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猕猴桃的遗传转化研究以及SSR分子标记在其遗传多样性中的应用

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猕猴桃的遗传转化研究以及SSR分子标记在其遗传多样性中的应用
摘要：猕猴桃栽培品种存在一定的缺陷，利用遗传转化技术对猕猴桃品质特性改良具有广泛的应用前景。对猕猴桃目的基因的分离，猴桃遗传转化的基本方法和研究进展以影响猕猴桃转化效率的因素进行了总结，并对猕猴桃遗传转化需解决的问题进行了探讨。综述了SSR标记技术在猕猴桃群体遗传多样性研究、基因连锁图谱的构建、种质资源鉴定以及分子标记辅助育种等方面的应用概况，并在此基础上提出了今后猕猴桃育种发展的方向.
关键词：猕猴桃；遗传转化；SSR；猕猴桃；遗传多样性
猕猴（Actinidia）属猕猴桃科猕猴桃属植物,其风味独特，营养丰富，Vc含量高，有一定保健功效，因而倍受关注。我国猕猴桃栽培面积居世界第一位，产量排第二位.目前，猕猴桃的栽培品种往往存在某些性状缺陷，如耐贮藏性和抗逆性较差等。通过常规育种方法改良往往周期长、工作量大、效率较低,很难满足生产发展的需要。采用遗传转化技术培育新品种,有几个明显的优点：首先,它可以有目的、有计划地引入优良性状而不需要改变原有的其它特性；其次，它可以突破物种障碍,把许多原来植株中没有的基因引入；另外，它可以在幼苗期对转化植株进行筛选和鉴定，大大缩短了得到稳定遗传的新品种所需要的时间.因此,遗传转化技术为猕猴桃种质改良开辟了一条新的途径，其将大大缩短猕猴桃的育种年限，扩展猕猴桃的育种范围，拓宽猕猴桃的基因资源，从而大力推动猕猴桃育种工作的进程.
一直以来，我国乃至世界上的主要栽培品种比较单一，引种区域相对狭小,此外,由于猕猴桃属中普遍存在自发的种间杂交和种内多倍化的现象，因此不同学者对该属植物种的界定及亲缘关系存在不同的看法。分子标记技术是猕猴桃群体遗传结构分析、物种遗传多样性鉴定、遗传基因连锁图谱构建以及分子标记育种等方面的理想工具。利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年.经过多年的发展，现在的DNA标记技术已有10多种,其中简单重复序列（SSR)或称微卫星DNA、简单串联重复序列(STRP)是高等真核生物基因组中种类多、分布广、具有高度的多态性和杂合度的分子标记技术,比RFLP和RAPD分子标记具有更丰富的多态性，呈孟德尔式遗传。由于其具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点,已经在猕猴桃遗传连锁图谱构建、遗传多样性研究、系谱与进化关系探索、基因分析、品种鉴定、分子标记辅助育种等方面得到初步应用。现将其在猕猴桃遗传多样性上的研究利用现状与展望作一综述，为猕猴桃种质资源的可持续利用和品种改良提供参考。
1. 猕猴桃目的基因的分离与克隆
迄今为止，在猕猴桃和其他果树上应用的目的基因已不少，但应用的目的基因大多数不是从其自身分离来的，而是从其他作物甚至微生物中分离、克隆出来的,并且多是在其他作物上先得到应用.目前,猕猴桃中已被分离和克隆的目的基因主要与猕猴桃果实成熟及衰老过程有关，如ACC合成酶（ACS）基因、ACC氧化酶(ACO）基因、多聚半乳糖醛酸酶(PG）基因、脂氧合酶（LOX）基因以及猕猴桃素(Actinidin）基因等。
猕猴桃是跃变型果实，乙烯是其呼吸高峰产生、果实衰老软化及色泽改变等的关键物质.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径中最后一个酶，催化ACC转化为乙烯，在果实成熟过程中,该酶是一限速酶。1993年,Macdiarmid等[1]成功地从猕猴桃果实中分离和克隆了ACC氧化酶基Cdna，其后，任小林等[2]也成功地从猕猴桃中分离到了ACC酶基因，并构建ACC氧化酶反义基因植株表达载体，为培养耐贮藏的猕猴桃新品种奠定了基础。在这之间，Ikoma等［3］从猕猴桃中成功地分离到ACC合成酶基因.通过将ACC合成酶反义基因导入猕猴桃，同样可增强猕猴桃的耐贮藏性。
细胞壁中的多聚半乳糖醛酸酶（PG）是一个果实成熟过程中特异性表达的细胞壁水解酶，PG被认为是参与果实细胞壁中果胶的溶解而在果实的软化过程中起着重要作用。目前，调节控制PG基因表达，已成为园艺植物基因工程的一个重要研究内容，同样也是猕猴桃研究的重要内容.1993年，Atkinson与Gardner[4]用番茄PG的cDNA克隆pTOM6作探针，在美味猕猴桃DNA中分离出PG基因，该基因长8062bp。随后，王中炎等[5]又从中华猕猴桃果实中克隆到PG基因,并研究了PC，-基因表达与果实成熟、乙烯释放的关系.
