean childrenJ.International Journal ofOphthalmology，2018，11(10):1657-1662.5 赵兵新，张傲帆，崔璨，等.0.005%阿托品滴眼液控制低度近视儿童近视进展的安全性及有效性 J.国际眼科杂志，2022，22(3):388-393.6 邵雪，刘斌，岑小波，等.药物眼毒性非临床安全性评价的关注要点 J.中国药理学与毒理学杂志，2020，34(8):616-622.7 邵雪，王庆利，温泉，等.药物眼毒性反应及作用机制分析 J.中国药理学与毒理学杂志，2021，35(11):877-888.02海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期