sICOS和sPD-1在H...及宫颈癌中的表达及临床意义_孙珍.pdf

J Med Theor PracVol.36，No.8，Apr20232023年第36卷第8期医学理论与实践sICOS 和 sPD-1 在 H-HPV 感染、CIN 及宫颈癌中的表达及临床意义*基金项目:深圳市宝安区医疗卫生基础研究项目(2019JD328)。通信作者:孙珍孙珍郭夏娜宝安中医院(集团)检验科，广东省深圳市518100摘要目的:目的:探讨可溶性共刺激分子(sICOS)和可溶性程序性死亡蛋白 1(sPD-1)在 H-HPV 感染、CIN 及宫颈癌间的表达差异及临床意义。方法:方法:将 240 例高危型人乳头状瘤病毒(H-HPV)感染患者分为 H-HPV 感染组 80 例、CIN组 80 例、宫颈癌组 80 例，同时选取 80 例健康体检者作为对照组，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测各组外周血中 sPD-1、sICOS 的表达情况，并应用 SPSS26.0 软件进行统计学分析。结果:结果:与健康对照组相比，CIN 组、宫颈癌组的 sPD-1 表达水平均升高，差异具有统计学意义(P 0 01)，而 H-HPV 感染组与健康组血清中 sPD-1 表达水平的差异无统计学意义(P 0 05);与健康对照组相比，各病例组血清中 sICOS 水平均升高，较健康对照组差异具有统计学意义(P 0 01)，但 H-HPV 感染组与 CIN 组血清中 sICOS 表达水平的差异无统计学意义(P 0 05);研究对象的血清中 sICOS 和 sPD-1 呈正相关关系(r=0 755，P 0 01)，其中 H-HPV 组、CIN 组、宫颈癌组的 sICOS 和 sPD-1 间均有显著的正相关关系(P 0 01)，而健康组的 sICOS 和 sPD-1 无相关关系(P 0 05);OC 分析 sPD-1、sICOS 对 H-HPV、CIN、宫颈癌的鉴别效能，AUC 分别为 0 852 0、0 836 4。结论:结论:在 H-HPV 感染后的免疫中，sPD-1 和 sICOS 存在上调表达，且 H-HPV 组、CIN 组及宫颈癌组的 sICOS 与 sPD-1 的正相关关系显著，提示可能存在协同刺激，促进病原的免疫逃逸，影响疾病的发生发展。关键词sPD-1sICOSH-HPV 感染CIN宫颈癌中图分类号:737.33文献标识码:Adoi:10.19381/j.issn.1001-7585.2023.08.004The Expression and Significance of sICOS/sPD-1 among the H-HPV Infection and CIN and Cervical CancerSUN Zhen，GUO Xia na Department of Clinical Laboratory，Baoan Traditonal Chinese Medicine Hospital Group，ShenzhenCity，Guangdong Province518100ABSTACT Objective:To investigate the expression differences and clinical significance of soluble molecule programmeddeath 1(sPD-1)and soluble inducible costimulator(sICOS)among H-HPV infection，CIN and cervical cancer Methods:240 patients with high-risk human papilloma virus(H-HPV)infection were divided into three case groups:80 patients withH-HPV infection and no cervical lesions(H-HPV infection group)，80 patients with cervical intraep-ithelial neoplasia(CIN)and existing or past H-HPV infection(CIN group)，80 patients with cervical cancer and existing or past H-HPVinfection(cervical cancer group)，80 healthy people were selected as the control group The expressions of sPD-1 and sICOSwas detected by enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA)SPSS26 0 software was used for statistical analysis esults:Compared with healthy control group，the expression level of SPD-1 in CIN group and cervical cancer group were increased，the difference was