马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202301016马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析田澍瑶1覮，谢金鑫1覮，贾陈阳2，罗生金3，沙娅奴尔兰4，张磊5，杨恩慧1，帕丽旦努尔兰1，况玲1，佟盼盼1*(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区核酸检测中心，新疆 乌鲁木齐 830054；3.哈密市畜牧工作站，新疆 哈密 839000；4.伊犁州动物疾病控制与诊断中心，新疆 伊宁 835000；5.阿克苏动物疫病控制诊断中心，新疆 阿克苏 843000)摘要：为调查马源人乳头瘤病毒(HPV)23型(HPV-23)在马群中的流行及遗传变异情况，本研究对413份马流产胎儿组织和20份马场工人鼻拭子样品经PCR检测，结果显示，在纯血马和伊犁马流产胎儿组织样品中均检出HPV-23，阳性率分别为4.3%(2/46)和9.3%(34/367)，表明马流产胎儿携带HPV-23，该病毒可能导致马的流产；在马场工人鼻拭子样品中也检出HPV-23，阳性率为60%(12/20)。将其中12份检测为HPV-23阳性的样品进行E2基因的PCR扩增测序后，采用MegAlign7.1.0软件分析本研究获得的HPV-23 E2基因与GenBank中相关病毒参考株E2基因的同源性，并采用MEGA7.0.26软件构建人源与马源HPV-23 E2基因的进化树，分析其遗传进化特征。同源性分析结果显示，本研究测序的8株马源及4株人源HPV-23 E2基因与氨基酸序列的同源性均为100%，与国外2株人源HPV-23 E2基因序列的同源性为98.9%99.2%，提示马源HPV-23可能来源于人。遗传进化分析显示，本研究鉴定的马源及人源HPV-23与国外人源HPV-23形成独立进化分支，且同处于茁进化分支，与马乳头瘤病毒处于不同分支，进一步表明马源HPV-23可能来源于人。本研究首次在马流产胎儿组织中检测到HPV-23，提示该病毒可能导致马的流产，可能是人源HPV-23感染马，该结果为动物源HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。关键词：人乳头瘤病毒23型；马；流产；E2基因；进化树中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1188-05Genetic analysis of E2 gene of human apillomavirus 23derived from equineTIAN Shu-yao1覮,XIE Jin-xin1覮,JIA Chen-yang2,LUO Sheng-jin3,SHAYA Nuerlan4,ZHANG Lei5,YANG En-hui1,PALIDAN Nuerlan1,KUANG Ling1,TONG Pan-pan1*(1.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Xinjiang Nucleic Acid Testing Center,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;3.Animal Husbandry Station of Hami City,Hami 839000,China;4.Yili Prefecture Center for Animal Disease Control and Diagnosis of Xinjiang,Yining 835000,China;5.Aksu Regional Animal Disease Control and Diagnostic Center,Aksu 843000,China)Abstract:To investigate the prevalence of HPV-23 in horses,our study designed specific primers and used PCR to detect 413收稿日期：2023-01-28基金项目：中国博士后科学基金项目(2020T130555)；国家自然科学基金地区基金项目(32060808)；新疆自然科学基金面上项目(2022D01A167)；新疆杰出青年科学基金项目(2022M653901)覮 共同第一作者：田澍瑶(1998-)，女，内蒙古包头人，硕士研究生，主要从事动物流行病学研究；谢金鑫(1982-)，男，黑龙江齐齐哈尔人，副教授，博士研究生，主要从事病原流行病学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding author;覮Equal contributorsaborted fetal tissues of horses and 20 nasal swabs of horse workers.The E2 genes were sequenced,revealing 12 HPV-23 positivesamples.Sequence analysis of E2 genes obtained in this study and the reference strains in GenBank were performed.Aphylogenetic tree was constructed based on E2 genes of HPV-23 from human and horse-origin,and the genetic characteristics wereanalyzed.The results showed that Yili horses and Thoroughbred horses aborted fetal samples were positive for HPV-23,with apositive rate of 