钩吻的研究应用进展袁志航.doc

钩吻研究进展袁志航1，邬静1，孙志良1*（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）摘要：近些年来对钩吻研究重要集中在钩吻生物碱提取、分离、纯化及构造研究，毒理作用重要抑制呼吸中枢，作用于迷走神经；并对钩吻生物碱促生长作用进行了初步探讨。但对钩吻生物碱促生长作用机理在国内外尚未见报道。本文结合国内外研究现状，系统归纳总结了近年钩吻研究应用状况，并对钩吻生物碱对动物促生长作用发展前景进行了探讨。核心词：钩吻 毒理 动物 促生长Research and Development on Gelsmium elegans BenthZ H Yuan收稿日期：作者简介：袁志航（1984），男，博士在读，研究方向为兽医临床药学。Tel： E-mail：*通讯作者 孙志良，男，博士，专家，博士生导师，重要从事中兽药新制剂研究。Tel： E-mail：，Z L Sun1*(1.College of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University. Hunan，ChangSha,410128,China )Abstract：Of recent years，the studies on Gelsemium elegans Benth focused on the extraction，separation and purification；The main toxicological effects is inhibition of the respiratory center，act on vague nerve. And the promote growth of Gelsemium elegans has carried on the preliminary discussion. But the Mechanism of promote growth caused by the gelsmium elegans have none report. In this paper，recent research and applications of the gelsemium elegans benth have been summarized. The principle of promote growth and development prospects were also discussed.Key words：Gelsemium elegans benth；toxicological；promote growth;钩吻为马钱科植物胡蔓藤全草，知名剧毒植物。当前为止，钩吻在人用医药方面用途国内外已经进行了广泛研究。19世纪70年代，钩吻初次被报道；1887年H Gerrad将其制成格林制剂，并成为法定制剂，为某些国家副药典所收载；钩吻依照其产地不同分为两类，一是主产地在美洲美洲钩吻（G.sempervirens Ait），此外就是主产地在亚洲，特别是中华人民共和国浙江、福建、广东、广西、湖南、贵州、云南等地中华人民共和国钩吻（Gelsemium elegans Benth）。国内钩吻研究历史悠久，神农本草记载钩吻主金疮、乳痛、中恶风、咳逆上气，鬼；国内民间因其毒性大，始终外用为主，能消肿拔毒、杀虫止痒；近年来，国内外专家们对钩吻研究又有了新进展，发现钩吻发挥药理作用重要成分为钩吻生物碱。并对钩吻生物碱进行了提取、分离、纯化及构造研究，从器官水平和细胞水平对钩吻生物碱毒性进行了分析，并对钩吻生物碱促生长作用进行了初步探讨。但对钩吻生物碱安全性评价程序及毒性作用机制，增进动物生长效能综合评价和促生长作用机理，特别是钩吻生物碱对猪肠道屏障功能影响及作用机制在国内外尚未见报道。1钩吻化学成分研究国内外始终在进行钩吻化学成分研究，随着研究不断进一步，从钩吻中分离提纯化学成分越来越多，中华人民共和国钩吻重要化学成分为吲哚类生物碱，涉及胡蔓藤碱甲、乙、丙、丁和钩吻素子、甲、寅、卯、辰、丙、丁、戊、己、庚等17种单体，其单体毒性大小不同，除生物碱外钩吻中还具有甾体和环烯醚萜等非生物碱类成分1。