猕猴桃素是一种半胱氨酸蛋白酶,它能够把肉类的纤维蛋白质分解成氨基酸,使肉类嫩化。1990年，Snow—den和Gardner［6］克隆了一个由5个外显子和4个内含子组成的猕猴桃素基因,并命名为XKIWI44。Lin等[7]将美味猕猴桃素基因5’端区作为启动子与GUS基因构成嵌合基因，并将其转入矮牵牛属植物中得到表达。此外，陈昆松等[8］从成熟猕猴桃果实中克隆到一个长824bp的脂氧合酶基因片段.任小林等［9] 从美味猕猴桃首次成功地克隆了钙调蛋白cDNA。陈昆松等［10］后来又从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一个β-半乳糖苷酶基因cDNA片段。
2、猕猴桃遗传转化的方法
将目的基因导人植物细胞中的方法主要有物理、化学和生物学方法。其中物理法包括基因枪、电激、显微注射、激光、超声波、碳化硅纤维等；化学法有磷酸钙——DNA共沉淀、聚乙二醇、脂质体等；生物学方法主要有农杆菌、花粉管通道法等.目前，在猕猴桃遗传转化中应用的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、PEG法等。
2.1农杆菌介导法
农杆菌介导法是植物基因工程应用最常用、成功率最高的遗传转化方法.农杆菌介导法相对于其他转化法而言，具有明显的优点:外源基因多以单拷贝或低拷贝数插入,较少出现基因沉默现象;转化效率高,转化结果重复性好；可以转移大片段DNA等。在木本植物的转基因研究中,绝大多数是以农杆菌介导法而实现的，利用农杆菌法进行猕猴桃遗传转化的研究起始于20世纪90年代初，转移的基因多数为报告基因GUS和筛选标记基因NPTII等，近些年来，也有一些利用农杆菌介导法将目的性状改良的基因导入猕猴桃的报道。
Gonzalez等[11]最早采用农杆菌介导法进行猕猴桃遗传转化的研究,其用海沃德的叶柄、叶片与根癌农杆菌共培养48 h，然后将外植体进行培养，诱导出愈伤组织与类似胚状体的瘤状物.1991年，Uemastu等［12]和Rugini等[13］习利用农杆菌介导法首次成功转化猕猴桃。1993年,Janssen等［14］ 利用标记基因GUS的瞬间表达，建立了一个高效、可重复的猕猴桃遗传转化体系。1994年，刘春林等[15] 以美味猕猴桃茎段产生的愈伤组织为受体,通过根癌农杆菌介导获得了抗Kan的抗性苗.1996年，Yazawa等［16］。以猕猴桃根段为受体,通过发根农杆菌介导而导入pRiA4外源基因，获得转基因植株.同年,Kobayashi等［17] 利用编码人类表皮生长因子的基因转化猕猴桃获得转化植株；Yamakawa等［18］以叶圆片为外植体,通过与发根农杆菌共培养，获得了多个猕猴桃品种的转基因植株。1998年，Fung等[19] 以叶片为外植体，利用农杆菌介导法，将gus报告基因转入美味猕猴桃获得转基因植株；Kusada等［20] 将可以改变形态特性的同源水稻基因OSH1基因导入猕猴桃,转化植株表现出叶小、矮化、叶缘开裂和无顶端优势等特征，为果树矮化品种的培育提供了新思路。1999年，郭卫东等［21]以农杆菌菌株LBA4404介导的叶盘法转化猕猴桃，将LfycDNA导入猕猴桃基因组中，以期提高猕猴桃的早实性；同年，Nakamuura等［22]以叶盘为受体,把大豆β-1，3-内切葡聚糖酶基因导入猕猴桃，转化植株的抗病性高于对照。樊军锋等［23］利用叶盘法和基因枪相结合的方法将双价盐基因mtlD/gutD导入秦美猕猴桃。黄萍等[24］以叶柄为受体，采用短时液相共培和长时气相共培相结合的转化方法,获得抗Kan的植株，初步建立起了一套叶柄的农杆菌转化体系。毕静华等[25]以阔叶猕猴桃的叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法成功获得了转基因植株，为通过基因工程对阔叶猕猴桃进行遗传改良奠定基础.文档为个人收集整理，来源于网络本文为互联网收集，请勿用作商业用途
2.2基因枪法
该方法的优点是可直接转化植物的各种外植体，且不受基因型的限制。但该方法存在转化频率较低，容易出现基因沉默，外源DNA整合的机理尚不清楚等缺点。在多种果树上已有利用基因枪转化方法转化成功的报道［26，28] ，但在猕猴桃遗传转化方面未见单独转化成功的相关报道。基因枪的轰击会对外植体造成创伤，而创伤有利于农杆菌对外植体的侵染。1996年，Scorza等［29]就利用两步法转化来提高葡萄的转化率，他们先用基因枪轰击葡萄体胚两次,再与农杆菌共培养，提高了转化率。樊军锋等［23］ 利用叶盘法和基因枪相结合的方法转化猕猴桃同样提高了遗传转化的效率.
