基于G-四链体的生物传感器...食品污染物检测中的研究进展_缪金伟.pdf

基于 G-四链体的生物传感器在食品污染物检测中的研究进展缪金伟(东营职业学院生物与生态工程学院东营257091)缪金伟男，硕士，讲师，主要从事用于外泌体分离检测的纳米材料和各类生物分子的电化学检测研究。E-mail:dyzyxymjw126com2022-06-15 收稿，2022-09-15 接受摘要食品污染物不仅对人类健康造成了严重威胁，还会给食品工业造成巨大的经济损失。G-四链体(G4)是由鸟嘌呤的碱基配对形成的核酸三维二级结构，具有灵活的绑定能力，已成为生物传感器的重要组成部分。将 G4 与生物传感器结合用于食品中污染物的检测得到了广泛的应用。本文对 G4 进行了简介，综述了 20152022 年间 G4 在食品污染物检测中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行了展望。关键词生物传感器食品污染物检测G-四链体esearch Progress of G-Quadruplex-Based Biosensorin Food Contamination DetectionMiao Jinwei(School of Biological and Ecological Engineering，Dongying Vocational College，Dongying，257091)AbstractFood contaminants not only pose a serious threat to human health，but also cause huge economiclosses to the food industry G-quadruplex(G4)is a three-dimensional secondary structure of nucleic acid formed bypairing four guanine bases，which has flexible binding ability，and it has become an important part of biosensors Thecombination of G4 and biosensor has been widely used in the detection of food contaminants In this paper，theconstruction methods of G4 is introduced，the research progress of G4 in the detection of food contaminants from 2015to 2022 is reviewed，and the development trend of G4 in the future is prospectedKeywordsBiosensor，Food contaminant，Detection，G-quadruplex食品安全一直是人们关注的重要问题。随着食品供应的全球化，确保食品安全至关重要。不安全的食物往往可以导致各种疾病，严重者甚至会导致食用者死亡1，2。目前，严重的食品安全问题往往是由食品污染物引起的。食品污染物的来源多种多样，如农药的滥用、食源性致病菌的污染、毒素的产生以及食品加工过程中有害化学物质的形成3。因此，为确保食品安全，食品污染物的测定和监测具有重要意义。为发展定性/定量检测食品污染物，研究者们已经开发了多种方法。常用的光谱检测法有气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、拉曼、荧光和紫外可见光谱法，这些方法不需要大量破坏食品样本，但往往受到吸收峰重叠、检测特异性差、耗时长、需要专业操作等问题的限制4。另外，生物学检测方法，如免疫分析(ELISA)、酶抑制、快速抗菌筛选试验(FAST)、侧流试验条(LFTs)和生物传感等，也被广泛用于食品中的污染物的快速分析57。虽然这些方法具有灵敏度高和特异性强等优点，但由于食物基质和热不稳定性的干扰，这些方法可能会产生假阳性的结果。开发高效、低成本、准确、灵敏、方便的生物传感器，实现对食品污染物的准确检测，对保障食品安全和人类健康具有非常重要的意义。