1.1钩吻生物碱钩吻通过醇提法可以得到钩吻生物总碱，进一步分离提纯可以得到钩吻碱单体，当前已经从钩吻总碱中分离出单体成分重要有如下几种。钩吻素子（koumine）：分子式为C20H22ON2,熔点是169-170.5，钩吻中含量最高但毒性较低一种生物碱，可以治疗神经性疼痛，抑制神经胶质瘤细胞U251生长抑制及诱导凋亡作用，可以抑制小鼠H22实体瘤；钩吻素子还具备抗应激作用，也许与抗脂质过氧化关于。钩吻素子可以调节CD4+T细胞Th细胞因子分泌，这种调节作用也许是治疗银屑病等T细胞活化异常炎症性疾病免疫药理机制之一2,3,4。钩吻素甲（gelsemine）：1870年初次分离得到无定形钩吻素甲，1883年得到钩吻素甲结晶，1959年才拟定其复杂构造。分子式为C20H22N2O2，熔点为1785。钩吻素甲可以激活脊髓甘氨酸受体3，在慢性疼痛中体现出强有力镇痛作用6；从亚洲钩吻提取钩吻生物总碱中含量最高为钩吻素子，另一方面为钩吻素甲；除这两种单体成分外钩吻中还具有胡蔓藤碱甲、乙、丙、丁；钩吻素乙，钩吻素卯，分子式为C19H22O3N2，熔点为171-173一种水溶性生物碱钩吻素己（gelsenicine）。最开始是从美洲钩吻中提获得到，中华人民共和国钩吻在1961才分离提取到钩吻素丁（koumicine），分子式为C21H2203N2，熔点为252-254。钩吻素丙（sempervirine）19初次从美洲钩吻得到，1959年从中华人民共和国钩吻中分离出，分子式为C19H16N2，熔点为258-2607。2钩吻分离提取由于生物碱构造类型丰富，理化性质差别较大，因而不同生物碱需要采用不同提取办法；老式生物碱提取办法普通是浸渍、回流、渗鹿、煎煮等办法，这些办法本质上都属于溶剂法；随着当代分离技术飞速发展，某些新办法也应用到生物碱提取工艺中来，如超声辅助提取技术，微波辅助萃取技术，超临界流体萃取技术等，这些当代提取技术应用，有望解决老式提取过程中存在能耗大、污染重、杂质多、效率较低等问题；因而这些优势明显新办法也成为当今分离技术研究热点。徐坚等从提取工艺、周期、产率和总碱纯度等方面比较了醇提法（95%乙醇）、酸提法（0.5%H2SO4）、离子互换树脂法和氯仿热提法等四种钩吻生物总碱提取法，成果显示离子互换树脂法提取总碱纯度最高，氯仿热提法次之；四种办法提取率分别为醇提法0.76%，酸提法0.725%，离子互换树脂法1.039%，氯仿热提法1.325%8；运用pH值逆流色谱法可以分离提取大量钩吻碱9。陈竞峰等采用95%乙醇和氯仿两种溶剂对钩吻进行回流热提，两者提取率分别为0.52%和0.46%10。不同办法提取钩吻总碱得率都不尽相似，影响植物成分提取因素诸多，除溶剂种类、取材部位之外，尚有季节、粉末粒度、温度、时间、溶剂用量及浓度、提取办法诸多因素。这些因素不是互相独立，而是交织一起共同在提取过程中起作用。因而，只有进一步摸索各种因素优化组合，才干获得最佳提取效果。3钩吻毒理作用钩吻又名断肠草，世界剧毒植物，全株有毒，根和叶毒性最大，花蜜腺有毒，人误服极易死亡。中毒症状：神经系统重要症状有眩晕、言语含糊、肌肉松弛无力、吞咽困难、呼吸肌麻痹、共济失调、昏迷，还可见复视、散瞳、眼脸下垂等。消化系统症状有口腔、咽喉灼痛，恶心、呕吐、腹痛、腹泻或便秘、腹胀等11；循环和呼吸系统症状为中毒初期心跳缓慢，呼吸快而深，继之心搏加快、呼吸慢而浅、不规则，渐至呼吸困难和麻痹，体温及血压下降、四肢冰冷、面色苍白、虚脱，最后呼吸麻痹而死亡12。对迷走神经中枢抑制作用可适量应用阿托品对抗；对抑制运动神经元而引起肌麻痹，可用新斯明予以解除；血液灌流及血液透析可清除水溶性药物，特别是游离或解离小分子毒物13。急性毒性实验证明：小鼠在低剂量作用下（5mg/kg）体现为活动减少、静伏、精神沉郁；而在中高剂量（5mg/kg）下体现为阵发性惊厥、呼吸困难，最后呼吸衰竭而死亡14。半数致死量LD50，雄大鼠（26544g）腹腔给药为1.2mg/kg；雌性小鼠（223g）静脉注射为1.56mg/kg；小鼠尾静脉注射为3.07mg/kg。