4.3%(2/46)and 9.3%(34/367),indicating that horse aborted fetuses carried HPV-23,which may cause abortion inhorses.Nasal swab samples from workers were positive for HPV-23,with a positive rate of 60%(12/20).Sequence analysisshowed that the E2 gene nucleotide and amino acids homology between the eight horse-origin and four human-origin HPV-23identified in this study was 100%and shared 98.9%-99.2%nucleotide sequence identity with the E2 gene of two foreignhuman-origin HPV-23,suggesting that horse-origin HPV-23 may be derived from human.Based on the E2 genes,the phylogenetictree showed that horse-origin and human-origin HPV-23 strains in our study and foreign strains of HPV-23 have a close geneticrelationship in the Beta branch.Still,they were in different branches with EcPV,which further suggested that horse-origin HPV-23might come from humans.In this study,HPV-23 was first detected in aborted fetal tissues of horses,suggesting that the virus maylead to abortion in horses,possibly human-origin HPV-23 infecting horses.These findings provide a reference for epidemiologicalstudies of animal-origin HPV-23.Key words:human papillomavirus 23;horse;abortion;E2 gene;phylogenetic tree乳头瘤病毒(Papillomavirus，PV)属于乳头瘤病毒科()，是感染皮肤和粘膜的病毒，该病毒在多种宿主中存在，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类1。迄今为止，已鉴定的人和动物PV已超过670种，其中HPV达448种(http:/pave.niaid.nih.gov/)。HPV是一组闭合环状双链DNA病毒，基因组大小约8 kb，是侵袭性宫颈癌、肛门生殖器癌和口咽癌等的病原体，其中高危型HPV，HPV-16和HPV-18是导致宫颈癌发生的主要病因2-4。截至目前感染马匹的PV有15种，包括马乳头瘤病毒(Equuscaballus papillomavirus，EcPV)1EcPV9、牛乳头状瘤病毒(Bovine papillomavirus，BPV)1、2、13型及HPV-18、HPV-23和HPV-1155-6。HPV 被 分 为 琢、茁、酌、Mu 和 Nu 5 个 属7，HPV-23为茁-HPV成员。HPV-23基因组比大多数PV都要小，约为7.4 kb。有研究表明，茁-HPV与疣状表皮发育不良(Epidermodysplasia verruciformis，EV)患者皮肤鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)的发生有关。HPV-23最初是Kremsdorf等从波兰EV患者前臂斑点中分离出来的，是HPV-23与皮肤病变相关的首次报道8。HPV致癌性主要依赖于E6和E7基因的表达，E6基因是致癌转化所必需的基因，用于维持未分化细胞中病毒片段的稳定性，在病毒生命周期中发挥重要作用9。HPV E6基因的转录受启动子p97的控制，p97则受E2基因产物的抑制，因此E2基因在抑制HPV相关癌症的发生中起重要作用10-11。本实验室前期研究已在马流产胎儿样品中检测到HPV6，为调查HPV-23在马群中的流行及来源情况，本研究进一步对马流产胎儿组织样品及马场工人鼻拭子样品进行HPV-23 E2基因检测，并对检测到的HPV-23进行同源性及遗传进化分析，为HPV-23的流行病学研究提供参考依据。1材料与方法1.1样品和主要试剂413份马流产胎儿组织样品和20份马场工人鼻拭子样品为本实验室于2020年2021年采集自新疆伊犁两个马场(表1)。病毒DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Geneaid公司；DL2000DNA Marker购自TaKaRa公司；2伊TransStartRFastPfuFly PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。1.2引 物 的 设 计 与 合 成根 据 GenBank 登 录 的HPV-23参考株序列(KY652675)，利用Primer 5.0软件设计HPV-23 E2基因特异性引物：5-ATTAGAAGTCCTCCAATAGATTGC-3/5-AGGAGGTGGTAGATTCTTCG-3，引物由青岛派森诺基因科技有限公司合成。1.3HPV-23 E2基因的PCR扩增每份马流产胎儿组织和人鼻拭子样品分别按1颐10(w/v)加入无菌PBS缓冲液低温震荡研磨，研磨液于4、12 000 g离心5 min，取200 滋L上清液6，利用Geneaid试剂盒提取马流产胎儿组织和人鼻拭子样品中的总DNA，田澍瑶，等.