G-四链体(G4)是由鸟嘌呤富集的核酸序列构建而成的一种特殊的高阶 DNA 结构8，9。G4具有性价比高、易合成、适应化学改性等优点，可以用于目标识别和信号转导，因而在生物传感平台中具有广阔的应用前景10。其中，G4 作为识别单元，它对靶标具有很高的特异性和亲和力;作为信号转换单元，可通过多种信号输出满足不同生物传感平台(荧光、电化学、比色等)的需872化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期http:/wwwhxtborgDOI:10.14159/ki.0441-3776.2023.03.010求11，12。因此，基于 G4 的生物传感器在医学、环境监测和食品工业等领域得到了广泛的研究和应用。本文拟在简单介绍 G4 的基础上，综述在20152022 年间基于 G4 的生物传感器在食品污染物检测中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行展望。1G-四链体1962 年首次发现了鸟嘌呤(G)四链体，自组装 G4 核酸结构不同于典型的双螺旋结构13，G4是由四个鸟嘌呤碱基通过 Hoogsteen 氢键配对形成的一种稳定的共面四方二级结构14。G4 结构具有多种构象，可以由两个、三个或多个 G4 叠加而成。根据链的方向，G4 结构可以分为平行、反平行和混合(平行和反平行的混合)结构(图 1)，这主要是由于 G4 的构象通常受核苷酸链的数量和极性、阳离子类型和结合靶点等多种因素的影响15，16。由于其独特的结构和增加的热力学和化学稳定性，G4 有许多其他核酸结构不具备的优点，如热稳定性好、免疫原性低、酶活性可调以及可编程性好等17。另外，由于 G4 结构的负电荷密度是双链 DNA 的两倍，因此，G4 可以大大提高其与荷正电配体的静电相互作用。目前，G4 广泛应用于检测有机分子、核酸和金属离子的生物传感器。图 1G4 的不同结构Fig1The different stureture of G42G4 形成的 DNAzyme脱氧核酶于 1994 年首次合成，单链 DNA 序列显示出酶活性。在稳定金属离子存在的情况下，富含鸟嘌呤的序列与含铁卟啉血红素结合，折叠成 G4，极大地提高了血红素(Hemin)的催化活性18。通过模拟辣根过氧化物酶(HP)的DNAzyme 用于催化 H2O2的还原和底物(3，3，5，5-四甲基联苯胺硫酸盐(TMB)、鲁米诺、2，2-氨基二氮(3-乙基苯唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、苯胺、对苯二酚(HQ)以及邻苯二胺(OPD)的氧化1923，能进一步引发后续反应，提高催化活性和检测灵敏度(图 2)。值得注意的是，DNAzyme能够很好地避免天然蛋白酶产生的不溶性沉淀，从而 减 少 阻 断 氧 化 还 原 探 针 的 电 子 转 移 过程24，25。通过 G4 和适配体或其他生物组分的结合，研究人员正试图开发新的生物传感器并拓宽其应用。因此，G4 已成为高选择性和高灵敏度的生物传感的通用工具。图 2G4 形成的 DNAzyme 催化 TMB 显色的机理Fig2Mechanism of TMB color development catalyzedby DNAzyme formed by G43G4 作为识别单元用于食品污染物检测作为识别单元，G4 对赭曲霉毒素 A(OTA)、Pb2+等靶点具有较高的特异性和亲和力，因此，G4可以用于食品基质中污染物的灵敏检测。3.1真菌毒素检测无论是在人类食品还是动物饲料中，真菌毒素的存在都威胁着食品安全和人类健康。各国政府和国际组织对食品中的真菌毒素残留量制定了严格的限制。为使真菌毒素水平保持在这些限度以下，建立可靠和敏感的真菌毒素监测方法是非常必要的26，27。基于 G4 的生物传感器作为一种有前景的真菌毒素检测工具受到越来越多的关注。作为小分子毒素，OTA 和黄曲霉毒素 B1(AFB1)可以与特定的 DNA 序列发生特异性反应，从而形成或破坏 G4 结构，达到检测的目的。例如，Li 等28 构建了一种基于 G4 的荧光传感器用于 AFB1 的检测。荧光染料硫黄素 T(ThT)与抗 AFB1 的 G4(G4/ThT)结合形成的复合物能够显著提高 ThT 的荧光强度。