2.3、PEG法
PEG法的基本原理是PEG作为原生质体融合剂，使细胞膜之间或与膜形成分子桥，促进相互的接触和粘连。也有研究认为，它可引起膜表面电荷紊乱，干扰细胞间的识别,从而促进细胞膜的融合和外源进入原生质体,实现基因的转化。由于木本植物原生质体再生植株周期长，难度大,加上原生质体操作繁琐,利用原生质体作为受体的转基因方法在木本植物上应用较少，在猕猴桃遗传转化方面应用也不多。Oliv—efia等［30]以美味猕猴桃原生质体为受体，用PEG和电激法将CAT(氯霉素磷酸转移酶）基因转化原生质体获得成功.朱道圩等[31］用PEG介导法对软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化，成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体。
3、影响猕猴桃遗传转化效率的因素
3.1 转化方法
农杆菌介导的叶盘法是目前猕猴桃基因及其他木本植物改良中最成熟、最高效的方法。但农杆菌介导法的转化过程中要合理掌握菌液的浓度、侵染和共培养的时间等，且需要解决培养过程中容易出现细菌大量增殖而导致外植体不能继续生长的问题。Janssen等［32] 在猕猴桃叶片共培养时研究发现，在培养基上加一层滤纸能提高转化率.基因枪转化效率较低，但常可在轰击叶片上形成很多微小创伤而有利于农杆菌的侵染，因此，将基因枪转化和叶盘法转化相结合，可大大提高基因转化效率［6，23］ 。PEG法可直接将外源DNA导入植物细胞，且很少产生嵌合体，但制备原生质体困难，再生周期长，且PEG对细胞具有一定的毒害作用,因此,选择PEG法进行遗传转化时,应注意植物材料的生理状态以及PEG的种类和浓度的选择。
3.2 受体系统
作为受体系统要求具有良好的再生能力和充足的外植体来源。木本植物叶片、茎段、叶柄、愈伤组织、悬浮细胞系及原生质体等均可作为遗传转化受体，由于原生质体再生困难,愈伤组织和悬浮细胞系容易出现变异体，因此，为使转基因植株保持原来优良性状，通常以叶片、茎段等直接分化形成不定芽的外植体。例如苹果的转化主要以叶片为受体,柑橘类主要采用茎段、胚轴和子叶，猕猴桃也主要以叶片或叶圆盘为受体[13,16，22］，而葡萄则通常利用胚性培养物来转化。同时，受体植物的基因型也非常重要,因为不同物种对农杆菌的敏感性不同，甚至同一种的不同品种对农杆菌的敏感性也大不相同。目前，在获得的猕猴桃转基因植株中有美味猕猴桃[13]、中华猕猴桃［16］和阔叶猕猴桃［25］。
3.3 筛选标记基因
在质粒载体构建中往往插入了标记基因，它能编码正常植物细胞中不存在的酶，并能在转化体中充分表达而易于检测。对于不同植物、同一植物不同品种所实用的筛选标记基因不同,筛选标记基因和筛选剂的种类和浓度的选择正确与否直接影响转化的成功与否。新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)是猕猴桃转化研究中最常使用的标记基因，该基因产物具有抗氨基糖苷类抗生素卡那霉素和G418的功能，其作用原理是NPTII基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生素失活，从而解除毒性,抗生素卡那霉素的使用浓度一般为25～50 mg／L.磷酸转移酶基因（HPT)和抗除草剂基因（bar基因）等选择标记基因在其他果树遗传转化中也有使用［32，33] ,但在猕猴桃中还尚未见报道。
3。4农杆菌菌株
不同农杆菌菌株、甚至同一菌株在不同培养条件下侵染能力有明显差异,也就是说农杆菌菌株本身的因素对其侵染能力有很大影响.这些因素包括农杆菌的趋向能力;农杆菌表面存在不适合的成分阻止农杆菌对植物细胞的附着；农杆菌外膜的信号受体蛋白不能有效地识别植物细胞分泌的诱导分子等。不同农杆菌菌株对猕猴桃侵染力有一定的差异,有研究表明A281略好于C58，EHA101和LBA4404［34］ ，Bond［35]等 也比较了C58、EHA101和LBA4404三种农杆菌菌株对柑橘的转化频率,发现C58的感染力强于EHA101，而LBA4404的转化频率最差。但由于LBA4404菌株广谱性好，对多种植物均有较好侵染力,且易于保存繁殖，故常用于开展猕猴桃转化研究［23].