肌肉注射LD50为3.60mg/kg10。钩吻毒性重要来源于吲哚类生物碱，钩吻素己毒性最强，腹腔注射LD50为0.185mg/kg，北美钩吻则以钩吻素乙毒性最强，皮下或腹腔注射LD50为0.1-0.3mg/kg15。4钩吻药理作用及临床应用近年来人们对钩吻药理作用研究，重要集中在抗肿瘤、抗炎镇痛、免疫调节、对心血管系统作用、造血保护作用、扩瞳作用等；研究表白钩吻可抑制人神经胶质瘤细胞株U251生长，诱导凋亡16。钩吻抗肿瘤作用还可体现为对肿瘤细胞DNA合成期及G2-M期阻滞。研究表白对人结肠癌L0V0细胞作用重要是通过抑制DNA合成，制止细胞有G1期向S期转化而诱导凋亡17。钩吻总碱解决HepG2肝癌细胞DNA直方图有明显亚二倍体峰，提示钩吻总碱对肝癌细胞HepG2生长抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡关于 18。5钩吻促生长作用钩吻对人毒性很大，据报道，人内服钩吻茎叶10g或根28g或嫩芽1038个即能引起中毒19。然而，钩吻却对某些动物不显示其毒性。本草纲目曾记载，人误食钩吻叶者致死，而羊食钩吻则大肥。猪羊食用钩吻不但无毒，并且尚有令其毛泽光润，增肥之效。对钩吻进行了畜禽复壮及促生长作用实验研究。张雄等采用具有1%、2%钩吻粉日粮饲喂肉鸡，分别提高肉鸡体重5.46%、10.75%，同步减少料肉比4.66%、7.89%；20。1994年刘道荣等报道表白，在生猪饲喂过程中，每50kg饲料添加钩吻粉g大剂量组比不添加钩吻粉对照组多增重11.6kg，增重效果明显21。而大量研究则显示植物提取物促生长作用与肠道屏障和促生长激素分泌密切有关，郭航等（） 报道，小肠绒毛高度和隐窝深度是衡量小肠消化吸取功能重要指标，小肠发育越完善，越有助于营养消化吸取22。隐窝深度反映了细胞生产率，隐窝变浅，表面肠上皮细胞成熟率上升，分泌功能增强23;肠道微生物构造体系对鸡生长性能和免疫功能有着深远影响，动物消化道微生物区系平衡对宿主消化吸取、制止病原菌入侵和增强机体免疫有重要作用，因此调控消化道微生物区系稳定是保证动物健康生长重要手段 24；田允波等报道，在饲料中添加天然植物提取物可以提高血清中生长激素、类胰岛素生长因子，增进生猪生长25。因而，咱们推测钩吻生物碱促生长作用也与肠道屏障和生长激素分泌密切有关。6.肠道屏障与钩吻中草药饲料添加剂以其特有纯天然性以及功能广泛，无残留、无耐药性等独特优势，满足了人类对绿色纯天然饲料添加剂规定，逐渐成为了研究者们关注热点问题。但是由于中草药自身成分复杂性等因素，导致在兽医研究领域对其促生长作用机理进行研究报道较少。国内外对中草药增进动物生长机制研究重要集中对肠道屏障保护及修复作用，对动物体内生长有关激素分泌增进作用，对动物免疫调节作用，对动物炎症反映抑制作用等方面。肠道屏障功能是指肠道具备将肠道内物质与机体内环境分隔开，防止肠道内致病性抗原和有毒有害物质侵入生物学功能。肠道屏障功能维持与肠黏膜上皮屏障、肠道免疫屏障、肠道内正常微生物区系分布关于，其对机体营养功能十分重要。6.1肠黏膜上皮屏障肠道黏膜是营养物质消化吸取重要器官，也是动物机体内最大保护屏障，可以制止肠道内有害病原和抗原物质侵入，保护动物健康。肠黏膜上皮屏障又被人为分为物理屏障和化学屏障。肠道物理屏障重要是指细胞屏障，涉及健康、完整肠道上皮细胞、细胞间紧密连接、正常细胞周转能力和活动能力，其中肠上皮细胞及细胞间紧密连接是物理屏障重要决定因素26。肠黏膜表面肠绒毛上细胞重要有两类，即吸取细胞和杯状细胞。吸取细胞是具备吸取功能柱状细胞，是构成小肠上皮重要细胞。相邻吸取细胞之间形成紧密连接，对细胞间隙起到封闭作用，可以有效防止肠腔内物质经细胞间隙穿过上皮细胞层，防止肠腔内细菌、毒素及炎症介质渗入到周边组织，维持肠道正常功能27。6.2肠道屏障与正常生态区系 动物肠道寄居这10131014个细菌，其中99%为专性厌氧菌。当前肠道微生物对肠道和机体健康作用越来越受到注重。在正常状况下，肠道内微生物数量、分布相对恒定，形成一种微生物与肠上皮互相依赖、互相作用微生态系统，对肠道屏障起着重要保护作用28。