statistically significant(P 0 01)，but there was no significant difference in serum expression betweenH-HPV infection group and healthy group(P 0 05)Compared with the healthy control group，the expression level of sI-COS in case groups were increased，and the difference were statistically significant(P 0 01)，but there was no significantdifference in the expression between H-HPV infection group and CIN group(P 0 05)There was a moderate positive cor-relation between sICOS and SPD-1 in the serum of the subjects(r=0 755，P 0 01).It was a significant correlation betweensICOS and sPD-1 in H-HPV group，CIN group and cervical cancer group(P 0 01)，but no correlation between sICOS andsPD-1 in the healthy group(P 0 05)Conclusion:In the immunity after H-HPV infection，the expression of sPD-1 andsICOS is up-regulated，and the correlation between sICOS and sPD-1 in H-HPV group，CIN group and cervical cancer groupis significant.It is suggested that there may be synergistic stimulation to promote the immune escape of pathogens，so as to af-fect the occurrence and development of diseasesKEY WODSsPD-1sICOSH-HPV infectionCINCervical cancer在全球女性恶性肿瘤排名中，宫颈癌仅次于乳腺癌位居第二，严重威胁女性的生命健康，且发病人2721医学理论与实践2023年第36卷第8期Vol.36，No.8，Apr2023J Med Theor Prac群年龄具有不断年轻化的趋势。目前已证实高危型人乳头状瘤病毒(High risk Human papilloma virus，H-HPV)感染是导致宫颈上皮内病变(Cervical in-traep-ithelial neoplasia，CIN)及宫颈癌发生的主要危险因素1。人体正常的免疫系统大多可以清除 H-HPV 的感染，但仍有部分女性因病毒的持续感染而导致疾病进展，甚至最终发展成为宫颈癌。多数研究认为 H-HPV 的感染或发生发展为宫颈上皮内病变(CIN)乃至宫颈癌均与免疫缺陷有着密切联系，尤其与细胞免疫显著相关。诱导性共刺激分子(Inducible co-stimulator，ICOS)和程序性死亡受体 1(Programmed death-1，PD-1)主要调控表达于 T 淋巴细胞而发挥效应，与细胞免疫功能关系密切，从而影响感染、炎症、肿瘤及自身免疫性疾病等的发生发展。共刺激分子，不论是受体或配体，都存在膜型和可溶性两种形式，表达于细胞膜上和分泌于体液中，均参与了共刺激信号的介导和自身调节2。目前，有关 ICOS 和 PD-1 在宫颈疾病患者外周血中的表达变化未见报道，本研究旨在探讨可溶性共刺激分子(sICOS、sPD-1)在 H-HPV 感染、CIN 及宫颈癌患者中的表达和临床意义，尝试寻找新的血液学筛查指标，为宫颈疾病诊疗及预后提供新的研究方向。1资料与方法1 1一般资料选取医院 2020 年 3 月2021 年 9月收治的 240 例 H-HPV 感染患者，根据临床检验及病理报告差异分为 3 个病例组:其中 H-HPV 感染且无宫颈病变患者(简称为 H-HPV 感染组)80例，年龄(46 93 14 03)岁;CIN 且存在或既往存在H-HPV 感染患者(简称为 CIN 组)80 例，年龄(46.01 12 91)岁;宫颈癌且存在或既往存在 H-HPV 感 染 患 者(简 称 为 宫 颈 癌 组)80 例，年 龄(49.61 10 34)岁。纳入标准:患者年龄均 18岁;检验及病理检查报告等临床资料完整。排除标准:合并肿瘤、感染或自身免疫性疾病的患者;合并有机体多器官严重功能障碍的患者;处于妊娠或哺乳期的患者;对本次研究不配合的患者。另选取 80例健康体检者作为健康对照组，年龄(46 08 12.57)岁，多次检测 HPV 阴性且排除宫颈病变。各组间的年龄比较差异无统计学意义(P 0.05)。所有受试者均对本研究知情，并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。