马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析第 11 期1189M:DL2000 DNA Marker;1-7:Amplification products of partial samples图1部分马流产胎儿组织样品HPV-23 E2基因的PCR检测结果并以其为模板，采用1.2中引物，经PCR扩增HPV-23E2基因，反应条件：94 2 min；94 20 s、55 20 s、72 30 s，共35个循环，72 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并对检测结果进行分析。1.4HPV-23 E2基因序列的同源性及遗传演化分析利用MegAlign7.1.0软件分析本研究鉴定的12株HPV-23 E2基因与GenBank中29株参考株E2基因的同源性；利用MEGA7.0.26软件采用最大似然法(Maxi-mum Likelihood methods)构建E2基因的系统进化树，步展值重复1000次进行评估。2结果与讨论2.1马源HPV-23 E2基因的PCR扩增及分析对伊犁的A场46份纯血马和B场367份伊犁马流产胎儿组织进行PCR检测，结果显示，A场46份纯血马中有2份肺组织样品呈HPV-23阳性，阳性率为4.3%(2/46)；B场367份伊犁马中有31份肺组织样品和3份脾组织样品呈HPV-23阳性，阳性率为9.3%(34/367)，部分结果见图1，表明不同品种马均携带HPV-23，且两个马场阳性率差异较大，其中伊犁马HPV-23阳性率高于纯血马，马是否是该病毒的自然宿主，尚需进一步对不同地域不同品种马进行全面的血清学和分子流行病学调查等验证。本实验在413份马流产样品中共检出36份HPV-23阳性样品，阳性率为8.7%(36/413)，提示马流产胎儿携带HPV-23。在36份阳性样品中包括33份肺组织及3份脾组织样品，阳性率分别为35.5%(33/93)、4.1%(3/74)，肺组织样品中HPV-23阳性率高于脾脏组织(表1)，这是否提示肺组织是该病毒主要侵害器官，还需进一步研究。本 研 究 首 次 在 马 流 产 胎 儿 样 品 中 检 测 到HPV-23，表明该病毒可能通过垂直传播导致母马流产，这一发现并不意 外，因 为先 前报道 BPV-1、BPV-2、BPV-4和HPV-11均可通过垂直传播导致牛和人流产12-13，但HPV-23能否导致马流产需进一步利用细胞培养法从阳性样品中分离病毒，并通过对孕马的攻毒实验来证实，但本研究结果提示在检测致马流产病毒性病原时应重视对HPV-23的检测。对B场工作人员鼻拭子样品进行PCR检测结果显示，20份马场工作人员HPV-23阳性率为60%(12/20)。目前国内仅在香港地区健康人口腔拭子样品中检出HPV-2314，本研究首次在新疆地区人群中检测到HPV-23，也是首次在人鼻拭子中检测到该病毒，表明HPV-23已存在于新疆地区人群中。本研究将鉴定的8株马源HPV-23根据地区及编号 分 别 命 名 为 XJ-YLZS-1、XJ-YLZS-2、XJ-YLZS-41、XJ-YLZS-G、XJ-YLZS-H、XJ-YLZS-T、XJ-YLZS-21-2、XJ-YLZS-A，将鉴定的4株人源HPV-23分别命名为YL-BY、YL-KS、YL-ME、YL-S。将经PCR扩增获得的12株HPV-23的E2基因测序后提交至GenBank，获 得 的 登 录 号 分 别 为：OP651991 OP651998、OP886905OP886908。2.2马源HPV-23 E2基因及氨基酸序列同源性分析利用MegAlign软件将本研究获得的8株马源和4株人源HPV-23 E2基因测序结果与GenBank登录的7表1样品信息样品数量Samplenumber11179998233914365676720433A场A farmB场B farm合计Total肺Lung胎盘Placenta肾Kidney脾Spleen肝Liver心脏Heart肺Lung胎盘Placenta脐带Umbilical cord胃Stomach肾Kidney脾Spleen肝Liver心脏Heart鼻拭子Nasal swab纯血马Thoroughbredhorse伊犁马Yili horse人HumanHPV-23阳性数Positive numberof HPV-232000003100003001248地点Location样品类型Sample type样品来源Sample source中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年11902000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234567株我国马源(MW855281-MW855287)、1株英国人源(KY652675)、1株德国人源(U31781)HPV-23病毒株、4种其他类型人源HPV和9种EcPV E2基因进行同源性分析，结果显示，本研究鉴定的12株HPV-23与7株我国马源HPV-23 E2基因和氨基酸序列的同源性分别为99.2%100%、97.5%100%，与2株国外人源HPV-23、4种其他类型人源HPV和9种EcPV E2基因序列的同源性分别为98.9%99.2%、42.9%53.8%，氨基酸序列同源性分别为98.3%99.2%、8.3%45.4%。其中，本研究中8株马流产胎儿组织样品中的HPV-23与4株人鼻拭子样品中的HPV-23 E2基因及氨基酸序列的同源性均为100%，提示本研究中的马源HPV-23可能来源于马场HPV-23阳性工作人员。PV具有高度的宿主特异性，理论上不跨种感染，但 目 前 已 有 研 究 表 明，HPV-23 与 BPV-1、BPV-2、BPV-13、HPV-18、HPV-115相似，是跨种感染马的人马共患病毒5-6,15-17，为避免马源HPV-23传播给人，尤其是马场工人，建议马场工人在处理流产胎儿时佩戴手套及口罩，做好防护。