6.3肠道免疫系统作为动物体最大免疫器官之一，免疫屏障是制止细菌入侵第一道防线。肠道免疫屏障又分为系统免疫和局部免疫。系统免疫重要指血液循环中淋巴细胞和肝脏Lupffer细胞。局部免疫系统是指存在于肠壁中肠有关淋巴组织及其分泌免疫球蛋白，如IgA、IgM、IgE等29。肠壁中肠有关淋巴组织重要以两种形式存在：一种是组织化淋巴细胞，一种是呈弥散分布淋巴细胞组织，重要指肠道黏膜固有层淋巴细胞和上皮内淋巴细胞。6.4植物提取物与肠道屏障功能 近年研究表面：中草药等植物提取物作为新型添加剂在防止动物腹泻和维持肠道功能紊乱中发挥着越来越重要作用。在肠道炎症状况下，槲皮素能通过提高紧密连接蛋白claudin4表达量来增强肠道屏障功能30。小檗碱可以通过改进肠道形态构造、增强肠黏膜免疫能力、发挥抗菌机制来缓和脂多糖诱导损伤作用31。但是,植物提取物在用作饲料添加剂时有时效果很不稳定。这也许与其活性成分构成、含量和不同活性成分派比差别关于。同步植物提取物是非常复杂混合物,明确其发挥活性作用有效成分及分子机理将无疑会大大加速植物提取物应用,充分发挥其保护肠道屏障功能作用32。7.研究展望钩吻生物碱对人毒性强，被以为是已发现生物碱中毒性最大，导致其应用受到限制，但由于种属差别性，恰当剂量钩吻总碱对动物不但无毒，并且有较好促生长作用，因此，探明其对动物作用机制，可觉得钩吻总碱开发与应用提供重要理论根据；肠道等肠道屏障作为动物机体最大保护屏障，保护其功能完备性对动物健康至关重要，在养猪生产中，由于营养、疾病、环境等因素会损伤肠道黏膜，继而发生一系列不良反映，阻碍肠道屏障功能发挥。如何合理使用营养素保证肠道健康是将来养殖业生产挑战。后来研究应当会更多关注中草药添加剂如植物提取物在保护和修复肠道屏障功能中重要作用。养殖业中，合理使用植物源性兽药添加剂可以保证动物肠黏膜生长发育，防止和修复肠道屏障功能损伤，增进养殖健康可持续发展。参照文献1张可，卢桂森，等.钩吻中毒病例分析J.广西卫生 1974（5）：62-642王志睿，张兰兰，黄昌全，等.粤东产钩吻生物碱提取物红外光谱与核磁共振谱分析J.第一军医大学学报，25（1）：54-563 王志睿，张忠义，黄昌全，等.钩吻素子对小鼠CD4+T淋巴细胞Th1类及Th2类细胞因子分泌影响J.中药材，28（8）693-695.4张兰兰，王志睿，黄昌全，等.钩吻总生物碱中钩吻素子提取与分离J.第一军医大学学报，24（9）：106-1008.5杨俊山，陈玉武.胡蔓藤生物碱化学研究构造测定J.药学学报，1984，19（5）：399.6 Zhang JY，Gong N,Huang JL,et al.Gelsemine，a principal alkaloid from Gelsemium sempervirens Ait.，exhibits potent and specific antinociception in chronic pain by acting at spinal 3 glycine receptorsJ.The Journal of Pain.,154(11):2452-2462.7Saxton J.E,In “The Alkaloids,Vol 8”(ed.Manske.R.H.F).83-119,Academic press，New York London,(1973).8徐坚，梁崇真.钩吻总生物碱提取办法比较J药学通报，1988，23（6）：341-342.9Fang L，Zhou J，Lin Y et al. Large-scale separation of alkaloids from Gelsemium elegans by pH-zone-refining counter-current chromatography with a new solvent system screening methodJ. Journal of chromatography.A,1307:80-85.10 陈竟峰，袁慧.钩吻总碱提取、分离、鉴定及普通毒性J.湖南农业大学学报（自然科学版），29（5）：423-424.11游世伦，练志方.钩吻中毒急救13例J.