发酵酿造工艺实验讲义模板.doc

第六部分 发酵、酿造工艺试验第一篇 发酵工程设备发酵工程设备试验项目及其各专业必修、选修表试验序号试验项目试验课时试验类型试验类别面 向 专 业（以下打“”为必修，“”为选修，数字为开课学期）生 科生 技生 工食 品 1小型生物反应器安装和拆卸2验证(6） (5） 2小型连续培养试验装置设计组建3综合(6）(5）3体积溶氧传输系数测定3综合(6）(5）4摇床培养确定酵母菌体培养条件8综合(6）(5）5反应器培养液灭菌和接种培养8综合(7） 6pH电极、溶氧电极校正2验证(7）7生物制品冷冻干燥6综合(7）83M3 机械搅拌通风发酵罐结构认识4验证(7）91M3 中试发酵设备操作方法12综合(7） 10面包酵母流加培养和分批培养试验24综合(7）学 时 合 计727216第二篇 酿造工艺学试验酿造工艺学试验项目及其各专业必修、选修表试验序号试验项目试验课时试验类型试验类别面 向 专 业（以下打“”为必修，“”为选修，数字为开课学期）生 科生 技生 工食 品 1葡萄酒酿造过程24/14综合(6） (4） 2葡萄酒结束理化指标测定8/0综合(6）(4）3葡萄酒感官品评4/2综合(6）(4）4乳酸发酵工艺10/8综合(6）(4）5醋酸发酵工艺10/8综合(6）(4）学 时 合 计56/325632第一篇 发酵工程设备试验一 小型生物反应器安装和拆卸机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是生物工程设备关键组成部分，在微生物工程、酶工程、细胞工程（细胞培养）、基因工程（基因工程菌）等科学研究领域，生物反应器均为生物技术转化为产品必需设备。因为小型生物反应器进料、出料、清洗、电极校正等过程全部不一样于大型发酵罐，需要拆卸以后进行，所以熟悉生物反应器结构及安装和拆卸操作是正确使用反应器前提。一、试验目标 掌握生物反应器安装和拆卸操作规程，认识和了解生物反应器结构和功效。二、基础原理生物反应器装置分两大部分：1.罐体及内部各传感器、检测电极；2.罐外检测控制装置，蒸汽及无菌空气系统。反应器罐体含有可卸上盖，和罐体是经过橡皮垫圈和螺栓密封。盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、多种检测仪表插孔、温度传感器及溶氧电极和pH电极插口、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；罐外：连接多种传感器及电极对应控制器，能够自动地调控试验所需培养条件；连接无菌空气系统，并配置一台自动调控装置；连接蒸汽发生器，供灭菌使用。三、试验装置3 L 园柱形机械搅拌式生物反应器尾气图1 机械通风式搅拌生物反应器四、试验步骤1. 首先断开全部电源。2. 卸下可移动全部检测电极和探头。3. 拧下螺栓，打开上盖，检验培养罐内部是否清洗洁净。4. 插入校正完成pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并和放大器连接。5. 加入配置好培养液，加盖（因为盖上零件较多，必需对准位置后再盖上去），并对称拧紧螺母，直至上盖被密封固定。6. 将事先清洗洁净并开启尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，和灭过菌无菌空气过滤器进气管等，剩下孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。7. 检验检测系统连接，调试密闭。8. 作出3 L机械通风搅拌式生物反应器结构示意图，注明各装置名称。9. 标注检测系统连接。五、思索题 1.小型生物反应器安装和拆卸应该注意那些问题？2. pH电极、溶氧电极怎样校正？试验二 小型连续培养试验装置设计组建连续培养是在培养器中不停补充新鲜营养物质，并立即不停地以一样速度排出培养物，理论上对数生长久可无限延长。不一样于分批培养发酵周期受培养基消耗殆尽影响，连续培养使微生物在特定环境中连续保持旺盛生长状态，伴随培养基不停加入，产物不停生成排出，降低了非发酵时间，可提升发酵工业生产效益和自动化水平。常见连续培养方法有恒浊法和恒化法两类，恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢规律方面被广泛采取。