正向间接血凝试验教案.ppt

正向正向间间接血凝接血凝试验试验省疫控中心周迎春1.主要内容主要内容l背景背景l原理原理l实验实验器材的器材的优优化化l试剂试剂的的优优化化l样样品的品的优优化化l实验过实验过程程优优化化l判定判定标标准准l注意注意问题问题2.一、背景一、背景l正向正向间间接血凝接血凝试验试验(IHA)是上世是上世纪纪 60 年代在我年代在我国国发发展起来的血清学展起来的血清学诊诊断技断技术术，是一种用已知，是一种用已知抗原抗原检测检测未知抗体的未知抗体的试验试验方法，它的操作方法方法，它的操作方法相相对简单对简单，实验实验原理也易于理解，在基原理也易于理解，在基层实验层实验条件和技条件和技术术相相对对落后的情况下落后的情况下经经常被常被应应用到，用到，在一些在一些动动物疫病的免疫抗体物疫病的免疫抗体检测检测、疫病、疫病诊诊断上断上具有具有现实现实意意义义。l林琳等研究表明林琳等研究表明应应用猪瘟正向用猪瘟正向间间接血凝法接血凝法(IHA)与斑点与斑点酶酶联联免疫吸附免疫吸附试验试验（dot-ELISA）以及）以及猪瘟抗体免凝金猪瘟抗体免凝金标试纸标试纸条比条比较较，对规对规模化养猪模化养猪场场 138份不同份不同阶阶段猪血清段猪血清进进行行检测检测，三种方法，三种方法检测检测抗体的阳性率抗体的阳性率结结果接近。果接近。3.一、背景一、背景l数十年来正向数十年来正向间间接血凝接血凝试验试验技技术术不断完善，它不断完善，它具有具有简单简单、经济经济、快速、快速、实实用的特点，在我国用的特点，在我国有很大的用有很大的用户户群，近年来，群，近年来，兰兰州州兽兽医研究所生医研究所生产产的液体猪瘟和口蹄疫正向的液体猪瘟和口蹄疫正向间间接血凝接血凝试验试验的的试试剂剂用量在逐年加大。然而，正向用量在逐年加大。然而，正向间间接血凝作接血凝作为为一种微量的定量反一种微量的定量反应试验应试验，实验结实验结果受操作技果受操作技术术影响影响较较大，任何操作大，任何操作环节环节的的纰纰漏都会使最后漏都会使最后判定的判定的结结果与正确果与正确结论结论大相径庭。大相径庭。l为规为规范操作，本次培范操作，本次培训训就就实验实验中器材、中器材、试剂试剂、样样品、品、过过程和判定程和判定标标准等方面的准等方面的优优化做一化做一综综述，述，以期作以期作为为此此实验实验的借的借鉴鉴。4.二、原理二、原理l正向正向间间接血凝接血凝试验试验的原理是将可溶性抗原的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的吸附于与免疫无关的载载体（体（红细红细胞）表面，胞）表面，此吸附抗原的此吸附抗原的红细红细胞与相胞与相应应的抗体的抗体结结合，合，在有在有电电解解质质存在的适宜条件下存在的适宜条件下发发生的肉眼生的肉眼可可见见的凝集性反的凝集性反应应。5.二、原理二、原理l充分理解正向充分理解正向间间接血凝接血凝试验试验的原理，的原理，对对整整个个试验试验的操作和的操作和结结果判定都具有很大的指果判定都具有很大的指导导意意义义。6.三、三、实验实验器材的器材的优优化化l本本实验实验所使用的所使用的实验实验器材包括微量血凝板，器材包括微量血凝板，微量振微量振荡荡器，移液器和吸器，移液器和吸头头，为为保保证实验证实验的的顺顺利利进进行，要行，要选择质选择质量有保障，量有保障，稳稳定性定性好的器材。好的器材。7.三、三、实验实验器材的器材的优优化化l1、微量血凝板、微量血凝板l实验实验室室经经常使用的是有机玻璃材常使用的是有机玻璃材质质 或者一次性或者一次性的的110底角的底角的 96 孔孔 V 型微量血凝板。有机玻型微量血凝板。有机玻璃板板可以叠放，不占璃板板可以叠放，不占实验实验室台面，室台面，处处理理样样品品量量较较大大时时合适，但每次用完需要清洗。清洗方合适，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后法：一般先用清水浸泡，然后马马上用高上用高压压清水清水冲洗，洗冲洗，洗净净后用手甩干板子倒置于后用手甩干板子倒置于37温箱中温箱中烘干。