2.3马源HPV-23 E2基因的遗传进化分析以德国(U31781)、英国(KY652675)2株人源HPV-23、7株我国马源HPV-23(MW855281MW855287)、其他HPV和EcPV-1EcPV-9为参考株，采用MEGA7.0.26软件构建人源及马源HPV-23 E2基因遗传进化树，结果显示，本研究鉴定的12株HPV-23病毒株与7株我国马源病毒株、2株国外人源病毒株E2基因形成独立进化分支，并与HPV-22、HPV-38 E2基因同处于Bata进化分支；与HPV-16、HPV-18、9种EcPV亲缘关系较远，处于不同分支(图2)，进一步提示马源HPV-23可能由人传播至马。因茁-HPV经常存在于无症状的皮肤感染者中，可能为皮肤鳞状细胞癌(SCC)的病因18。无论在头颈部SCC患者的病灶还是在健康人群的口腔及眉毛中，HPV-23均是最常被检测到的茁-HPV类型6,10,19。此外，随着经济社会的快速发展，人民生活水平的不断提高，休闲骑乘、室内赛马及马术娱乐表演等越来越受到人们的青睐，使得人与马直接接触的机会不断增多，本实验室前期研究发现健康马鼻拭子也携带HPV-235。为防范马源HPV-23传染给人，对公共卫生安全构成威胁，建议人在接触马匹时，应加强个人卫生。本研究首次在马流产胎儿组织及人鼻拭子中检测到HPV-23，也是首次在新疆地区人群中检测到该病毒，对其E2基因进行遗传进化分析发现其可能来源于人。本研究为我国马产业的健康发展和HPV-23的流行病学研究提供参考了依据，为动物源HPV分子流行病学调查奠定了基础。参考文献：DELLA FERA A N,WARBURTON A,COURSEY T L,et al.Persistent human papillomavirus infection J.Viruses,2021,13(2):321.MARUR S,DSOUZA G,WESTRA W H,et al.HPV-associatedhead and neck cancer:a virus-related cancer 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期1191MW855283/HPV-23/WLMQ-G2/China/2020MF288893/EcPV-1/150904/Japan/2015MW855284/HPV-23/WLMO-G3/China/2020MW855282/HPV-23/YL-Y39/China/2020MW855281/HPV-23/CJ-Y31/China/2020OP651998/HPV-23/XJ-YLZS-A/China/2020OP651997/HPV-23/XJ-YLZS-21-2/China/2020OP651996/HPV-23/XJ-YLZS-T/China/2020OP651995/HPV-23/XJ-YLZS-H/China/2020OP651994/HPV-23/XJ-YLZS-G/China/2020OP651993/HPV-23/XJ-YLZS-41/China/2020OP651992/HPV-23/XJ-YLZS-2/China/2020OP651991/HPV-23/XJ-YLZS-1/China/2020OP886908/HPV-23/YL-S/China/2020OP886907/HPV-23/YL-ME/China/2020OP886906/HPV-23/YL-KS/China/2020OP886905/HPV-23/YL-BY/China/2020MW855287/HPV-23/WLMO-G11/China/2020MW855285/HPV-23/WLMQ-G4/China/2020KY652675/HPV-23/Lancaster/UK/2015U31781/HPV-23/Germany/1995MW855286/HPV-23/WLMO-G8/China/2020U31780/HPV-22/Germany/1995U31787/HPV-38/Germany/1995NC001526/HPV-16/USA/2016NC001357/HPV-18/USA/2000KU963288/EcPV-8/NCSU/USA/2015MW410987/EcPV-7/XJ-ZS1/China/2020JX035935/EcPV-7/Switzerland/2011JO965698/EcPV-6/Sirkar-2011/Germany/2011GU384895/EcPV-3/Haflinger/Switzerland/2009NC012123/EcPV-2/2018AF394740/EcPV-1/USA/2002AF498323/EcPV-1/USA/2016MN164462/EcPV-1/G2/China/2019JQ031033/EcPV-5/Switzerland/2013JO031032/EcPV-4/Switzerland/2013MN117918/EcPV-9/SW/Australia/2018HM461973/EcPV-2/Zurich-2009/Switzerland/2009EU503122/EcPV-2/UK/2009MW410986/EcPV-2/XJ-KS1391/China/2020DyoiotapapillomavirusZatapapillomavirusDyorhopapillomavirusAlphapapillomavirusTreiskappapapillomavirusBatapapillomavirus0.102021,51:111-118.贾陈阳，佟盼盼，宋小珍，等.马源人乳头瘤病毒23型的鉴定及遗传进化分析J.中国预防兽医学报，2022，44(3)：329-332.帕丽旦努尔兰，佟盼盼，宋小珍，等.马源人乳头瘤病毒115型E6 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