HPLC-DAD法分析不同...下银杏叶色素含量的变化规律_沈红.pdf

第 43 卷第 2 期2023 年 4 月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.43 No.2Apr.2023 收稿日期:2021-12-24 基金项目:国家自然科学基金资助项目(32101473)作者简介:沈 红(1992),女,河南信阳人,博士生,从事天然产物的研究工作;E-mail:2978963446 通讯作者:王成章,研究员,博士生导师,主要从事天然产物研究与利用;E-mail:wangczlhs 。doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2023.02.012HPLC-DAD 法分析不同月份和干燥方式下银杏叶色素含量的变化规律SHEN Hong沈 红1,2,3,张昌伟1,2,陈虹霞1,2,袁 花1,2,蒋建新3,王成章1,2(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心,江苏 南京 210042;2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210037;3.北京林业大学材料科学与技术学院,北京 100083)摘 要:采用 HPLC-DAD 法研究了不同月份银杏叶色素含量的变化规律,并通过聚类分析和逼近理想值排序(TOPSIS)法评价了不同干燥方式对银杏叶色素含量的影响。研究结果表明:所建立的 HPLC-DAD 方法简单、准确、灵敏度高、重复性好;4 11 月银杏叶色素含量存在明显差异,其中脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿酸盐 a 和-胡萝卜素在 4 月份达到最高值,分别为(1 762 121)、(628 32)和(482 45)g/g,叶绿素 a 和 b 在 5 月份达到最高值,分别为(8 701 571)和(3 140 274)g/g,叶黄素在 7 月份达到最高值,为(2 057 104)g/g。聚类分析结果表明:12 种干燥方式可分为 4 类,冷冻干燥、40 减压干燥、40 常压干燥聚为 A 类,阴干聚为 B 类,100 减压干燥和100 常压干燥聚为 D 类,剩下6 种干燥方式聚为 C 类。通过 TOPSIS 法分析发现:银杏叶干燥方式排名前 5 的依次为冷冻干燥、40 减压干燥、40 常压干燥、阴干和 60 常压干燥。综合考虑,40 减压干燥是最适合于工业化生产的干燥方法,干燥速度快,且色素得到有效保护。关键词:HPLC-DAD;银杏叶;色素;干燥方式;变化规律中图分类号:TQ35;TQ041 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)02-0089-09引文格式:沈红,张昌伟,陈虹霞,等.HPLC-DAD 法分析不同月份和干燥方式下银杏叶色素含量的变化规律J.林产化学与工业,2023,43(2):89-97.Change Law of Pigments Content of Ginkgo biloba Leaves in the DifferentMonths and Dry Modes Analyzed by HPLC-DAD MethodSHEN Hong1,2,3,ZHANG Changwei1,2,CHEN Hongxia1,2,YUAN Hua1,2,JIANG Jianxin3,WANG Chengzhang1,2(1.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province;KeyLab.of Chemical Engineering of Forest Products,National Forestry and Grassland Administration;National EngineeringResearch Center of Low-Carbon Processing and Utilization of Forest Biomass,Nanjing 210042,China;2.Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,Nanjing Forestry University,Nanjing210037,China;3.College of Materials Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)Abstract:HPLC-DAD method was used to study the change law of content of Ginkgo biloba leaves pigments in different months,and the effects of various drying methods on the content of G.biloba leaves pigments were evaluated by cluster analysis andtechnique for order