当 AFB1 存在时，游离的 AFB1 适配体会破坏 G4 的结构，从而降低荧光强度，达到检测的目的。该方法对植物源性食品中 AFB1 的检测限为 1ng/mL，同时整个检测过程在 20min 内即可完成。这种 G4/ThT 荧光探针972http:/wwwhxtborg化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期具有水溶性、成本效益、操作简单、灵敏度好、背景信号低等优势，在食品分析检测中有很大的应用潜力。研究表明，OTA 的酚环体系与 G4 存在-堆叠作用。这种 OTA 与其 G4 适配体结合机制促进了基于 G4 的 OTA 检测生物传感器的构建。基于此，研究人员建立了用于 OTA 检测的高灵敏度、无标记的 G4 荧光传感器。另外，由于 OTA 本质上是一种荧光酚类物质，OTA 与其适配体之间的-堆叠相互作用也可以触发 G4-OTA 之间的能量转移，从而提供了一种新的能量转换机制“打开”荧光信号。Armstrong 等29 报道据此构建了“打开”的荧光信号平台，使得适配体-OTA 复合物的荧光远远强于游离的毒素。G4-OTA 复合物在256nm 处的选择性激发可使 OTA 荧光增强 4 倍。G4-OTA 能量转移平台对 OTA 的检测限为 2ng/mL，这种检测灵敏度与荧光共振能量转移免疫分析平台类似。此外，Deore 等30 构建了 G4 特异性配体驱动的 G4-G4 纳米装置作为无标记适配体传感器检测 OTA。作者采用 H-Telo22-配体相互作用作为 G4-G4 纳米器件的模型。当 OTA 不存在时，OTA 结合适配体折叠成反平行的 G4。结果表明，当荧光染料引起 OTA 结合适配体(平行或混合)拓扑结构变化时，OTA 介导的染料置换具有出色的 OTA 检测灵敏度。然而，当荧光染料未能在 OTA 结合适配体的反平行折叠中诱导构象变化时，将 OTA 添加到适配体-染料复合物中会导致染料置换不佳，OTA 检测的发射响应较弱。这种检测方式作为一种概念验证，为基于 G4的荧光传感器用于 OTA 检测提供了重要思路。3.2金属离子检测食品中的重金属离子主要来自环境。重金属污染正威胁着全球粮食安全和人类健康。有效监测食品和环境中重金属含量是控制食品中重金属污染的重要手段之一31。与传统的仪器分析(如电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和原子发射光谱法等)相比，生物传感方法可以提高重金属离子的检测效率，使现场分析成为可能32。许多重金属离子，包括 Tl+、Pb2+、Ag+、Hg2+、Cd2+可以通过错配或其他相互作用与 DNA探针结合，使 DNA 探针的结构产生特殊的构象转变。G4 是一种常用的重金属离子 DNA 探针。Khoshbin 等33 构建了基于 Pb2+适配体从无规线圈到 G4 结构的构象转换的超灵敏纸基生物传感器，其主要是利用 Frster 共振能量转移(FET)过程和氧化石墨烯(GO)片的超荧光猝灭特性。在纸基平台上注入 Pb2+时会诱导特定适配体从 GO 表面释放，从而恢复荧光发射。Pb2+不存在时，荧光发生猝灭。利用 GO 薄片的荧光猝灭特性，大大降低了背景信号，能够检测出0.5pmol/L 的 Pb2+。同时，该方法可在 10min 内实现对 Pb2+进行超灵敏检测。该纸基生物传感器具有简单、高效的特性，此外，通过取代目标特异性适配体，该方法还可用于检测其他金属离子。由于实际样品总是含有多种重金属离子。在这种情况下，同时分析多个目标的适配体传感器可以使检测过程更加方便。G4 可以在多种重金属离子同时测量中发挥多种作用。Lu 等34 建立了一种基于荧光标记适配体和 GO 的 Hg2+、Pb2+和 Ag+的荧光检测方法。由于荧光团与 GO 之间的 FET，荧光信号极弱。当系统中加入目标离子时，相应的适配体与目标离子选择性结合，并从GO 表面释放，荧光信号恢复。Hg2+、Pb2+和 Ag+的最低检测限分别为 0.2、0.5 和 2 nmol/L，该方法在多种离子同时检测中展示出背景信号小、检测速度快、准确度高、选择性好等特点。此外，Zhang 等35 设计了一种新颖的双功能寡核苷酸(OND)探针，并在 5 端标记了单个荧光基团HEX 用于实际样品中痕量 Ag+和 Pb2+的同时检测。