本试验设计组建试验室恒化法培养装置，有利于对恒化法连续培养及装置特征加深了解。一、试验目标 设计组建小型微生物连续发酵装置，掌握连续发酵操作原理和方法。二、试验原理 恒化法是经过控制培养基中营养物关键是生长限制因子浓度来调控微生物生长繁殖和代谢速度连续培养方法。因为培养基质加入流量和产物流出流量保持恒定，伴随培养时间推移，培养器中各物质浓度不随时间改变，称为恒化法，设计恒化器培养装置除满足液体深层培养所必需条件外，着重在于满足上述条件。三、试验仪器和材料 三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕动泵、橡胶管、磁力搅拌器、温度计、酒精喷灯四、试验步骤1. 用试验室仪器设计一套恒化法连续培养装置（厌氧培养），并组建安装。2. 画出你所组建简单连续培养装置示意图并注明各装置作用。3. 设计出求算单级连续培养比生长速率试验步骤及求算过程。五、思索题 1.在你组建装置中怎样实现培养器中基质浓度恒定？怎样确保培养过程无污染？2.连续发酵培养在工业生产和科研上意义？试验三 体积溶氧传输系数测定单位体积发酵液氧传输系数kLa可称为“通气效率”，不一样类型发酵罐因为供氧装置不一样其体积溶氧传输系数不一样，kLa大意味着反应器供给单位发酵液氧能力强。经过kLa测定，可了解发酵过程中氧传输效果好坏，对提升氧利用率和增产节能全部有着关键意义。一、 试验目标 学习利用亚硫酸盐法测定小型生物反应器kLa值。二、 基础原理 用Cu2+ 为催化剂，溶解在水中氧能立即将水中SO32-氧化成为SO42-，其氧化反应速度在很大范围内和SO32-浓度几乎无关。所以氧化速率是控制氧化反应原因。其反应式以下：2Na2SO3+ O2 2Na2SO4剩下Na2SO3和过量碘作用Na2SO3+I2+H2O Na2SO4+2HI剩下I2用标定Na2S2O3溶液滴定。标准Na2S2O3溶液用量取决于溶解氧量。每1 ml溶氧可氧化2 mol Na2SO3，也就消耗掉4 mol Na2S2O3。所以每消耗1 mol Na2S2O3（和对比样体积差）必有1/4 mol溶氧在通氧过程中参与反应。 则：溶氧当量Nv=KLa（c*-c）KLa= Nv/0.21三、 试验仪器和材料 3 L生物反应器、250 ml三角瓶、25 ml移液管、滴定台、滴定管、Na2SO3 、CuSO4、碘溶液、Na2S2O3四、试验方法和步骤1. 称取12.6 g Na2SO3和0.072 g CuSO4。按试验一方法打开发酵罐，将1 L自来水加入到发酵罐中，开始搅拌，依次加入Na2SO3晶体和CuSO4，搅拌使完全溶解。取样10 ml，作为未通气对照组，注入预先准备好过量碘溶液中。2. 安装好发酵罐，检验使密闭。开阀通气，打开搅拌器到常见转速。气阀开启快速调至预定空气流量。当罐内溶液中有气泡冒出时，开始计时，作为通氧时间开始。3 .氧化时间连续10-20 min，到预定时间停止通气和搅拌，正确统计通氧时间。 4. 取样10 ml作为样液，注入预先准备好过量和对照组所注入相同量碘溶液中。5. 在对照组和样液中分别加入淀粉溶液3滴作为指示剂，分别用标定Na2S2O3溶液滴定，至碘溶液中蓝色消失。6. 分别统计对照组和样液滴定所消耗Na2S2O3溶液量。五、试验结果滴定前读数滴定后读数滴定消耗量V对照液滴定V1=样液滴定V2=六、思索题 1.kLa大小受哪些原因影响？2.测定kLa值其它方法有哪些？试验四 摇床培养确定酵母菌体培养条件正交试验(Orthogonal experimental)是研究多原因多水平试验方法，它是依据正交性从全方面试验中挑选出部分有代表性点进行试验，这些有代表性点含有了“均匀分散，齐整可比”特点，是一个高效率、快速、经济试验设计方法，可大幅度降低试验工作量，所以正交试验在很多领域研究中已经得到广泛应用。本试验即是利用正交试验方法选择酵母最好培养基以掌握正交试验方法。一、试验目标 经过摇瓶法确定发酵周期，学习应用正交法确定发酵培养基最好配比。二、试验原理 1.培养周期确实定。生物量测定方法有比浊法和直接称重法等。因为酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液状态存在，可采取直接比浊法进行测定。