preference by similarity to an ideal solution(TOPSIS).The results showed that the established HPLC-DADmethod was simple,accurate,sensitive and reproducible.G.biloba leaves pigments content was significantly different from Aprilto November.The contents of chlorophylide a,pheophorbidel a and-carotene reached the highest values in April,which were90 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷(1 762 121),(628 32)and(482 45)g/g,respectively.The contents of chlorophyll a and b arrived at the highestvalues in May,which were(8 701 571)and(3 140 274)g/g,respectively.The content of lutein could get to the highestvalue in July,which was(2 057 104)g/g.Cluster analysis results demonstrated that 12 kinds of drying methods could bedivided into four categories.Freeze drying,vacuum drying at 40,and atmospheric drying at 40 were clustered as Acategory.Shade drying was clustered as B category.vacuum drying at 100 and atmospheric drying at 100 were clustered asD category.The left 6 kinds of drying methods were clustered as C category.Through the analysis of TOPSIS method,it wasfound that the top five drying methods of G.biloba leaves were freeze drying,vacuum drying at 40,atmospheric drying at40,shade drying and atmospheric drying at 60.Considering comprehensively,vacuum drying at 40 was the mostsuitable drying method for industrial production,with fast drying speed and effective protection of pigments.Key word:HPLC-DAD;Ginkgo biloba leaves;pigments;drying modes;change law银杏(Ginkgo biloba)是我国特有且资源极其丰富的林源植物1,银杏叶中含有 200 多种生物活性成分2-4,其中色素类成分因具有良好的抗氧化、抗炎、抗癌以及预防阿尔茨海默病等活性而备受关注5-7。银杏叶色素不仅具有良好的生物活性,而且可通过光合作用把光能转化成化学能并合成大量具有生物活性的有机物质8-9。但银杏叶色素的稳定性较差,光、热、氧、酸、碱等都可导致其降解10-12。干燥是保障银杏叶品质的重要加工方式,因此考察不同干燥方式对银杏叶色素含量的影响对于银杏叶的精深加工利用具有十分重要的指导意义。不同采集时间对银杏叶色素含量以及其他生物活性物成分含量均影响较大,故考察不同月份银杏叶中色素含量可指导银杏叶的采摘日期,同时为研究色素对其他生物活性成分的影响奠定基础。目前,关于银杏叶色素类化合物的组成及含量分析方法的系统研究鲜见报道,主要是因为银杏叶色素类化合物的标准品在市场上很难购买到,部分色素极性相近难以分离,叶绿素降解产物多、最大吸收波长分布较广,且光谱中的索雷谱带和类胡萝卜素具有相似的吸收波长,易互相干扰。植物色素分析通常采用薄层色谱法、荧光比色法、拉曼光谱法等,HPLC-DAD 法因分离效果好、灵敏度高、能够对任意峰进行全波长扫描并记录各峰的光谱信息等优点成为近年来色素组成及含量分析领域的研究热点13-15。因此,本研究采用 HPLC-DAD 法分析不同月份银杏叶色素含量的变化规律,通过聚类分析和逼近理想值排序(TOPSIS)法评价不同干燥方式对银杏叶色素含量的影响,以期为银杏叶色素的高值化利用提供基础数据。