4、SSR分子标记在其遗传多样性中的应用
4。1 遗传多样性的研究
采用快捷、精确、可靠的方法对猕猴桃种质资源进行遗传多样性分析，明确其间的遗传距离，对于猕猴桃的充分利用、遗传学研究及育种实践均有重要价值。2004年,栗琪等对我国猕猴桃的2个商业栽培物种—- 中华猕猴桃(A．chinensis）和美味猕猴桃(A deliciosa)的9个天然居群（共221个样)的遗传多样性进行了初步分析,通过对14对猕猴桃引物的筛选，8对重现性好的引物扩增结果表现出良好的多态性[36] .在8个多态性位点上共获得222个等位基因。居群等位基因平均数A=17.3，多态位点百分率P=100，多态信息指数PIC为0．87—0．96,显示出我国的猕猴桃野生居群具有极高的遗传多样性。中华猕猴桃和美味猕猴桃野生居群拥有高比例的共同等位基因，反映 二者具有极近的亲缘关系.2006年，刘亚令等采用空间自相关分析方法对同域分布的中华猕猴桃和美味猕猴桃自然居群SSR遗传变异的空间结构进行了研究，结果表明：中华猕猴桃和美味猕猴桃的遗传变异在居群内均存在一定程度的空间结构，尽管近半数或半数以上的等位基因在居群内表现为随机分布的空间模式,但也有相当比例（29．6% ～148.0％）的等位基因在种内居群中和复合居群中(河南西峡51%，陕西商南44．7％)呈现渐变、衰退、双向衰退或侵扰模式；而且其居群内遗传变异的空间分布规律，不论是在种内还是复合居群中都基本一致：相距在100 m以内，特别是30 m范围内的个体间的等位基因表现出显著的正相关，但随着地理距离的增大逐渐显示出负相关，说明猕猴桃属植物的有效传粉距离可能在100 m左右，种子散播主要集中在30 m的近距离内[37］ 。猕猴桃自然居群遗传变异的空间结构是其传粉和种子散播等生物学特性与生境共同作用的结果,其中种子近距离的散播、花粉传播的有限距离及人为干扰是最主要的因素。个人收集整理，勿做商业用途文档为个人收集整理，来源于网络
4.2基因连锁图谱的构建
Testolin采用“假测交”的作图技术，用SSR和AFLP标记构建了猕猴桃遗传连锁图［38] .从A．chinensis×A．callosa（中华×硬齿）杂交后代l:1分离群体或类似比例传统回交的后代中挑选了94个单株,并对251个标记进行筛选,获得105个微卫星位点进行遗传作图,母本图谱包括225个标记，父本图谱分离出168个标记。对所有品种杂交组合的25个SSR等位基因连锁分析发现，79％ 的SSR可在A．chinensis XA．chinensis组合中作图,66％ 的可在A．chinemh x其他(非中华猕猴桃）组合中作图，45%的在其他x其他组合中定位作图，同锚定位点百分率(分别为35％ 、19％和9％）的研究结果类似，证明中华猕猴桃种内品种问杂交后代群体可以作数量最多的SSR图谱，且可获得最多的锚定标记.许文平等采用改良CTAB法提取美味猕猴桃（Actinidia deliciosa ev．Bru—no)基因组DNA，经CsCl密度梯度离心纯化后用经部分酶切，通过透析袋电泳的方法分级回收，最后得到含有1．05 XlO pfu的基因组文库，扩增后文库滴度为2．50 x10 pfu/ml。利用6对根据植物基因保守区或猕猴桃基因序列设计的专一引物对基因组文库和基因组DNA进行PCR扩增，均得到与预计长度相符的目的基因片段[39］ 。文档为个人收集整理，来源于网络本文为互联网收集，请勿用作商业用途
4。3种质资源鉴定
植物品种权保护条例的试行，目的在于保护育种者育成品种的利益不受侵害.品种权受保护的条件是：它必须有别于其他已育成品种的特征。过去特征多用花、茸毛颜色、叶形、生长习性、生育期长度等形态特征描述，但许多现代育成品种遗传背景相近,随着登记品种的增多，根据农艺性状区分品种已变得十分困难。SSR分子标记技术是进行品种鉴定的一种高效方法。SSR指纹图谱将为品种提供独特的鉴定特征.结合SSR多态性及其精确的片段大小，便可建立每一品种的标准图谱,以鉴别品种。