摇瓶培养中经过定时取样测定酵母浓度，找出对数生长末期确定为培养终点。2.最好培养基确实定。在碳源、氮源、无机盐初步确定前提下，经过四原因三水平正交试验，可判定四原因组合时各原因最好浓度，从而确定最好培养基。三、试验仪器和材料 1. 试验仪器：全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、超净工作台、高压灭菌锅、天平；250 ml三角瓶、50 ml三角瓶、移液管（移液枪）。2. 试验材料：葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4。四、试验方法和步骤1. 养基配制(见表1，2) 表1 正交表试验设计 （100 ml）原因水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表试验方案 编号葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD）0h 12h24h36h48h60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) K1K2K3极差R2. 取250ml三角瓶将上述培养基配制200 ml，取6个50 ml三角瓶各装入培养基10 ml，及剩下培养基（用于测定时稀释，当OD值小于或大于）于121 下灭菌30 min，冷却。（制备无菌水）3. 冷却后接种0.5 ml（接种量为5），置于28 培养箱进行培养。4. 测OD值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不一样时间菌悬液摇均匀后于560 nm波长、1 cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用以未接种培养基作空白对照，并将OD值填入表中，最终确定最好培养基组成及发酵时间。 5. 作各原因水平K图。6. 依据试验数据判定发酵时间及最好培养基配比。五、思索题 1. 为何要作K图？假如试验继续深入，应该改变那些原因水平，为何？2.R值反应是什么？有何意义？试验五 反应器培养液灭菌和接种培养小型台式玻璃生物反应器置于高压锅中灭菌，而金属制生物反应器灭菌是采取夹套层蒸汽加热灭菌方法进行。因为结构差异小型生物反应器灭菌和大型发酵罐灭菌操作有一定差异，小型生物反应器上盖上有众多电极接口，需预防蒸汽打湿；蒸汽进出口路线也有所不一样，需确保蒸汽进出通畅。经过实际操作熟悉灭菌过程。一、试验目标 学习和掌握生物反应器灭菌和接种培养操作，认识和掌握利用现代化反应器操作规程及方法。二、试验原理 将反应器内培养液温度升至121 ，以达成灭菌效果，灭菌后培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格根据无菌操作进行，避免杂菌污染。三、试验仪器和材料 1.试验仪器 5L升生物反应器、蒸汽发生器、反应器控制台、三角瓶；2.试验材料 菌种：酵母菌；培养基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，无机盐。四、试验步骤和方法1 .灭菌：在反应器安装就序后，接通电源，打开控制台总开关，开启冷却水阀，分别按下温度、pH、溶解氧、搅拌器开关键，调整搅拌器转速约120 rpm， 调整灭菌时间（30 min），设置灭菌温度（121 ），同时，按下灭菌开关键。使电加热器对罐底夹套层进行加热，罐内温度逐步上升，待温度升至105 左右时，关闭废气出口阀。温度继续上升至灭菌温度，自动保温至设定时间后，由冷却水自动冷却至设置发酵温度。2. 培养条件确实定：通人反应器空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌培养罐内。在控制台上，设定所需搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计流量调至确定值。3.