中华全科医师杂志，3（4）：280.12朱丽辉.2例钩吻中毒护理J.南华大学学报，29（5）：533.13杨仓良.毒药本草M.北京：中华人民共和国中医药出版社，1993：1049-1050.14谭建权，邱成之，郑林忠.钩吻碱镇痛作用和无依赖性J.中药药理与临床，1988，4（1）：24-28.15易金娥，袁慧.钩吻毒素研究进展J.湖南环境生物职业技术学院学报，8（4）：26-3016 吴达容，秦瑞，蔡晶，迟德彪.钩吻素子抗肿瘤作用研究J.中药药理与临床,22(5),6-8.17 迟德彪，金金宏，庞建新，等.钩吻素子体外诱导人结肠腺癌LoVo细胞凋亡实验研究J.第一军医大学学报，23（9）911-913.18高明雅，沈伟哉，吴颜晖等.钩吻生物碱单体对肝癌细胞体外抑制作用机制初步研究J. 中药材，35（3）438-439.19洪息君.断肠草不同部位毒性研究J.药学通报，1983，18（12）:62.20 张雄，袁慧，文利新.钩吻干粉对肉鸡增重实验研究J湖南农业大学学报（自然科学版），29：70-7121刘道荣，黄泰康，王友顺等.猪人参喂猪实验研究J.畜牧与兽医，1994，26（2）：67-68.22郭航，王水军，谢鹏等.日粮添加二氢杨梅素对肉仔鸡肠黏膜形态构造、碱性磷酸酶及生产性能影响J中华人民共和国饲料，6：19-20.23Ewtushik A L,Bcrtolo R F P,Ball R O.Intcstinal dcvclopmcnt of carlywcancd pigletsJ.Canadian Journal of Animal Science,80:653-662.24高俊勤，江芸，张耀等.木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物影响J.草业学报，17（5）：104-108.25田允波，葛长荣，高士争.天然植物提取物对生长猪促生长作用及其内分泌机制研究J.饲料及饲养实验，7：40-41.26 Turner JR. Intestinal mucosal function in health and disease. Nat Rev Immunol,9:799-809.27 Marchiando AM，Graham WV，Turner JR，Epithelial barriers in homostatsis and diseaseJ. Annu Rev Pathol,5:119-14428BaumgartDC.，Dignass，AU. Intestinal barrierfunetionJ. Currop in Clin Nutr Metab Care，,5:685-694.29Mantis NJ，CheungMC，Chintalacharuvu KR. Seleetive adherence of IgA to murine peyers pathch M eells：evidence for novel IgA reeeptorJ. Journal Immunol，,169:1844-1851.30Han z，Wang G，Yao W,et al. Isoflavonic phytoestrogens-new prebiotics for farm animals:a review on research in ChinaJ. Curr Issues Intest Mierobiol,7:53-60.31Amasheh M，et al. Quercetin enhances epithelial barrier function and increases claudin-4 expression in Caco-2 cellsJ. Journal Nutr,138:1067-1073.32ZhangQ，et al. preventive effect of Coptis chinensis and berberine on intestinal injury in rats challenged with liPopolysaccharidesJ. Food Chem Toxicol，,49:61-69.