1 材料与方法1.1 原料、试剂和仪器银杏叶,于 2021 年采自江苏省邳州市国家银杏良种种植基地;叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、-胡萝卜素、-胡萝卜素、甲醇(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、乙酸铵、氢氧化钠等,均购于阿拉丁化学试剂有限公司;脱镁叶绿酸盐 a,购于上海源叶科技有限公司。CPA225D 十万分之一分析天平;冷冻干燥机;真空干燥箱;岛津 LC-20AT 型高效液相色谱仪,日本岛津公司;KH5200E 型超声波清洗仪,昆山禾创超声仪器有限公司。1.2 银杏叶色素含量检测方法的建立1.2.1 标准储备液的制备 取叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、脱镁叶绿酸盐 a 标准品适量,丙酮溶解,分别配制成质量浓度为 500 mg/L 的储备液;取-胡萝卜素、-胡萝卜素标准品适量,石油醚溶解,分别配制成质量浓度为 200 mg/L 的储备液,4 避光保存。1.2.2 脱镁叶绿素储备液的制备 向 5 mL 叶绿素 a 和 b 的储备液中滴加 1 mol/L 的盐酸,摇匀使盐酸与叶绿素充分反应,叶绿素丙酮溶液由绿色变成橄榄绿色,即叶绿素完全转化成脱镁叶绿素后,向溶液中滴加 1 mol/L NaOH 溶液中和至中性,乙醚萃取,即得脱镁叶绿素 a 和 b,然后真空挥干乙醚,丙酮溶解,制备成质量浓度为 200 mg/L 的储备液,过 0.45 m 有机膜,4 避光保存16。1.2.3 脱植基叶绿素 a 储备液的制备 脱植基叶绿素 a 是通过臭椿嫩叶(2021 年 4 月中旬采摘)粗提纯化的叶绿素酶酶解相应叶绿素母体结构(叶绿素 a)制备。叶绿素酶粗提液按文献17-18方法制备。第 2 期沈 红,等:HPLC-DAD 法分析不同月份和干燥方式下银杏叶色素含量的变化规律91 取 0.2 mL 叶绿素丙酮溶液,0.4 mL 臭椿叶叶绿素酶粗提液和 0.4 mL pH 值 8.5 的 100 mmol/L Tris-HCl(含有0.24%Triton-X100)缓冲溶液,混匀后黑暗条件下在35 水浴中反应30 min,立即加入1 mL终止液(10 mmol/L KOH 溶液),然后加入-20 预冷的丙酮 4 mL、正己烷 6 mL。然后离心 10 min(转速为 12 000 r/min,温度为 4),下层丙酮相即为脱植基叶绿素 a,真空挥干丙酮和水,用丙酮溶解,制备成质量浓度为 100 mg/L 的储备液,过 0.45 m 有机膜,4 避光保存16。1.2.4 色谱条件 色谱分析采用梯度洗脱,流动相 A 由80%甲醇和20%10 mmol/L 的醋酸铵水溶液组成,流动相 B 由50%异丙醇和50%甲醇组成。梯度洗脱:70%A(0 5 min),70%0%A(5 15 min),0%A(15 45 min),0%70%A(45 47 min),70%A(47 60 min)。流速0.8 mL/min,进样量10 L,柱温为(30 1)。1.2.5 检测波长的确定 通过二极管阵列检测器(DAD)在波长 250 800 nm 范围内对色素进行光谱扫描,根据各色素的特征吸收确定其检测波长。1.2.6 方法学验证1.2.6.1 标准曲线、检出限和定量限 取各色素标准品储备液适量,按一定比例混合均匀,然后逐级稀释,配制成一系列不同质量浓度的标准品溶液,按照 1.2.4 节色谱条件进样分析。以进样的质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,建立回归方程,确定线性范围。将各标准品储备液稀释成很低的质量浓度后进样,分别以 3 倍和 10 倍信噪比(S/N)测得检出限(LOD)和定量限(LOQ)。1.2.6.2 精密度试验 取 1.2.6.1 节配置好的混合标准品溶液,重复进样 5 次,记录各色素的峰面积,通过计算各组分峰面积的相对标准偏差(RSD),考察精密度。1.2.6.3 重复性试验 取同一银杏叶样品,平行制备 6 份提取液,分别进样,记录各色素峰面积,计算各色素质量分数,通过计算各色素质量分数的 RSD,考察重复性。1.2.6.4 稳定性试验 将同一样品溶液避光 4 储存在冰箱内,分别于制备后 0、2、4、8、12 和 24 h进样,计算各组分峰面积的 RSD,考察稳定性。1.2.6.5 加样回收率试验 取同一银杏叶样品,平行制备 9 份提取液,每份 4 mL,精密加入 1.2.6.1节配制的混合标准品溶液 0.5、1.0 和 1.5 mL 各 3 份,制备成相应的溶液并分别进样,记录各色素峰面积,测定添加前后样品溶液中各色素质量分数,计算各成分回收率和 RSD。1.3 不同月份银杏叶色素含量变化规律分析取 4 11 月份采摘的银杏鲜叶,于液氮中磨成粉末,然后用 DSH 水分快速测定仪测定含水量。称取 4 g 粉末,加入-20 预冷的丙酮 20 mL,超声波辅助提取 10 min,共提取 3 次,合并提取液,然后离心10 min(转速为12 000 r/min,温度为4),取2 mL 上清液,过0.45 m 有机膜,按照1.2.4 节色谱条件进样分析各色素含量。1.4 干燥方式对银杏叶色素含量的影响分析取 6 月份采摘的银杏叶平铺于托盘内,每片银杏叶之间应有间隙,采用减压干燥(-100 kPa)、常压干燥(101 kPa)、冷冻干燥、杀青处理后减压干燥(-100 kPa)、晒干和阴干等干燥方式进行处理,具体条件及其样品见表 1。