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两株肿瘤细胞系HLAI类分子基因表达水平的鉴定及意义
【摘要】　目的 探讨两株常见肿瘤细胞系Hela细胞和BEL7402细胞HLAI类分子基因表达水平及其 影响 CTL反应性的可能意义。 方法　提取肿瘤细胞的基因组DNA，利用PCR反应在基因组水平鉴定HLAI类分子基因的拷贝数情况；提取细胞总RNA， RTPCR反应合成cDNA，利用PCR反应鉴定肿瘤细胞HLAI类分子在RNA水平的表达情况。结果 两株肿瘤细胞的HLAI类基因在基因组水平的拷贝数无明显下降；在RNA水平上，Hela细胞的HLAA、HLAB和HLAC基因均有表达，表达水平无明显下降，BEL7402细胞的HLAA和HLAC基因有表达，但HLAC基因表达水平降低，而HLAB基因未见明显表达。 结论 RNA水平上，部分HLAI类分子基因表达的降低或缺失推测可能是导致BEL7402细胞比Hela细胞出现CTL反应性下降的原因之一。
【关键词】　HLAI类分子；Hela细胞；BEL7402细胞；mRNA
　　Abstract:Objective To investigate the expression level of HLAI molecule genes in two tumor cell lines, Hela and BEL7402 and the possible significance of CTL　Genome DNA were extracted from these two tumor lines for detecting the HLAI molecule genes′ levels by　RNA from two cell lines were extracted for RTPCR, HLAI molecule genes′expression on RNA level were judged by PCR and agarose gel　HLAI molecule genes levels did not decrease significantly on genome　RNA level, HLAA, HLAB and HLAC all expressed normally without significant descent in Hela cell line. The　expression of HLAA and HLAC were both detected in BEL7402 cell line, but the expression of HLAC gene showed significant decease, and no expression of HLAB gene were detected on RNA　At RNA level, reduction or absence HLAI molecule genes′ expression of Hela cell line were not found, however, the partial descent and absence of HLAI molecule genes′ expression in BEL7402 cell line was the possible reason for the reduction of CTL reaction.
　　Key words:HLAI molecule；Hela cell line ；BEL7402 cell line；mRNA
　　人类主要相容性复合物，又称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系统，位于第6号染色体短臂约［1］，按功能差别可大致分为HLAI类分子和HLAII类分子两大类，其中HLAI类分子在机体的细胞免疫中发挥重要作用。 研究 发现，抗肿瘤免疫的是机体针对肿瘤的细胞免疫反应，其中CD8+CTL细胞必需依靠肿瘤自身HLAI类分子呈递的肿瘤抗原才能得以活化发挥杀伤作用。但由于肿瘤细胞的遗传不稳定性，会导致HLAI类分子的表达下降或缺失，是引起肿瘤免疫耐受形成的重要原因［2, 3］。因此，了解肿瘤细胞的HLAI类分子表达情况对研究如何打破免疫耐受，开展过继性细胞学 治疗 十分必要。在前期通过CTL杀伤实验的研究中发现，CTL对本室保藏的人宫颈癌细胞Hela的杀伤活性要高于人肝癌细胞株BEL7402(结果未)，为探讨此现象的发生是不是涉及到了肿瘤细胞HLAI类分子基因的表达变化，本文在基因组水平及RNA水平对两株肿瘤细胞的HLAI类分子基因的表达情况进行了鉴定 分析 ，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1．1 细胞

　　Hela细胞、BEL7402细胞均为广东药学院生物制药研究所保藏，健康人外周血由广州市血液中心提供，用人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。
　　1．2 主要试剂与仪器
　　RPM1640培养基、胎牛血清购置Gibico公司；T4连接酶、MMLV反转录酶、Taq酶、dNTP、RNasnhibitor、Oligod T均购自Fermentas公司；Trizol 0020购自Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；DNA Marker DL 2000、100购自Biotech公司，基因组DNA提取试剂盒购自Pearl公司；PCR仪；电泳仪；凝胶成像系统。
　　1．3 细胞基因组DNA的提取
　　收集传代培养24 h的Hela细胞和BEL7402细胞，细胞数约为2×106，按照基因组DNA提取试剂盒的使用说明进行操作，将提取获得的DNA进行%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按相同方法，提取健康人外周血单个核细胞的基因组DNA作为对照。
　　1．4 PCR反应鉴定基因组水平HLAI基因的拷贝数情况