接种和培养：将事先培养好培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长久细胞，以无菌操作方法倒入已灭过菌带有插在保险管套筒内注射针及软管三角瓶内）由接种口接入罐内，接种时，要在接种口隔膜周围放上浸有酒精棉花或用1-3 ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升气流来预防杂菌污染。接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。接种量大致上是培养液百分之几。如调整pH值和泡沫时，可将酸液和碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵和反应器连接，和罐体连接方法和接种相同。这么，经过控制台自动控制，就能够自动地连接流加，使罐内保持所需pH值和泡层状态。4. 取样：为了了解培养过程中反应物改变情况，必需定时地进行取样，取样时，要关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出。不过，在第二次取样时，必需注意将残液放净后再取样。五、思索题 1. 本试验是采取何种方法灭菌？你所了解反应器灭菌方法有哪多个？2. 怎样确保接种过程中不使反应器内部发生杂菌污染？试验六 pH电极、溶氧电极校正为了正确测定发酵液pH 值和 0D 值，每发酵周期需对pH电极和溶氧电极进行校正。尤其是a)长久未用电极和新换电极；b)被测溶液温度和标定时温度相差过大时尤需校正。pH电极校正一、试验目标 了解pH电极、溶氧电极基础原理，掌握其校正方法及步骤。二、试验原理 待校正pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起复合玻璃电极。复合电极内层玻璃管和玻璃球泡相通，内充以恒定pH植标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极）。在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层AgCl薄膜。从上部扩大部分边上注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使KCl溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。复合电极基础性能参数有电极转换系数（也称Nernst斜率），电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击次数等等，它们全部有一定要求和测试方法，对新使用电极或已经发酵运行一段时间电极，其性能参数要发生改变，对一些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。三、试验仪器和材料 复合玻璃电极、pH操纵器、标准pH试剂、蒸馏水、Na2HPO4、柠檬酸四、试验方法和步骤打开pH操纵器、测量范围和温度开关，将pH电极电插头插入放大器插孔。首先测标准pH试剂温度，然后记下缓冲液瓶子标签上温度条件下所得到pH值。缓冲液和电极组件应该是在一样温度，假如不是，则许可23分钟时间达成热平衡。温度恒定后，调整温度。将电极浸入缓冲液pH7.0（0.2 mol/LNa2HPO416.47mL，0.1 mol/L柠檬酸3.53 mL）中，取得稳定读数就立即将pH表（asymmetry）设定到缓冲液值。将蒸馏水漂洗电极玻璃球泡部位，然后用软纸轻轻擦干，再浸入第二种缓冲液pH9.2（1/15 mol/LNa2HPO4）或pH 4.0（0.2 mol/LNa2HPO47.71mL，0.1 mol/L柠檬酸12.29 mL）中，取得稳定读数后，用斜率电位计（mV/pH）纠正pH值。如此反复2-3次，直至读数和被测试剂相同并稳定。以上程序不得颠倒，不然不能取得有效校准。图2 复合玻璃电极结构五、思索题 1.在pH电极校正操作过程中应注意哪些事项？溶氧电极校正一、试验目标 了解溶解溶氧（DO）电极基础原理，掌握其校正方法。二、试验原理a电解型电极 b原电池型电极图3 氧电极类型1. (极谱型)电解型电极电解型电极是由一个阴极（珍贵金属如铂或金）、一个阳极（Ag/AgCl）和一个电解质，如中性NaCl溶液组成。