1 2样本处理收集所有受试者的外周血，将全部样本经 3 000r/min 离心 15min，吸取上层血清至1.5ml EP 管中分装保存并做好标记，冻存于 80冰箱中，检测前需将血清样品放置室温溶解并混匀。1 3sICOS 与 sPD-1 水平的检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测健康对照组、H-HPV 感染组、CIN 组、宫颈癌组血清中 sICOS 和 sPD-1 水平，试剂盒均购自武汉云克隆科技股份有限公司，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。空白调零后，使用酶标仪(Thermo 公司)在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算血清样本中 sPD-1和 sICOS 的含量。1 4统计学方法采用 SPSS26 0 软件对所得数据进行统计学分析，先进行正态性和方差齐性检验，正态分布用(x s)表示，非正态分布用中位数(四分位数)表示，各组间比较采用 Kruskal-Wallis 检验，两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验，相关性分析采用 Spearman rank 相关分析，相关系数 r 的取值范围为1，+1，以 P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1各病例组与健康对照组血清中 sPD-1 的表达水平ELISA 检测 H-HPV 感染组、CIN 组、宫颈癌组及健康对照组的 sPD-1 水平，结果分别为 2 20(1 74 2 90)ng/ml、5 27(4 32 6 91)ng/ml、9.60(8 44 12 25)ng/ml、2 15(1 37 2 72)ng/ml。结果显示，与健康对照组相比，CIN 组、宫颈癌组的 sPD-1 表达水平均升高，差异有统计学意义(P0 01)，而 H-HPV 感染组与健康组血清中 sPD-1表达水平差异无统计学意义(P=0 172)，见图 1。图 1各组 sPD-1 表达水平比较2 2各病例组与健康对照组血清中 sICOS 的表达水平ELISA 检测 H-HPV 感染组、CIN 组、宫颈癌组及健康对照组的 sICOS 水平，结果分别为 421 50(394 25 499 75)pg/ml、547(405 50 694 75)pg/ml、1 039.50(941 25 1 201 75)pg/ml、381(282 424 75)pg/ml。结果显示，与健康对照组相比，各病例组血清中 sICOS 表达水平均升高，差异有统计学意义(P 0.01)，但 H-HPV 感染组与 CIN组血清中 sICOS 表达水平的差异无统计学意义(P=0 108)，见图 2。2 3血清中 sICOS 与 sPD-1 表达水平的相关性分析通过试验结果可见，sICOS 和 sPD-1 在 H-HPV感染组、CIN 组、宫颈癌组患者的血清中表达均升高，经过 Spearman rank 相关性分析，发现 sICOS 和sPD-1 存在正相关关系(r=0 755，P 0 01，见图3a)，其中 H-HPV 感染组、CIN 组、宫颈癌组的 sI-COS 和 sPD-1 相关关系显著(P 0 01，见图 3b d)，健康组的 sICOS 和 sPD-1 无相关关系(P 0.05，见图 3e)。3721J Med Theor PracVol.36，No.8，Apr20232023年第36卷第8期医学理论与实践图 2各组血清 sICOS 表达水平比较图 3sPD-1 与 sICOS 的相关性分析a 全部研究对象血清中 sPD-1 与 sICOS 的分布关系bH-HPV 组血清中 sPD-1 与 sICOS 的相关关系c CIN 组血清中 sPD-1 与 sICOS 的相关关系d 宫颈癌组血清中sPD-1 与 sICOS 的相关关系e 健康组血清中 sPD-1 与sICOS 的相关关系2 4sPD-1、sICOS 对 H-HPV、CIN、宫颈癌的鉴别分析采用 OC 曲线分析外周血中 sPD-1、sICOS对 H-HPV、CIN、宫颈癌的鉴别效能，sPD-1 曲线下面积(AUC)为 0 852 0(95%CI:0 811 9 0 892 2)，界值为 62 50%，敏感度与特异度分别为63.75%、98 75%;sICOS 的 AUC 为 0 836 4(95%CI:0 7897 0 883 0)，界值为 52 08%，敏感度与特异度分别为 69 58%、82 50%，见图 4。图 4sPD-1、sICOS 对 H-HPV、CIN、宫颈癌的鉴别分析3讨论可诱导共刺激分子(Inducible co-stimulator mol-ecule，ICOS)和程序性死亡受体 1(Programmeddeath 1，PD-1)在调节细胞免疫反应信号中的重要作用相继被证实3，ICOS、PD-1 在肿瘤、感染以及自身免疫性疾病中均有异常表达，可能也与机体的免疫应答有关。已有研究表明，在正常人体的血浆和血清中，存在着各类可溶性形式的共刺激分子，表达水平较低，但当机体处于疾病状态时，可溶性共刺激分子的水平会发生明显变化4-5。