MALDI-TOF_MS在...肉动物源性成分检测中的研究_方志娟.pdf

MALDITOF MS 在不同禽肉动物源性成分检测中的研究方志娟1，李晓芹1，张雪婧1，沈麒亮1，金 萍2，叶 湖1*(1苏州市食品检验检测中心，江苏苏州 215104;2苏州市产品质量监督检验院，江苏苏州 215104)摘要 目的 建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry，MAL-DITOF MS)技术检测不同禽肉动物源性成分的方法，构建不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库，对不同禽肉进行鉴别。方法 样品用磷酸盐缓冲液提取，净化后用MALDITOF MS 法测定。采用ChemPattern 软件对不同禽肉蛋白图谱进行化学计量学分析，建立识别模型。结果 鸡、鸭、鹅 3 种不同禽肉之间具有明显差异。首次建立不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库，可一次性对每个样品中鸡、鸭、鹅等肉源性成分进行同时分析。结论 建立的基于蛋白质组学的鸡、鸭、鹅源性成分鉴定系统具有简便、稳定、准确、重现性好的优点，适用于不同禽肉中鸡鸭鹅动物源性成分的鉴别。关键词基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;动物源;成分;检测;禽肉中图分类号TS2517文献标识码A文章编号05176611(2023)07018904doi:103969/jissn05176611202307043开放科学(资源服务)标识码(OSID):Study on Detection of Animal-derived Components in Different Poultry Meat by MALDITOF MSFANG Zhi-juan，LI Xiao-qin，ZHANG Xue-jing et al(Suzhou Food Inspection and Testing Center，Suzhou，Jiangsu 215104)Abstract Objective Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)was used to detect theanimal-derived components of different poultry meatThe standard database of protein molecular fingerprints was established to identify differentpoultry meat Method Samples were extracted with phosphate buffer and determined by MALDI-TOF MSChemPattern software was used tocarry out chemometric analysis on protein profiles of different poultry meat，and then an identification model was established esult There areobvious differences among three kinds of poultry meat(chicken，duck and goose)It was the first time to establish a standard database of pro-tein molecular fingerprints of different poultry meat，which could be used for simultaneous analysis of chicken，duck，goose and other meat de-rived components in each sample at one time Conclusion The identification system of chicken，duck and goose based on proteomics has theadvantage of simplicity，stability，accuracy and good reproducibilityIt is suitable for the identification of animal-derived components of chicken，duck and gooseKey wordsMatrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS);Animal-derived;Component;De-tection;Poultry基金项目江苏省市场监督管理局科技计划项目(KJ21125003);江苏省市场监管重点实验室项目“食品安全快检技术与产品评价”。作者简介方志娟(1987)，女，江苏南通人，工程师，硕士，从事食品检验研究。*通信作者，高级工程师，从事食品检验与质量控制研究。收稿日期20220901随着生活水平的提高，人们对肉类的需求越来越大，同时对肉类品质也提出了更高的要求1。“鸭肉冒充羊肉”等一系列事件，让消费者对肉类掺假问题越来越重视2。肉类掺假主要是为了有目的地获得产品的表观价值或降低产品的成本，这种欺诈行为严重损害了消费者的权利和健康，扰乱了市场公平交易机制35。