在某一溶氧浓度一定溶液系统中，经过电极之间约0.6-0.8电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极电流电压极谱图（图6）能够看出，OA为极谱残余电流；A点为氧分解电压，当外加电压大于分解电压A，这时电极输出电流伴随电压增大而增加，当达B点后，电极电流就不再伴随外加电压而增加，即电极电压进入恒图4 扩散电流和氧浓度关系定区，这时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至C点时，电极输出电流快速增加，这是因为水被还原成氧所造成。从图中也可看出饱和电流和溶氧浓度成正比关系。所以，只要把外加电压固定在电流电压图中平坦部分，电极输出电流就能够校正测量溶解氧，这个固定电压常选在0.60.8 V之间。反应式为：阴极： O2 + 2H2O +2e- H2O2 + 2OH- H2O2 +2e- 2OH- 阳极： Ag +Cl- AgCl + e-总反应：4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- 4AgCl + 4OH- 用NaCl或KCl作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必需在一段时间后补充。2. 原电池型电极原电池型电极不采取外电压，而是选择参比电位比阴极电位高碱性金属（锌、铝或镉）作阳极，以珍贵金属（银或金）作阴极，这是氧就在阴极自发地被还原，产生电动势。 银铅电池型电极电子反应为： 阴极：O2 +2H2O + 4e- 4OH- 阳极：Pb Pb2+ + 2e- 总反应：O2 +2Pb + 2H2O 2Pb(OH)2 伴随时间推移，这一反应也会氧化电极。为了校正氧电极，使液体被空气中氧饱和，假定饱和度被扩大至100%显示。电极零点适宜用氧气调整，因为电极显示是氧分压而不是氧浓度，显然在1 M KCl溶液中饱和时氧实际浓度只有其在水中浓度73%，但还是假定空气饱和时，在1 M KCl溶液中得到和在水中相等数值显示。三、试验仪器和材料 溶氧电极、DO测量放大器（指示组件）、压缩空气、水浴锅、铁架台、Na2SO3 。四、试验方法和步骤1. 将氧电极置于和恒温水浴（温度调至和被测发酵液相等）相连接内部盛有水带夹套烧杯中，并置于气体分布管上方，电极连线和放大器连接并将放大器开关打开。2. 设置0：将电极置于饱和Na2SO3 溶液中，待DO测量放大器显示电压值稳定，调整零电位器，使数字显示器达成0值。3. 设置满量程：将空气通入气体分布管，使带夹套烧杯中水被空气饱和，使其达成充足搅拌。设置压力选择器至三档中任何一档（即100，200，800 mmHg），使数字显示器指向约95%，再操作斜度电位器，仔细调整指示值，至95%显示。4. 精度检验：用惰性气体N2通入气体分布管，使水饱和。显示器将指向0，而在此操作期间，压力选择器0和斜度电位器不再调整。五、思索题 1.在校正溶氧电极时为何要待DO测量放大器显示电压值稳定？2.溶氧电极怎样保养？试验七、生物制品冷冻干燥冷冻干燥是利用升华原理进行干燥一个技术，将被干燥物质在低温下快速冻结，然后在合适真空环境下使冻结水分子直接升华成为水蒸气逸出过程。在众多干燥方法中最能确保热不稳定性生物制品质量：即生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢靠、溶解速度快，残余水分低。应用于疫苗、抗生素、菌种保藏等。要取得高质量生物制品（包含部分发酵制品），对冻干理论和工艺应有一个比较全方面了解。一、试验目标 学习和掌握冷冻干燥设备工作原理、应用范围和操作关键点；掌握应用冻干法干燥生物活性物质方法和要求。二、试验原理 物质在干燥前一直处于低温(冻结状态)，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基础不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上预防干燥物质理化和生物学方面变性。三、试验仪器和材料 ALPHA1-2冻干机、超低温冰箱、生物酶制剂、圆底烧瓶。四、试验方法和步骤1. 预冷冻。将已测酶活性酶溶液置于冷冻容器中，于-80 超低温冰箱2 h进行预冻。2. 开启冷冻干燥机，当温度下降至-54 以下时，打开冷冻机盖快速放入需要冻干材料（注意戴手套操作，并打开瓶塞），密封冻干器。