　　根据GenBank中已公布的人HLAI类基因HLAA、HLAB和HLAC核酸序列，共设计3对通用PCR反应引物，并设计1对针对GAPDH基因组序列的内参引物，委托广州英骏公司合成，4对引物序列具体为：
　　PGA1:5′cctctgyggggagaagcaa3′，PGA2:5′gac tcagaagtgctggactc3′；
　　PGB1:5′gggaggagcgaggggaccscag3′，PGB2:5′ggaggccatccccggcgacctat3′；
　　PGC1:5′agcgaggkgcccgcccggcga3′，PGC2:5′ggagatggggaaggctccccact3′；
　　PGG1:5′aaggtcggagtcaacgg3′，PGG2:5′atc tcgggcgggaatag3′
　　用50 μL反应体系进行扩增，其参数为：95 ℃预变性3 min后，按95 ℃ 25 s、60 ℃ 30 s、72℃ 80 s进行8个循环反应，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s进行30个循环反应，最后延伸7 min。PCR产物经%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。
　　1．5 RTPCR反应鉴定RNA水平HLAI基因的表达情况

　　分别收集3×106Hela细胞、BEL7402细胞及健康人外周血单个核细胞，按 Trizol Reagent使用说明进行抽提细胞总RNA，以RNA为进行逆转录PCR反应，反应体系中加入10 mmol/L的dNTPs 2 μL、RNasnhibitor 20 U、OligodT　μg、RNA模板6 μL、5×Buffer 8 μL、MMLV逆转录酶200 U，加无菌去离子水至终体积40 μL。混匀后42 ℃反应60 min，最后90 ℃5 min灭活MMLV活性，4 ℃保存合成的cDNA。

　　扩增HLAA、B、C 3个基因及内参GAPDH基因的引物均由Invitrogen公司合成。具体序列
　　PRA1:5′gacgacacgcagttcgtgc3′,PRA2：5′ttg gaccgcggcggacatg3′；
　　PRB1：5′accagagcgaggccgggt3′，PRB2：5′ctg gaccgccgcggacac3′；
　　PRC1：5′cgccgcgagtccgagagg3′，PRC2：5′ctg gaccgccgcggacac3′；
　　PRG1：5′aggtcggagtcaacggatttg3′，PRG2:5′gtg atggcatggactgtggt3′
　　用50 μL反应体系进行扩增，其参数为：94 ℃预变性3 min，按94 ℃ 60 s，55℃ 40 s，72℃ 60 s进行35个循环反应。
　　2 结果
　　2．1 基因组DNA的提取鉴定

　　%的琼脂糖凝胶电泳结果显示试剂盒法提取的Hela细胞、BEL7402细胞及健康人PBMC基因组DNA条带明亮，无明显托尾，能满足作为PCR反应扩增的需要，见1。
　　marker;　of healthy people;　cell; 7402 cell
　　图1 基因组DNA凝胶电泳
　　Gel electrophoresis analysis of genome DNA
　　2．2 HLAI类基因在基因组水平拷贝数情况的鉴定

　　利用特异性PCR引物进行PCR反应检测基因组水平HLAI类基因的拷贝数情况，结果见图2，Hela细胞和BEL7402细胞的HLAI类基因在基因组水平的表达与健康人PBMC无明显差别。
　　2．3 细胞总RNA提取鉴定
　　从Hela细胞和BEL7402细胞中，提取出总RNA， 1%琼脂糖电泳鉴定 。结果显示提取的总RNA有3条带，从上至下分别为28 s，18 s，5 s，其中18 s和28 s这2条带的RNA亮度明显高于5 s带，证明RNA降解较少，所提取RNA质量较高，能满足下一步RTPCR反应的需要，见图3。
　　marker; A gene of healthy people; A gene of Hela; A gene of BEL7402; B gene of healthy people; B gene of Hela; B gene of BEL7402; C gene of healthy people; C gene of Hela; C gene of BEL7402;　gene of healthy people;　gene of Hela;　gene of BEL7402.
　　图2 基因组水平HLAI基因PCR结果
　　PCR Results of HLAI gene at genome level
　　cell 7402 cell
　　图3 肿瘤细胞RNA凝胶电泳图
　　Gel electrophoresis of the RNA of tumor cells
　　2．4 HLAI类基因在RNA水平上的表达情况
　　2．4．1 Hela细胞HLAI类基因的表达 以Hela细胞cDNA为模板，进行HLAI类基因的PCR扩增，2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示Hela细胞HLAA、HLAB和HLAC 3基因都扩增出比较明亮的DNA条带，对照组健康人PBMC无明显差异，见图4中2,5,8,11泳道。
　　2．4．2 BEL7402细胞HLAI类基因的表达 利用2%的琼脂糖凝胶电泳对BEL7402细胞HLAI类基因扩增情况进行鉴定，结果显示HLAA基因的扩增条带较明亮与对照组无明显差别，HLAC基因的扩增条带亮度较对照组有明显的降低，而HLAB基因未见DNA条带扩增出来，见图4中3，6，9，12泳道。
　　3 讨论