表 1 不同干燥方式处理后的银杏叶样品Table 1 G.biloba leaves sample processed by different drying methods编号No.干燥方式1)drying methods压强/kPapressure温度/temperature时间/htimeS1-10040 6S2减压干燥vacuum drying-100604S3-100802S4-100100192 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷续表 1编号No.干燥方式1)drying methods压强/kPapressure温度/temperature时间/htimeS5 4012S6常压干燥atmospheric drying604S7802S81001S9冷冻干燥 freeze drying-5024S10杀青减压干燥blanching vacuum drying-100604S11晒干 sun drying25-3512S12阴干 shade drying25-301201):先经 100 沸水杀青 60 s boiling water at 100 for 60 s根据 2020 年版中国药典(四部)通则“0832 水分测定法”第二法(烘干法)检测不同干燥方式下银杏叶的含水量,当含水量为(5 1)%时停止干燥19。取 S1 S12 银杏叶样品用粉碎机磨成粉末,过筛(孔径0.18 mm)。银杏叶粉末按料液比120(gmL),丙酮超声波辅助提取10 min,提取3 次,合并提取液,然后 12 000 r/min 下离心 10 min,取 2 mL 上清液,过 0.45 m 有机膜,按照 1.2.4 节色谱条件进样分析各色素含量。2 结果与讨论2.1 检测波长的确定9 种银杏叶色素的紫外吸收光谱如图 1 所示。由图 1 可知,叶绿素类化合物在 409 464 nm(S 区)图 1 9 种色素紫外光扫描图谱Fig.1 Ultraviolet spectra of nine kinds of pigments和 650 665 nm(Q 区)之间都有最大吸收,而大部分叶绿素化合物在 S 区的吸收比 Q 区的吸收强,因此选择 S 区的最大吸收波长作为叶绿素化合物的检测波长能够有效提高灵敏度。叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素在445 和473 nm 附近有最大吸收,由于在 445 nm 处叶黄素和叶绿素光谱吸收容易互相干扰,因此选择 409 nm 作为脱镁叶绿素 a 和脱镁叶绿酸盐 a 的检测波长,431 nm 作为叶绿素 a 和脱植基叶绿素 a 的检测波长,437 nm 作为脱镁叶绿素 b 的检测波长,464 nm 作为叶绿素 b 的检测波长,473 nm 作为叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素的检测波长。2.2 方法学验证2.2.1 线性关系、检出限和定量限 回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限分析结果见表 2。表 2 各成分的线性关系、检出限和定量限Table 2 Linear relationships,LODs,LOQs of various constituents序号No.组分component回归方程regression equation相关系数correlationcoefficient线性范围/(mg L-1)linear range检出限/(mg L-1)LOD定量限/(mg L-1)LOQ1叶绿素 achlorophyll aY=73 697X+90 1790.999 24.688-750.1560.4682脱镁叶绿素 apheophytin aY=125 106X+78 0170.999 42.5-400.1330.400第 2 期沈 红,等:HPLC-DAD 法分析不同月份和干燥方式下银杏叶色素含量的变化规律93 续表 2序号No.组分component回归方程regression equation相关系数correlationcoefficient线性范围/(mg L-1)linear range检出限/(mg L-1)LOD定量限/(mg L-1)LOQ3脱植基叶绿素 achlorophyllide aY=69 897X+20 1030.999 20.625-100.0420.1254脱镁叶绿酸盐 apheophorbide aY=110 345X+1 2820.999 61.563-250.0520.1565叶绿素 bchlorophyll bY=114 304X+89 7820.999 41.563-250.0520.1566脱镁叶绿素 bpheophytin bY=170 481X+4 8660.999 91.25-200.0420.1257叶黄素 luteinY=86 820X+10 1820.999 71.563-250.0520.1568-胡萝卜素-caroteneY=130 310X+10 6270.999 30.625-100.0420.1259-胡萝卜素-caroteneY=118 310X+10 6270.999 80.625-100.0680.246 由表 2 可知,所有线性方程的相关系数都在 0.999 2 以上,表明 9 种银杏叶色素在所测浓度范围内进样质量浓度(X)与峰面积(Y)呈良好的线性关系;此外,LOD 范围为0.042 0.068 mg/L,LOQ 范围为0.125 0.246 mg/L,说明 HPLC-DAD 是一种灵敏度高的检测方法。