3. 抽真空，使真空度达成20 Pa，维持36 h左右。4. 待冻干材料呈粉状或膜状后，关闭真空泵及冻干机，待真空撤去后，先封好瓶盖，再取出冻干材料。5. 将已冻干酶测定活性，比较冻干前活性。五、注意事项1. 制备样品应尽可能扩大其表面积，厚度不超出1 cm ，其中不得含有酸碱物质和挥发性有机溶剂；2. 样品必需完全冻结成冰，如有残留液体会造成气化喷射；3. 注意冷阱约为-65 ，能够做低温冰箱使用，但必需戴保温手套操作预防冻伤；4. 开启真空泵以前，检验出水阀是否拧紧，充气阀是否关闭，有机玻璃罩和橡胶圈接触面是否清洁无污物，良好密封；5. 通常情况下，该机不得连续使用超出48小时；6. 样品在冷冻过程中，温度逐步降低，能够将样品取出回暖一段时间后（仍处于冰冻状态），继续干燥，以缩短干燥时间。六、思索题 1. 采取冻干法制备生物发酵剂中应注意哪些问题？试验八 3 M3 机械搅拌通风发酵罐结构认识机械搅拌通风发酵罐在制药、生物制品生产开发中起着尤其关键作用。在众多类型发酵设备中，兼具通气又带机械搅拌标准式发酵罐用途最为普遍，广泛使用于抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂等领域，在生物制品工厂广泛使用。据不完全统计，占发酵罐总数70%-80%，故又称通用式发酵罐。一、试验目标 经过实地观察，了解机械搅拌式发酵罐内部结构组成，各装置配置安装及功效。二、试验原理 机械搅拌式发酵罐主体包含罐身、搅拌器、轴封、消泡器、中间轴承，空气分布器、挡板、冷却装置、人孔等，配套装置：各工艺参数监测系统、空气除菌系统、蒸汽热力系统等。发酵罐主体各装置依据设计规范达成各自设置作用。三、试验设备 3M3 机械搅拌通风发酵罐.四、试验方法和步骤1. 打开人孔及内视灯观察以下各装置。1.1罐体材料、高径比、封头形式。1.2搅拌器组数、叶轮类型。1.3挡板组数及安装。1.4空气分布装置形式。1.5轴封类型和结构。1.6消泡装置类型和安装。1.7冷却装置类型。1.8进料、进气、排料、出料、取样装置。1.9加热、冷却装置。1.10压力、温度、pH、溶氧控制接口。2.作出3 M3机械通风搅拌式生物反应器结构示意图，标注以上各装置名称。图5 机械搅拌通风发酵罐参考示意图3. 考察本设备配置蒸汽系统组成。4. 考察本设备所配置空气除菌系统组成，并作出空气除菌步骤示意图。五、思索题 1.小型和大型生物反应器设计上有什么不一样点？2.本设备所选择搅拌叶轮、机械消泡装置、冷却装置分别为何种形？除此之外分别还有哪些类型？3.本设备配置蒸汽系统蒸汽生产量多大？4.本设备所配置空气除菌系统为几级？分别采取何种过滤器？试验九 1 M3中试发酵设备操作方法发酵车间实地训练是培养技能型人才，增强工程意识必需路径。经过中试发酵设备全方位直接操作真正提升学生适应能力和实战技能。 一、试验目标 1.经过发酵中试车间实训，体验上罐操作全过程。2.熟悉车间管路部署及各设备性能。3.掌握空气过滤系统操作、冷却系统操作、工艺参数控制。4.加深对分批培养基础原理及过程了解。二、试验原理 微生物技术产品从试验室到工业生产开发过程中，需要进行小试、中试、生产逐层放大培养，中试培养已经近似于生产发酵。其工艺步骤包含：空消、实消、空气除菌、接种、移钟、消泡、进料、取样、出料等；工艺参数控制包含：温度、pH值、溶氧、压力等。三、试验设备和材料 1M3 机械搅拌通风发酵罐、食用菌。图6 发酵罐检测装置配置示意图四、试验操作步骤1. 空消：首先，清洗培养罐内部，尤其要注意在空气分布或取样管导出残留污物。罐内加入20%30%水后，通入加热蒸汽（蒸汽需经过滤膜过滤），在121 下杀菌15 min。杀菌过程中不停地打开阀门，确保根本杀菌。杀菌完成后，从取样管将罐内液体排出。2. 培养基制备：培养基加入量通常为罐容积50%60%。将称量好培养基组分，经溶解后加入到发酵罐中。此时培养液体积为实际所需培养基容积80%。因为蒸汽杀菌过程中有大量蒸汽转变为水，使发酵液体积增大。对于合成培养基灭菌操作，葡萄糖和磷酸盐应分别灭菌后，在开始培养前加入以避免在杀菌过程中，葡萄糖和氮化合物之间发生美拉德反应，和磷酸盐和其它金属离子形成沉淀。3. 安装控制装置：安装调试好PH电极、溶氧电极。4. 