在 Ag+存在的情况下，源自 Ag+诱导的胞嘧啶-Ag+-胞嘧啶错配的发夹结构会导致 HEX 接近 G4 的 3-末端，导致荧光发生猝灭。当存在Pb2+时，通过 Pb2+与由分子内氢键连接的两个G4 平面结合，使 HEX 接近 G4 末端导致荧光猝灭。该方法在 1.020.0 nmol/L 范围内具有良好的线性关系，对 Ag+和 Pb2+的最低检测限分别为 82 和 92 pmol/L。与针对不同靶标使用特定适配体的生物传感器相比，基于多功能探针的平台具有更简单的组成。但由于信号输出可能是混合的，因此很难同时对多个金属离子进行定量测量。尽管 G4 作为识别单元对 OTA、Pb2+等靶点具有较高的特异性和亲和力，但是仍然有很多食物污染物与 G4 没有特定的结合能力。4G4 作为信号变换单元用于食品污染物检测在生物传感平台中，G4 不仅可以用于目标识082化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期http:/wwwhxtborg别，还可以用于信号转导。G4 利用其优良的催化能力和荧光猝灭能力，可以将污染物的浓度转化为比色、电化学、荧光或其他可测量的信号。同时，G4 作为信号探针，能够消除传统方法中繁琐的步骤，同时又能保证识别策略的敏感性和特异性。此外，G4-hemin DNAzyme 作为一种通用的信号发生器被用于许多比色、荧光和电化学生物传感器，可用于快速检测一系列污染物。4.1G4 用于比色传感器比色生物传感器以颜色反应为基础，可以通过仪器测量甚至肉眼检测实现污染物的定量检测。与过氧化物酶相比，G4 DNAzyme 更稳定，更容易合成。将 G4 DNAzyme 作为催化组分，有利于建立稳定、无酶、低成本的生物传感平台。Wu 等36 提出了一种 DNAzyme 可视化的Hg2+检测策略。Hg2+诱导两个探针之间的胸腺嘧啶(T)-Hg2+-T 碱基对，这些碱基对构成 G4 DNA，形成 G4-血红素 DNAzyme。从 G4 到发夹状结构的转变能对 Hg2+产生比例和杠杆反应，放大了Hg2+检测的信号-背景比率。与普通适配体探针相比，采用比率增强的 G4 探针对 Hg2+的检测灵敏度提高了 4.7 倍;同时，该传感器显示了对Hg2+良好的特异性。Sun 等37 利用核酸适配体偶联磁性纳米粒子作为高效捕获探针，建立了一种用于检测食源性副溶血性弧菌的比色适配体传感器。该检测策略是基于副溶血性大肠杆菌的互补 DNA(cDNA)和副溶血性大肠杆菌之间对其特异性合剂的竞争。与适配体结合的磁性纳米颗粒被用作捕获探针，而 G4 DNAzyme 酶被用作信号放大元件。在优化条件下，副溶血性弧菌检测线性检测范围为 102107CFU/mL，检测限可低至 10CFU/mL。该方法与标准平板计数法得到的结果具有良好的一致性。因此，这种新型的传感器可以成为敏感和选择性地检测副溶血性大肠杆菌的一个很好的候选者，而无需复杂的操作。4.2G4 用于电化学传感器生物分子与目标分子之间的相互作用可以转化为电势、电流、电导、阻抗等电信号，用于食品污染物的定量测量。与其他信号相比，电化学信号具有 响 应 快、灵 敏 度 高 的 特 点。由 于 G4DNAzyme 的过氧化物酶活性，将其用于电化学生物传感器中可以作为氧化还原介质，对目标产生电响应。信号的产生和放大对基于 G4 的电化学生物传感器至关重要，这主要是因为，对于电化学信号的产生，适配体和抗体作为捕获探针能够很好地提高选择性;同时，采用链置换扩增(SDA)、杂交链式反应(HC)和纳米技术等放大策略可以实现对痕量污染物的检测。以 SDA 和依赖金属离子的 DNAzyme 循环扩增来生长鸟嘌呤纳米线(G-纳米线)作为信号输出组件，Xie 等38 建立了一种无标记的电化学传感器用于检测 Hg2+。随着 T-Hg2+-T 结构的形成，Hg2+-介导的 SDA 导致大量 Mg2+-依赖的酶序列的释放，进一步与发夹序列杂交。当 Mg2+存在时，发夹序列的催化解理导致酶促序列的释放进行另一个解理循环，使 G4 片段留在电极表面。这些碎片导致 G4/血红素纳米线自组装，产生电化学信号。该传感器具有较高的灵敏度(最低检测限为 0.097pmol/L)和对 Hg2+的良好选择性，表明多种信号放大策略的集成具有潜在的价值。