2.2.2 精密度 叶绿素 a、叶绿素 b、脱镁叶绿酸盐 a、脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿素 a、脱镁叶绿素 b、叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素峰面积的 RSD 分别为1.48%、1.82%、1.54%、2.09%、2.13%、2.41%、2.93%、1.62%和 1.24%,所有的 RSD 均小于 3%,表明仪器精密度良好。2.2.3 重复性 叶绿素 a、叶绿素 b、脱镁叶绿酸盐 a、脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿素 a、脱镁叶绿素 b、叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素平均质量分数的 RSD 分别为 1.68%、1.84%、1.54%、1.69%、1.73%、1.51%、1.93%、1.62%和 1.24%,所有的 RSD 均小于 2%,表明方法的重复性好。2.2.4 稳定性 叶绿素 a、叶绿素 b、脱镁叶绿酸盐 a、脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿素 a、脱镁叶绿素 b、叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素峰面积的 RSD 分别为 2.68%、2.14%、1.84%、1.79%、2.73%、2.54%、2.91%、1.82%和 1.64%,所有的 RSD 均小于 3%,表明样品溶液在 24 h 内稳定性良好。2.2.5 加样回收率 叶绿素 a、叶绿素 b、脱镁叶绿酸盐 a、脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿素 a、脱镁叶绿素b、叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素的平均回收率分别为 100.44%、100.16%、99.81%、98.45%、100.44%、101.76%、97.91%、99.11%和 98.45%,RSD 分别为 2.13%、2.44%、1.94%、2.71%、1.73%、2.64%、1.71%、2.42%和 1.64%,表明方法的准确度良好。2.3 不同月份银杏叶色素含量变化规律4 11 月银杏鲜叶中 8 种色素的含量结果见表 3。由表 3 可知,银杏叶的生长大致分为生长期(4月)、成熟期(5 7 月)、衰老期(8 10 月)和凋亡期(11 月)。生长期,银杏叶还未生长发育完全,叶绿素和-胡萝卜素随月份的增加含量逐渐升高;在银杏叶中脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿酸盐 a 和-胡萝卜素质量分数达到最高值,分别为(1 762 121)、(628 32)和(482 45)g/g;随着月份的增加其含量逐渐减少,从 7 月份开始脱植基叶绿素 a 未被检测到,10 月份开始脱镁叶绿酸盐 a 未被检测到,因此可将脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿酸盐 a 和-胡萝卜素这 3 种色素作为生长期银杏叶的特征色素。成熟期,银杏叶发育完全,叶绿素、叶黄素和-胡萝卜素的含量较高,5 月份叶绿素 a 和 b 的质量分数达到最高值,分别为(8 701 571)和(3 140 274)g/g;7 月份叶黄素和-胡萝卜素的质量分数达到最高值,分别为(2 057 104)和(349 25)g/g。根据银杏叶中色素种类和含量随月份的变化规律,若以叶绿素为目标产物,则推荐 5 月份为最佳采摘日期,若以叶黄素为目标产物,则推荐 7 月份为最佳采摘日期。衰老期,叶绿素和类胡萝卜素的含量都逐渐降低,而脱镁叶绿素 a 的含量逐渐增加,因此可将脱镁叶绿94 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷素 a 作为衰老期银杏叶的特征色素。凋亡期,银杏开始落叶,叶绿素和类胡萝卜素含量都快速降低,但叶绿素的降解速度明显高于类胡萝卜素,11 月份类胡萝卜素占色素总量的比例高达 57.56%,而叶绿素占色素总量的 36.79%,这是银杏叶由绿变黄的原因之一。