因此，开发高效、灵敏、快速的肉类鉴别技术和体系，有利于打击肉类掺假和欺诈行为，具有非常重要的实用价值和社会意义68。目前鉴别肉类掺假的方法很多，有实时荧光 PC法911、酶联免疫分析法12、电子鼻结合统计学分析技术1315、核磁共振技术1618、近红外特征光谱技术1921 等。MALDITOF MS 技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI)技术与飞行时间质谱(TOF MS)的结合，具有快速、稳定、准确、重复性好的特点2224。近年来，已被越来越多地应用于微生物鉴定等各领域2529。研发低成本、高通量的 MALDITOFMS 技术可能成为肉类掺假鉴别方法的主流趋势和发展方向。该研究利用 MALDITOF MS 技术分析不同禽肉如鸡、鸭、鹅的蛋白质谱图，首次建立不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库;配合 ChemPattern 先进化学计量学分析，建立基于蛋白质组学的鸡、鸭、鹅源性成分鉴定系统，为鸡、鸭、鹅3 种不同禽肉动物源性成分的鉴别提供了新思路。1材料与方法11材料与试剂磷酸盐缓冲液(PBS)、SA IV 型蛋白、多肽提取或纯化试剂，融智生物科技(青岛)有限公司。禽肉样品(16 批次鸡、25 批次鸭、15 批次鹅)，均购自当地超市。12仪器与设备BagMixer 400 拍打式均质器，法国 Inter-science 公司;QUAN TOF 1 质谱仪，融智生物科技(青岛)有限公司;AL 204 电子天平，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司;IQ7000 超纯水机，密理博(中国)有限公司。13试验方法131禽肉蛋白质的提取。称取 25 g 禽肉样品(分别为鸡肉、鸭肉、鹅肉)，用水清洗，放入无菌袋;倒入 225 mL PBS 到无菌袋;以 4 次/s 的速度均质 2 min;将上清倒入 50 mL 离心管中，4 冰箱，静置8 h。再从50 mL 离心管中取上清，即得肉浸液，放入80 冰箱备用。取 2 L 肉浸液，加 18 LSA IV型蛋白、多肽提取或纯化试剂，混匀，滴加 2 L 于靶点正中，干燥，待测。132质谱数据的采集。将制备好的样品靶通过检测口放入质谱仪内部托盘并固定。启动激光系统提供脉冲激光，打击样品靶点，在质荷比(m/z)2 00034 000 扫描和采集数据。采用仪器自带分析软件对质谱图进行平滑、对齐、归一化等安徽农业科学，JAnhui AgricSci 2023，51(7):189192，195处理。133化学计量学分析。将采集到的 56 组 MALDITOF MS数据导入 ChemPattern 化学计量学软件 科迈恩(北京)科技有限公司，筛选获得共有模式，再对鸡、鸭、鹅 3 种禽肉的差异性进行多元统计分析。2结果与分析21禽肉动物源性成分指纹图谱的建立对 56 批次 3 种不同的禽肉进行测定，采集 MALDITOF MS 谱图，并进行平滑、对齐、归一化等处理，鸡、鸭、鹅 3 种不同类型禽肉质谱图如图 1 所示。图 1鸭(a)、鸡(b)、鹅(c)3 种不同类型禽肉质谱图Fig1Mass spectrograms of duck(a)，chicken(b)and goose(c)three different types of poultry meat22指纹图谱相似度分析将质谱数据导入 ChemPattern软件进行分析，样品图谱经去背景、平滑等规范化前处理，以保留时间对样品图谱进行校正。采用欧氏距离算法分析相似度，结果发现(图2)，鸡、鸭、鹅3 种不同类型禽肉能够归属到各自类别，同一类型产品距离共有模式的距离相当，分离效果较好。图 2相似度评价结果Fig2Similarity evaluation results23指纹图谱多元统计分析多元统计分析方法常用的有系统聚类分析、主成分分析、偏最小二乘判别分析、自组织映射人工神经网络等30。系统聚类分析是一组将研究对象分为相对同质的群组的统计分析技术，以距离函数的规律作模式分类，将相似的归为一类，不相似的归为一类31。主成分分析是一种有效的数据降维方法，仅用部分主成分就能表达原有变量的重要信息32。偏最小二乘判别分析是对多元线性回归模型的拓展，是偏最小二乘回归的特殊形式。自组织映射人工神经网络广泛适用于复杂体系数据的可视化、降维、模式识别以及数据挖掘，任意维数的原始数据都可以在保持拓扑结构不变的情况下映射到二维空间内。鸡、鸭、鹅 3 种不同类型禽肉的系统聚类分析如图 3 所示。它按照不同对象之间的差异，利用欧式距离函数作模式进行分类。图 3b 中的颜色代表归一化法下各个峰所占的面积百分比，可以看出 21、7、20 号峰在 3 种不同类型禽肉中区别较大，是区别 3 种不同类型禽肉的强特征峰。系统聚类分析结果显示 3 种不同类型禽肉能被很好地区分开。该分析方法为不同类型禽肉的鉴别提供了依据，可直观地观察每个091安徽农业科学2023 年样品中的共有峰在样本和自变量 2 个维度中所形成的聚类模式，以及其对聚类结果的影响，同时能够清楚地反映出样本或变量的亲疏关系。图 3一维(a)、二维(b)聚类分析结果Fig3esults of one-dimensional(a)and two-dimensional(b)cluster analysis图 45 分别为鸡、鸭、鹅 3 种不同类型禽肉的主成分分析和偏最小二乘回归分析，2 种不同的分析方法结果完全相同;尽管鹅的样品中 49、52 号样品出现偏离现象，但从图中可以看出，3 种不同类型禽肉能很好地被分开。