ICOS 在 T 细胞增殖和活化中，在 Th1、Th2 效应细胞发挥作用的过程中以及在 T/B 细胞协同作用、抗体产生和类型转换中，均发挥着至关重要的作用6。另有研究发现 CD4+ICOS+细胞能够分泌 IL-4 和 IL-10，还可诱导 CD4+、CD25+、Foxp3+调节性 T细胞产生，抑制活化 T 细胞的功能7，提示 ICOS 具有正负双向免疫调控作用。Amatore F 等8 研究发现 ICOS 在肿瘤发生、发展中具有双重作用，其既可参与抗肿瘤 T 细胞免疫应答，又可通过调节性 T 细胞的免疫抑制活性发挥促肿瘤效应。另有研究显示ICOS 在胃癌、肝细胞癌等肿瘤组织中高表达，且其表达水平可能影响患者预后情况，提示 ICOS 可作为抗肿瘤治疗的潜在靶点及新的预后免疫标志物9-10。在本研究中发现，与正常对照组比较，sI-COS 在 H-HPV 感染组、CIN 组、宫颈癌组患者的血清中表达均升高，而且 CIN 及宫颈癌患者的 sICOS表达水平明显增高，说明 ICOS 表达水平与疾病严重程度较一致，呈负性调节免疫的作用，抑制 T 细胞的活化和增值，导致 T 细胞功能减弱、无能或者凋亡;但在 H-HPV 感染组、CIN 组的 ICOS 水平无显著差异，提示 ICOS 可能会通过调控 Th 亚群的正向免疫应答，促进 T 淋巴细胞增殖、分化为效应 T细胞，起到抑制疾病发展的作用，与以往研究结果部分符合。PD-1 是 T 细胞表面的负性共刺激信号，主要通过抑制 T 细胞的活化与増殖和细胞因子在肿瘤免疫逃逸和免疫耐受中发挥重要作用11，与细胞免疫功能关系密切。张宋安等12 的研究显示宫颈鳞癌患者外周血 PD-1、组织 PD-L1 表达与肿瘤的分级、预后有关。韩丽萍等13 研究表明 PD-1 和 PD-L1 在正常宫颈、宫颈 CIN 及宫颈癌组织中的表达逐渐升4721医学理论与实践2023年第36卷第8期Vol.36，No.8，Apr2023J Med Theor Prac高，可能是 PD-L1 与 PD-1 结合后抑制了间质中淋巴细胞的功能及活性，从而促进了肿瘤发生发展，而且 PD-L1 和 PD-1 在、期宫颈癌组织中的表达较、期宫颈癌组织高，提示 PD-1/PD-L1 通路在肿瘤的发生发展、浸润及转移中的重要作用。杨雯等14 研究发现 PD-1 和 PD-L1 表达升高与宫颈 HPV阳性、CIN 级别升高和肿瘤转移呈正相关，PD-1 和PD-L1 表达水平可以作为 CIN 和宫颈癌临床预后指标。与上述研究结果类似，本研究中 CIN 组、宫颈癌组的 sPD-1 表达水平明显高于健康对照组，而H-HPV 感染组与健康组血清中表达差异无统计学意义，提示 PD-1 信号通路被激活并参与了宫颈细胞的负性免疫调节，抑制 T 淋巴细胞增殖、活化，降低细胞免疫应答及免疫清除能力，导致机体对病毒感染细胞的免疫耐受或无应答，与 CIN 和宫颈癌的免疫逃逸及肿瘤进展密切相关，与上述研究结果较为一致。本研究采用 OC 分析 sPD-1、sICOS 对 H-HPV、CIN、宫颈癌的鉴别效能，AUC 分别为0 852 0、0 836 4，提示 sPD-1、sICOS 具有较好鉴别 H-HPV、CIN、宫颈癌的价值，对于宫颈疾病的病情监测、临床治疗具有重要的临床意义。综上所述，本实验首次对女性宫颈疾病患者的外周血中 sPD-1 和 sICOS 表达水平进行探索，发现在 HPV 相关感染免疫中，sPD-1 和 sICOS 均存在上调表达，可能促进病原的免疫逃逸，但 sICOS、sPD-1在感染性疾病中对细胞免疫究竟是双向调节表达，还是协同刺激，其免疫应答调控机制尚未完全阐明，仍有待深入研究和探索，为宫颈疾病的筛查及诊疗提供新思路。参考文献 1刘智 武汉市宫颈癌及癌前病变患者 HPV 感染情况分析J 中国妇幼保健，2017，32(20):4973-4976 2曹雪涛 免疫学前沿进展M 第 3 版 北京:人民卫生出版社，2014:482-484 3Coyle AJ，Gutierrez-amos JC The role of ICOS and othercostimu-latory molecules in allergy and asthma J SpringerSemin Immun，2004，25(3-4):349-359 4Atesoglu EB，Tarkun P，Demirsory ET，et al Solubleprogrammeddeath 1(PD-1)isdecreased in patients withimmune thrombocyto-penia(ITP):potential involvement of PD-1 pathway in ITP im-munopathogenesis J Clin Appl Thromb Hemost，2014 5Liu C，Jiang J，Gao L，et al Soluble PD-1 aggravates progression ofcollagen-inducedarthritis through Th1 and Th17 pathwaysJ Ar-thritis es Ther，2015，25(17):340 6樊超，陈宏翔 白塞病患者外周血 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