表 3 不同月份银杏叶色素质量分数Table 3 Pigments mass fraction of G.biloba leaves in different monthsg/g月份month脱植基叶绿素 achlorophyllide a脱镁叶绿酸盐 apheophorbide a叶绿素 bchlorophyll b叶绿素 achlorophyll a脱镁叶绿素 apheophytin a叶黄素lutein-胡萝卜素-carotene-胡萝卜素-carotene4 月 Apr.1 762 121628 321 745 1413 875 315725 43872 4956 5482 455 月 May616 37509 413 140 2748 701 571474 261 201 68272 39336 216 月 June410 26352 172 904 1577 958 446479 451 251 101331 27328 117 月 July168 852 231 1525 528 321484 432 057 104349 25315 278 月 Aug.159 121 696 1543 974 378486 41865 83332 31314 329 月 Sep.147 121 025 1012 303 231562 54553 53132 12222 2110 月 Oct.1 005 982 194 212803 78467 4386 7218 2011 月 Nov.109 9217 2150 4364 3455 491 82.4 聚类分析银杏叶干燥方式对色素含量的影响不同干燥方式处理后银杏叶中色素含量结果见表 4。表 4 不同干燥方式处理后银杏叶中色素质量分数Table 4 Pigments mass fraction of G.biloba leaves processed by different drying methodsg/g编号No.脱植基叶绿素 achlorophyllide a脱镁叶绿酸盐 apheophorbide a叶绿素 bchlorophyll b叶绿素 achlorophyll a脱镁叶绿素 bpheophytin b脱镁叶绿素 apheophytin a叶黄素lutein-胡萝卜素-carotene-胡萝卜素-caroteneS1120 11305 292 840 2817 010 689216 232 120 2131 256 126319 30312 31S2287 271 025 1011 165 1121 944 1916 074 603898 87263 25250 23S3283 281 175 1151 014 1041 374 1326 207 621685 69256 25269 26S4189 19501 46426 43848 793 335 321278 28113 12124 13S598 8301 282 645 2616 819 687126 122 111 2091 056 106301 32309 31S6293 271 037 1011 342 1321 968 1876 203 632924 93283 27282 27S7280 261 165 1121 004 981 270 1246 107 613585 57205 21224 23S8180 15478 34435 42809 783 039 301250 2697 1176 8S9280 23330 322 904 2788 012 802479 481 253 123330 32319 32S1075 62 020 2016 068 609703 7155 563 6S11273 251 236 1211 345 1321 975 1786 009 589889 89270 28265 27S12295 271 624 153 300 3311 567 1544 045 4081 114 113295 30281 27 采用 SPSS 26.0 统计软件对表 4 中数据进行处理,以 9 种银杏叶色素的含量为指标,采用组间链接和平方欧式距离对 12 种干燥方式进行聚类分析20-21,结果见图 2。当临界值为 4 5 时,12 种不同干燥方式下银杏叶样品可以分为 A D 4 类。A 类:包括 S1(40 减压干燥 6 h)、S5(40 常压干燥 12 h)、S9(-50 冷冻干燥 24 h)。A 类的干燥温度较低,色素类化合物中叶绿素类化合物(脱植基叶绿素 a、叶绿素 a 和叶绿素 b)为主要色素,占色素总量的 70.28%80.40%之间;而脱镁叶绿素类化合物(脱镁叶绿酸盐 a、脱镁叶绿素 a、脱镁叶绿素 b)含量较低,占色素总量的 5.95%18.86%之间;类胡萝卜素(叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素)占色素总量的 12.10%16.19%。S1、S5 和 S9 的色素质量分数在 13 457 14 185 g/g 之间,高于其他 3 类干燥方式。当临界值为 2 3 时,A 组中的 S9 聚为一小类,S1 和 S5 聚为另一小类,S9 样品和银杏鲜叶中的色素组成和含量基本一致(表 3 中 5 月份),叶绿素结构得到了很好的保护,基本没有叶绿素类化合物转化为脱镁叶绿素类化合物。B 类:S12(25 30 下在通风干燥的室内晾 120 h)。