实消和冷却：夹套内通入加热蒸汽，是培养液温度达成80以上。随立即蒸汽直接通入发酵罐，在121下杀菌15 min。杀菌过程中，间断打开各阀门，排出内部空气，以确保各出管内杀菌完全。此时假如不采取夹套预热至一定温度，直接通入蒸汽杀菌话，培养基装置内冷凝水增加，将增加培养液体积调整难度。杀菌完全后，夹套内通入冷却水，进行培养基冷却。为确保罐内正压，应通入适量无菌空气。5. 操作条件设定：在无菌条件下连接好酸、碱消泡剂等流入管线。设定好通风量（通常为0.52L/min.L）、温度和pH值。6. 接种、培养：将浸有酒精脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，加入无菌水，调整好罐内培养液量（必需时应加入葡萄糖、磷酸盐等溶液），进而将种子培养液注入。接种量通常为1%10%，盖好接种口后，调整搅拌转数至所需值，培养开始。7. 取样：为了解培养过程中改变，需定时取样进行样品分析。因为罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次取样时残留在取样管中培养液去除后在取样。另外，取样后应通入加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。8. 培养结束：将电极和培养液 全部取出，培养液在121 下杀菌15 min后，排出到指定地点。罐内应冲洗洁净。五思索题 1.发酵罐放大有哪些方法？中国常见方法有哪些？试验十 面包酵母流加培养和分批培养试验流加培养又称补料分批培养，是在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基培养方法。其优点可使发酵系统中维持很低限制性底物浓度，降低底物抑制或其分解代谢物阻遏作用，避免出现限制性底物浓度过高影响菌体得率和代谢产物生成速率现象。本试验经过面包酵母流加培养和分批培养结果加以验证。一、试验目标 1. 以斜面菌种活化为起始，经试验室菌种扩大、车间菌种扩大至发酵罐培养，熟悉发酵培养全过程；2. 对比分批培养和流加培养面包酵母菌生长过程及菌体得率；3. 巩固灭菌、空气过滤、冷却、发酵罐工艺参数控制等操作过程；4. 加深补料分批续培养基础原理了解，熟悉流加补料过程控制方法；5. 熟悉菌体离心分离及真空干燥过程操作。二、试验原理 面包酵母在通风供氧充足前提下，培养基中葡萄糖为限制性基质，葡萄糖浓度对于提升酵母得率是至关关键。本试验面包酵母培养目标是取得最大酵母浓度，所以采取葡萄糖流加培养，并比较一样条件下分批培养效果。三、菌种和培养基 1. 菌种：面包酵母 2. 培养基 酵母斜面培养基 10麦芽汁固体斜面，pH5.0；酵母摇瓶种子培养基 10麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素O.2%，pH5.0；酵母分批发酵培养基 玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。 四、试验设备和材料 1.30L、300L 种子罐；3M3全自动发酵罐； 2.摇床； 3.超净工作台； 4.离心机； 5.显微镜； 6.分光光度计 7.灭菌锅8.培养箱9.真空干燥箱10.试管，棉塞， 500ml三角瓶，5L三角瓶，分口膜。五、试验方法和步骤1. 分批培养1.1总步骤 斜面培养（斜面培养基配制、灭菌，接种，培养） 摇瓶种子培养 种子罐培养（糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌，接种。） 发酵罐培养 菌体分离。1.2 斜面种子制备 自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜斜面试管中，于28培养箱中培养24h。 1.3 摇瓶种子制备 将上述培养好斜面种子接入500ml三角瓶装灭过菌100ml摇瓶种子培养基中，在28，200rpm震荡培养15-20h。1.4 种子罐培养 于30L发酵罐装入20L发酵培养基，121灭菌20min，冷却至30，将培养好摇瓶种子接入发酵罐（接种量2-3%）进行发酵。培养条件为：温度28，搅拌转速200rpm，通风量1vvm。1.5发酵罐培养 按试验八中步骤，进行空罐灭菌（包含空气过滤器灭菌）、实罐灭菌操作。