猕猴桃属植物的基因组为375 000～750 000 kb[40］，现有研究结果表明，猕猴桃在DNA水平上也具有很高的多态性和特异性,能清晰反映品种间的差异。Guido等用80条随机引物对中华猕猴桃、狗枣猕猴桃和13个美昧猕猴桃栽培品种进行检测，筛选品种特异性和基因型特异标记,每条引物得到的条带数为4～11条，所有品种均能被鉴别出来［41]。Huang等用20个微卫星研究了二倍体和四倍体中华猕猴桃,二倍体中华猕猴桃的杂合度在50％ ~85% ，而四倍体中华猕猴桃则高达90％ ～100％ ；且位点内杂合程度高于同工酶水平，三基因和四基因的杂合体高达60%以上，可见多倍体猕猴桃保持着更加丰富的遗传多样性［42］ 。郑轶琦等通过对l6对高多态性的猕猴桃SSR引物筛选,选用9对稳定、适用性好的引物对我国栽培的48个猕猴桃品种（品系）进行了初步研究，在9个多态性位点上共获得213个等位基因片段，其SSR指纹图谱可将供试品种完全区分开[43］.遗传多样性分析和分辨力检测表明，我国猕猴桃栽培品种具有较高的遗传多样性，SSR标记在猕猴桃品种中有较高鉴定效率.中华／美昧品种群拥有高比例的共同等位基因，反映出两者极近的亲缘关系.文档为个人收集整理，来源于网络文档为个人收集整理，来源于网络
2004年，Amer等用9个简单序列重复（SSR）标记来调查代表全世界90％ 以上猕猴桃生产的48个猕猴桃品种和选择系［44]。这9个SSR标记是多态的，并且检测到213个等位基因，结果发现每个位点平均有23．7个等位基因，其变幅在9～38个等位基因。发现133个等位基因是A．chinensis和Adeliciosa物种所共有的,而33和36个等位基因分别是中华和美味物种所特有的。此外，34个等位基因是一个基因型所特有的，并为品种鉴定提供了一组有价值的等位基因。单个的SSR位点即UDK96—414可以区分两个假定无性系以外的全部48个基因型。使用SSR标记制成的一致性酶解图谱是确定猕猴桃品种和选择系遗传相似性的一种有用而可信赖的方法。与RAPD标记比较，这种图谱还可改进遗传多样性和亲缘性评价的有效程度。
4.4分子标记辅助育种
长期以来，植物育种都是依植株表型性状进行选择的，DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段.SSR标记因其数量丰富、单一的多等位基因位点等特性，使育种目标基因容易识别和筛选,结果可靠。运用SSR技术标记指示重要农艺性状，为育种提供了一个广泛的领域。培育优良抗病品种一直是国内外猕猴桃育种工作者的重要目标.现代分子生物学技术的发展为此提供了有力的辅助工具.据报道，意大利从抗根结线虫研究人手，从软枣猕猴桃、中华猕猴桃、美味猕猴桃中分别获得2、l7、l5个株系，对意大利根结线虫种群具有抗性[45]。“Kousui”是日本用软枣猕猴桃与美味猕猴桃通过种间杂交获得的优系，果皮绿褐色、无毛，果肉绿色，平均单果重约40g,可溶性固形物达17％一18％[46］.中国也育出了系列早、中、晚熟品种，其中,“金桃”品种和无子猕猴桃新品系成为亮点之一[46-47］ 。新西兰经过6年时间在猕猴桃上建立起一个高效农杆菌介质基因转移系统，中华猕猴桃转基因的叶片外植体形成的愈伤组织抗卡拉霉素率达30％以上，而美味猕猴桃转基因的叶片外植体形成的愈伤组织抗卡拉霉素率达60％以上，通过该系统获得了大量的抗卡拉霉素转基因猕猴桃植株,并用Kan、PCR和Southem方法对其进行分析以确认其稳定性［45］。个人收集整理，勿做商业用途个人收集整理，勿做商业用途
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