　　人类主要相容性复合物，又称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系统是一个很大的基因家族，在脊椎动物适应性免疫应答中起关键作用。在机体的肿瘤免疫应答过程中，HLAI类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)发挥着重要作用，肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要涉及到MHC抗原肽TCR三原体结构的生成［4］。
　　marker; A gene of healthy people; A gene of Hela; A gene of BEL7402; B gene of healthy people; B gene of Hela; B gene of BEL7402; C gene of healthy people; C gene of Hela; C gene of BEL7402;　gene of healthy people;　gene of Hela;　gene of BEL7402.
　　图4 RNA水平HLAI基因PCR结果
　　PCR Results of HLAI gene at RNA level　　

　　HLAI类分子的表达异常是发生肿瘤免疫逃逸，形成免疫耐受的重要机制。 研究 发现，在很多肿瘤细胞中都存在着HLA基因丢失或表达下调的现象。有研究利用免疫组化检测证实，25％～75％的恶性肿瘤细胞有不同形式的HLAI类分子表型改变，从 HLAI类分子阳性上皮细胞衍生的肿瘤细胞中，39％～88％存在 HLAI类分子的表达下降或丢失，而正常细胞均表现为 HLAI类分子阳性。以上数据证明肿瘤细胞的HLAI类分子的表达降低或缺失是恶性肿瘤的一个较为普遍的病理性改变，是肿瘤区别正常组织的一项重要指标［5］。

　　在前期研究中，我们利用CTL对人卵巢癌细胞株Hela细胞和人肝癌细胞株BEL7402细胞进行细胞杀伤活性实验，MTT及细胞因子释放等结果证实Hela细胞表现出比BEL7402细胞更高的CLT反应性,为了证实肿瘤细胞HLAI类分子基因表达的下降或缺失是否是导致这种CTL反应差异性的原因，本研究主要从基因组和RNA两个水平，探讨这两株肿瘤细胞HLAI类分子基因的表达情况。利用特异性引物PCR反应的 方法 ，证实在基因组水平上，Hela细胞和BEL7402细胞的HLAI类分子基因的拷贝数与健康人PBMC无明显差别。在RNA水平上，Hela细胞HLAI类基因的转录水平与健康人细胞相比无明显下降；BEL7402细胞HLAA基因的转录水平也无明显降低，但其HLAB和HLAC基因的表达出现明显变化，HLAC基因的转录水平较对照组明显降低，而HLAB基因的转录产物不能用RTPCR的方法检测到，表现为表达的完全缺失。以上研究结果证实，RNA水平上BEL7402细胞的HLAC基因表达降低和HLAB基因表达缺失，而Hela细胞未出现明显的HLAI 类分子表达降低和缺失，这可能是BEL7402细胞发生免疫逃逸，引起CLT反应性下降的原因之一［6］。

　　本研究从基因组和RNA两个水平验证了2株细胞的HLAI 类基因表达情况，有些肿瘤发生的HLA表达异常可能存在于HLAI类分子蛋白合成阶段［7］，因此，要更全面地了解肿瘤细胞HLAI 类基因的表达情况，还需要在HLA分子蛋白表达水平上进行进一步检测。

【 参考　文献 】
　　［1］ CAMPOLI M, CHANG C C, FERRONE　class I antigen loss, tumor immune escape and immune selection［J］.Vaccine, 2002, 20:40.
　　［2］ KASS R, BELLONE S, PALMIERI M, et　of tumorspecific HLA class I restricted cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes of advanced breast cancer patients by in vitro stimulation with tumor antigenpulsed autologous dendritic cells［J］.Breast Cancer Res Treat, 2003, 80(3): 275.
　　［3］ JON A, WDANZ, TIFFANY N, et　of specific peptideHLA class I complex predicts tumor cell susceptibility to CTL killing［J］.J Immunol, 2006, 177: 5088.
　　［4］ WILLIAMS A, PEH C A, ELLIOTT T. The　cell biology of MHC class I antigenpresentation ［J］.Tissue Antigens, 2002, 59:3.
　　［5］ CABRERA T, MALENO I, COLLADO A, et　of HLA class I alterations in tumors: choosing a strategy based on known patterns of underlying molecular mechanisms［J］.Tissue Antigens, 2007, 69(1): 264.
　　［6］ SAVAGE P, COWBURN P, CLAYTON A, et　of viral and tumour specific CTL responses using antibody targeted HLA class I peptide complexes［J］.Br J Cancer, 2002, 86(8): 1336.
　　［7］ RODRIGUEZ T, APTSIAURI N, MENDEZ R, et　mechanisms can lead to the same altered HLA class I phenotype in tumors［J］.Tissue Antigens, 2007, 69(Suppl 1): 259.