消泡剂灭菌。将种子罐中酵母菌种压送至发酵罐，通气量在35 L/min，搅拌转数200rpm，接种量10。发酵条件1.4同种子罐培养。1.6 过程监控 0小时：取样测定总糖和还原糖； 4-二十四小时：每隔4小时取样镜检、测定还原糖、菌体浓度。2. 流加培养2.1 种子制备 同分批培养种子制备过程。2.2 流加培养前准备工作 葡萄糖于流加储罐灭菌。2.3流加培养 通气量35 L/min，搅拌转数200 rpm，接种量10。控制流加储罐压力使达成流加25g/100mL葡萄糖，当发酵罐内葡萄糖浓度达成2030g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH值为5.0。经过调整风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10左右。2.4过程监控 同1.6步骤。 3. 菌体离心分离 将分批培养和流加培养发酵液用布袋初步过滤，放入离心机，转速1000r/min，10min.。4. 菌体干燥4.1 将离心分离后菌体置于不锈钢托盘放入真空干燥箱，将箱门关上，并关闭放气阀，开启真空阀，再开启真空泵电源开始抽气，使箱内达成所需真空度，关闭真空阀，再关闭真空泵电源开关。4.2 把真空干燥箱电源开关拨至“I”处，设定温度60，箱内温度开始上升，当箱内温度靠近设定温度时，加热指示灯突亮突熄，反复数次，通常120min以内搁板层面进入恒温状态。 4.3 当所需工作温度较底时，可采取二次设定方法，如所需工作温度60，第一次能够设定50，等温度过冲开始回落后，再第二次设定60，这么可降低甚至杜绝温度过冲现象，立即进入恒温状态。（注意：智能型仪表请参考操作方法）4.4干燥时间12h.当干燥时间较长，真空度下降，需再次抽气恢复真空度，应先开启真空泵电机开关，再开启真空阀。4.5干燥结束后，先关闭电源，旋动放气阀，解除箱内真空状态，再打开箱门取出物品。（解除真空后，因密封圈和箱门吸紧变形不易立即打开箱门，经过一段时间后，等密封圈恢复原形后，才能方便开启箱门。）5. 称重 干燥结束后取出菌体，计算菌体总得率。六、分析方法 1. 菌体量(X) 生物量测定 生物量测定方法有比浊法和直接称重法等。比浊法。以空白培养基为对照，在550 nm处测定发酵液吸光值。酵母浓度测定(湿重法)：吸收5ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重。2. 还原糖测定 斐林试剂法3. 发酵活力测定(选做)：称取0.26g鲜酵母，加5g在30下恒稳1h面粉制成面团。置于30水中测定面团从水底浮出时间。浮起时间在15min内认为样品合格。 4. 分析决定初始体积V0，比生长速率及菌体浓度X测量，补料速度F和补料浓度SF计算和控制。七、试验结果 1. 分别画出分批培养和流加培养过程中，培养液中葡萄糖(g/L)、酵母菌体量(g/L)随流加培养时间改变曲线；2. 分别计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。八、讨论 1. 流加培养和分批培养菌体浓度区分何在及原理分析；2.推导理想情况下准稳态恒速流加和和时间参数方程。第二篇 酿造工艺学试验试验一 葡萄酒酿造一、目标和要求1确定葡萄酒酿造最好工艺条件，同时简单了解葡萄酒酿制工艺原理。2掌握干红葡萄酒酿造中发酵监控方法及相关操作要求。3了解怎样确定葡萄酒酒精发酵结束，同时对葡萄酒进行分离和封装，转入后发酵阶段。4、熟悉各个理化指标测定方法。二、试验原理葡萄酒酿造就是将葡萄转化为葡萄酒。它包含两个阶段：第一阶段为物理化学或物理学阶段，即在酿造红葡萄酒时，葡萄浆果中固体成份经过浸渍进入葡萄汁，在酿造白葡萄酒时，经过压榨取得葡萄汁；第二阶段为生物学阶段，即酒精发酵和苹果-酸乳酸发酵阶段。葡萄酒酿造目标就是，实现对葡萄酒感官平衡及其风格至关关键这些口感物质和芳香物质之间平衡，然后确保发酵正常进行。葡萄糖分，全部由葡萄糖和果糖组成，这两种糖在酵母作用下，直接发酵生成乙醇和二氧化碳及种种副产物，同时放出热量。二、试验仪器和材料1. pH计、手持糖量计、温度计、天平、量筒、烧杯、比重计、水浴锅、电炉、移液管、锥形瓶、容量瓶、5L玻璃瓶、塑料盆，纱布。2. 斐林试剂A、