B 类的干燥温度较低,干燥时间较长,叶绿素类化合物质量分数降低,约占色素总量的 39.33%,而脱镁叶绿素类化合物含量升高,约占色素总量的第 2 期沈 红,等:HPLC-DAD 法分析不同月份和干燥方式下银杏叶色素含量的变化规律95 图 2 不同干燥方式样品的聚类分析Fig.2 Agglomeration analysis of samples processedby different drying methods47.18%,色素质量分数降低至(12 521 121)g/g。C 类:包括 S3(80 减压干燥 2 h)、S7(80 常压干燥 2 h)、S2(60 减压干燥 4 h)和 S6(60 常压干燥 4 h)、S11(25 35 下晾晒 12 h)和 S10(100 沸水杀青60 s,然后60 减压干燥4 h)。脱镁叶绿素类化合物为主要色素,质量分数在 7 657 8 464 g/g之间,占色素总量的 67.34%90.86%;叶绿素类化合物质量分数明显降低,在 0 2 581 g/g之间,占色素总量的 0%21.05%;类胡萝卜素质量分数降低,在821 1 424 g/g 之间。当临界值为1.4 2.4 时,C 类中的 S10 聚为一小类,其他干燥方式聚为另一小类。杀青后的银杏叶中未检测到叶绿素类化合物且色素总量较低,表明杀青处理能够有效促进色素的降解。D 类:包括 S4(100 减压干燥 1 h)和 S8(100 常压干燥 1 h)。D 类干燥温度较高,脱镁叶绿素类化合物为主要色素,占色素总量的 75.09%75.21%;色素质量分数明显低于其他 3 类,在 5 364 5 813 g/g之间,色素被大量降解,表明高温能够有效破坏色素化合物的结构,促进银杏叶色素的降解。2.5 TOPSIS 法分析干燥方式对色素含量的影响逼近理想值排序(TOPSIS)法是根据有限个评价对象与理想化目标的接近程度进行排序的方法。采用文献报道的方法22,先对表 4 数据进行归一化处理,然后采用 SPSSAU 软件确定正理想解距离(D+)和负理想解距离(D-),最后计算得到相对接近度(Ci)。Ci在 0 1 之间,Ci越接近于 0,表明 Ci越接近最劣水平,Ci越接近于 1,表明 Ci越接近最优水平,TOPSIS 评价结果见表 5。表 5 银杏叶样品的 TOPSIS 综合评价结果Table 5 TOPSIS comprehensive evaluation results of G.biloba leaves samples编号No.正理想解距离positive ideal solutiondistance(D+)负理想解距离negative ideal solutiondistance(D-)相对接近度relative proximity(Ci)排序结果ranking resultsS10.6810.9720.5882S21.0800.6920.3907S31.0970.6190.3618S41.2470.2990.19411S50.7460.8900.5443S61.0720.7150.4005S71.1130.5680.3389S81.2640.2710.17612S90.5471.2980.7041S101.2680.5610.30710S111.0640.7050.3996S120.9900.7160.4204 由表5 可知,排名前5 的依次为 S9(-50 冷冻干燥24 h)、S1(40 减压干燥6 h)、S5(40 常压干燥 12 h)、S12(25 30 下在通风干燥的室内晾 120 h)、S6(60 常压干燥 4 h)。可以看出,冷冻干燥效果最好,叶绿素类化合物结构得到很好的保护,基本没有发生脱镁反应产生脱镁叶绿素类化合物,但对设备要求高,该法适用于科学研究中使用,而不适用于工业化生产色素;40 减压干燥的干燥速度较快,虽然有部分叶绿素类化合物转化为脱镁叶绿素,但该干燥方式没有彻底破坏色素化合物结构,色96 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷素总量和鲜叶基本一致;40 常压干燥的色素组成和色素含量与 40 减压干燥基本一致,但干燥时间比 40 减压干燥长;阴干(S12)有部分叶绿素化合物转化成脱镁叶绿素,且色素总量降低,耗时长,在干燥过程中容易发生霉变导致银杏叶腐烂变质;60 常压干燥的干燥速度快,效率高,但色素总量大幅度降低。综合考虑以上几种干燥方式,40 减压干燥为工业生产中的最佳干燥方式,干燥速度较快,且色素得到有效保护。在本研究中,经过加热干燥处理后的银杏叶有大量的脱镁叶绿素产生,叶绿素的脱镁反应是热处理过程中的主要反应。银杏叶中叶绿素脱镁反应的发生主要有 2 个原因:一是与叶绿素的结构有关,研究表明,叶绿素在加热过程中按一级动力学转化为脱镁叶绿素,镁和氢交换在能量上是有利的,脱镁叶绿素的稳定性优于叶绿素13;另一个原因是与银杏叶中组织细胞的结构有关,加热能够破坏细胞结构,导致细胞内的有机酸释放出来,叶绿素被酸性物质包围,从而促进脱镁反应。当温度过高时,不管是叶绿素还是脱镁叶绿素结构都被彻底破坏,表明银杏叶色素类化合物为热敏性化合物,在干燥过程中应注意温度的控制。3 结 论3.1 建立了银杏叶色素含量测定的 HPLC-DAD 方法,方法学验证结果表明:所建立的 HPLC-DAD 方法的线性关系良好、灵敏度高、重复性好、准确度高,是一种可靠的银杏叶色素含量分析方法。3.2 不同月份银杏鲜叶中色素含量存在明显差异,脱植基叶绿素 a、脱镁叶绿酸盐 a 和-胡萝卜素在 4月份达到最高