另外。Ma 等39 构建了一种基于二维 Cu-卟啉(Cu-TCPP)金属有机骨架纳米膜、G4 和 DNA 纳米马达联合使用的自清洁电化学生物传感器用于Pb2+的循环检测。具有过氧化物酶活性的 Cu-TCPP 纳米膜作为载体用于保持 G4 的亚稳态。Pb2+的引入和血红素的插层有助于 Cu-TCPP 纳米膜 表 面 亚 稳 态 G4 向 稳 定 的 G4-血 红 素DNAzymes 的转化，形成 G4-血红素 DNAzymes 催化 H2O2产生电化学信号，用于测定 Pb2+。该传感器检测 Pb2+的线性范围为 5nmol/L5mol/L，检测限为 1.7nmol/L。与已有报道的最佳检测体系相比，其线性范围扩大了 5 倍，检出限也更低。4.3基于 G4 的荧光传感器荧光生物传感器被认为是一种灵敏度更高的分析工具。作为信号转换元素，G4 可以与荧光染料有选择性地相互作用，在有标记和无标记荧光生物传感器中都发挥了重要作用。He 等40 精心设计 DNA G4 组装体，构建了无生物酶、无标签、环保的生物传感器，通过比色和荧光多模式实现 OTA 的灵敏检测。在比色模式下，OTA 适配体(AP9)被组装成具有特殊信号放大序列的 DNA 三螺旋开关。OTA 诱导 AP9 的G4 打开开关，释放信号放大序列，进行比色信号放大。随后，进一步利用 AP9 的 G4 结构与荧光染料 ThT 结合进行荧光模式下的检测。通过巧妙地将 DNA G4 组装起来进行信号放大，不需要182http:/wwwhxtborg化学通报2023 年 第 86 卷 第 3 期任何 DNA 扩增或纳米材料标记。比色法和荧光法的检出限分别为 4g/kg 和 0.01 g/kg。将两种模式应用于具有固有色素和自发荧光的样品中OTA 的检测，表明了该方法的适用性和优越性。Li 等41 用多壁碳纳米管(MWCNT)和 G4 作为信号转换器，构建了一种无标记和无酶的低本底方法检测水胺硫磷(ICP)。将 N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)与 G4 连接，作为荧光探针。当 ICP 适配体被拆分为两条链，各自的末端有 G4-NMM 基序。在没有 ICP 的情况下，MWCNT 吸附了分裂适配体的单链 DNA 组分，导致荧光猝灭。当与ICP 结合时，分裂的核酸适配体可以形成三明治状三元复合物，空间位阻增加使得它们很难被吸附于 MWCNT 表面，从而增强荧光信号。这种生物传感策略可以选择性地、灵敏地检测出食品基质中 10nmol/L 的 ICP。此外，Zhao 等42 建立了一种基于 DNA 三向连接形成的 G4 和 GO 的荧光传感器用于对乙酰氨基脒的检测，该方法的最低检测限为 5.73nmol/L。5结语基于 G4 的生物传感器具有成本低、选择性高、合成简单、输出信号多等优点，引起了研究人员将其用于食品污染检测的兴趣。然而，实际样品中不同的阳离子(如钾离子)和 pH 会影响 G4的形成及其与待测物的结合能力，从而降低基于G4 的生物传感器的灵敏度和准确性。因此，建立比率生物传感器和双捕获探针可以帮助提高检测结果的准确性。另外，适配体和 G4 的结合不需要化学修饰，也是一种提高检测准确性的方式之一。G4 与无标记和无酶生物传感技术结合，再与信号放大策略结合，不仅制备简单，还能实现对待测目标的超灵敏检测，值得进一步探索。与辣根过氧化物酶相比，基于 G4-血红素 DNAzyme 的比色生物传感器的催化活性较低，限制了其实际应用。因此，设计具有良好催化活性的 G4-血红素DNAzyme 与 DNA 扩增或纳米材料标记结合，实现信号扩增值得深入研究。目前，现有的 G4 可检测毒素的种类较少，这主要是受限于毒素与 G4的结合能力。因此，还需要发现更多 G4 序列、拓扑结构和性质的信息，从而促进 G4 与食品污染物的结合，如开发作为 G4 识别探针的发光铱(III)过渡金属配合物和聚集体。尽管基于 G4 的生物传感器比传统的免疫分析和印迹分析更方便、更便宜，但它们离实际应用还有很长的路要走。参考文献1Li C，Li C，Yu H，et al Crit ev 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