自组织映射神经网络分析(图 6)显示的样品位置情况更为直观，样品分类结果与前 2 种分析方法一致。图 4主成分分析图谱Fig4Principal component analysis map24化学模式识别将鸡肉样品作为测试集，采用 PLSDA算法进行模式识别，测试结果如表 1、图 7 所示。从表 1 和图7 可以看出，鸡肉样品全部被识别，误识率为 0、识别率达100%。因此，所建立的模型能够提供一个稳定的评价标准，准确判定所选禽肉的类型。图 5偏最小二乘回归分析图谱Fig5Partial least squares regression analysis map图 6自组织映射神经网络图谱Fig6Self-organizing map neural network map19151 卷 7 期方志娟等MALDITOF MS 在不同禽肉动物源性成分检测中的研究图 7PLSDA 模型分类预测效果Fig7Classification prediction effect of PLS-DA model表 1模式识别结果统计Table 1Statistics of pattern recognition results禽肉Poultry归属Attribution总样本Total sample训练集Training set验证集Validation set测试集Test set拒识率 F%误识率 FA%鸭 Duck训练集25223000鸡 Chicken训练集16142000鹅 Goose训练集15132000鸡 Chicken测试集600600合计 Total624976003结论该研究采用 MALDITOF MS 技术从分子层面对不同禽肉进行鉴定，结果准确可靠。该方法前处理简单，样本只需进行常规肉浸液提取后即可上机检测，每小时可处理 30 个以上的样本，快速高通量。利用构建成的不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库，可一次性对每个样品中鸡、鸭、鹅等肉源性成分进行同时分析。该研究不仅可以为检验检测机构提供一种有效鉴别不同禽肉的检测方法，还可以为监督执法机构提供一种有力的监督手段，维护禽肉食品市场更稳定更健康的发展。参考文献 1 MANN N JA brief history of meat in the human diet and current healthimplications J Meat Sci，2018，144:169179 2 IAMMAINO M，MAINO，ALBENZIO MHow meaty?Detection andquantification of adulterants，foreign proteins and food additives in meatproducts J Int J Food Sci Technol，2017，52(4):851863 3 SENTANDEU 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种抗氧化剂的分析时间至18 min。在 18 min 内，9 种抗氧化剂有效分离，峰型良好，响应强度增加。明确了固体含油食品的油脂浸提步骤，加入 12 倍体积的石油醚提取 4 h 后氮吹至溶剂挥发完全。采用乙腈提取抗氧化剂，可明显提高 BHT 的回收率。经薯片样品进行方法学验证，9 种抗氧化剂的回收率为 752%1047%，SD 均小于 10%，满足方法测定要求。表 19 种抗氧化剂的保留时间和线性方程Table 1etention times and linear equations of 9 antioxidants抗氧化剂Antioxidant保留时间etentiontimemin标准曲线Standard curve2PG6181y=33 057x43 4600999 5THBP7064y=37 554x52 5460999 6TBHQ7579y=9 128x11 8720999 6NDGA8716y=13 800 x19 0320999 4BHA9429y=8 684x10 4790999 7OG9702y=24 143x39 4150999 4Ionox1009929y=4 575x6 3520999 5DG11444y=19 474x30 5870999 6BHT11872y=6 083x6 9170999 7表 2薯片样品中 9 种抗氧化剂的回收率和精密度试验(n=6)Table 2ecovery rates and precision test of 9 antioxidants in potato chips samples单位:%抗氧化剂Antioxidant20 mg/kg回收率ecovery rateSD40 mg/kg回收率ecovery rateSD100 mg/kg回收率ecovery rateSDPG918212930247937415THBP956221965252956430TBHQ854300855256833408NDGA822311857258887411BHA829208807267846467OG10472621027231985466Ionox100922217928252929436DG836299833259835506BHT781212794273752439参考文献 1 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