用前要先烘干。用前要先检查检查血凝板孔底是否干血凝板孔底是否干净净，如，如发现发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉有透光性差一点的孔，可用酒精棉签签擦擦净净。除了有机玻璃板以外，除了有机玻璃板以外，还还有一次性血凝板，不有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干需清洗，也不用担心板子不干净净影响影响结结果，但果，但不能叠放，不能叠放，测测定少量定少量样样品适合。品适合。8.三、三、实验实验器材的器材的优优化化l2、微量振微量振荡荡器器l使用振使用振荡荡器振器振荡时间荡时间不宜超不宜超过过 10 秒秒钟钟，振振荡荡强强度不能太大，先从小到大，中等度不能太大，先从小到大，中等强强度即可。多度即可。多块块板叠加后振板叠加后振荡时荡时要用手要用手压压住住最上一板，以防上下的振最上一板，以防上下的振动动造成孔中液体造成孔中液体溅溅出而影响出而影响实验结实验结果的准确性。如果果的准确性。如果实验实验室没有它，也可用手室没有它，也可用手轻轻拍血凝板的拍血凝板的边缘边缘即即可。可。9.三、三、实验实验器材的器材的优优化化l3、单单、多道微量移液器、多道微量移液器l建建议议使用高使用高质质量的移液器，用定量移液器需要量的移液器，用定量移液器需要准准备备 50 微升和微升和 25 微升两种。微升两种。50 微升的用来加微升的用来加稀稀释释液和稀液和稀释释血清，血清，25 微升的用来加血凝抗原。微升的用来加血凝抗原。可可调调的移液器要的移液器要选择选择与与检测过检测过程中加程中加样样量相近量相近量程的移液器，吸取液体量程的移液器，吸取液体时动时动作要作要轻缓轻缓，防止，防止溶液吸入溶液吸入过过快，冲入移液器快，冲入移液器污污染柱塞或造成堵染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的架上的习惯习惯，移液器如果掉到地下很容易，移液器如果掉到地下很容易损损坏。坏。用完后移液器用用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并把刻度的酒精棉擦拭，并把刻度调调到最大到最大值值。10.三、三、实验实验器材的器材的优优化化l4、吸嘴吸嘴l高高质质量的吸嘴量的吸嘴经过处经过处理后可以重复使用。理后可以重复使用。处处理理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器洗，用超声波清洗器处处理理10分分钟钟，换换水后用二水后用二层纱层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器器处处理理 10 分分钟钟，再用洗衣机甩干，高，再用洗衣机甩干，高压压消毒消毒灭灭菌器中菌器中 121，20分分钟钟即可，去盖放即可，去盖放 37温箱温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难难洗洗干干净净，不必重复使用。接触，不必重复使用。接触过过高感染性材料的高感染性材料的吸嘴要高温消毒后吸嘴要高温消毒后废废弃。弃。经过处经过处理后的吸嘴如理后的吸嘴如果尖果尖头变头变弯，弯，则质则质量不好，不要重复使用。量不好，不要重复使用。11.四、四、试剂试剂的的优优化化l1、抗原抗原l液体正向血凝抗原液体正向血凝抗原摇摇匀后呈咖啡色，无匀后呈咖啡色，无块块状物状物沉淀，静置后血球逐沉淀，静置后血球逐渐渐沉入瓶底。沉入瓶底。摇摇匀后能很匀后能很快形成均匀混快形成均匀混悬悬液的是好抗原，液的是好抗原，摇摇匀后仍有小匀后仍有小块块黑色沉淀物（血球黑色沉淀物（血球团团）的抗原建）的抗原建议议不要使用。不要使用。如果只做如果只做筛检筛检看是否达到合格看是否达到合格线线，一瓶抗原可，一瓶抗原可以以检测检测 30 到到 50 份血清。份血清。值值得一提的是液体正得一提的是液体正向血凝抗原向血凝抗原 48保存，保存期保存，保存期3个月，不能冷个月，不能冷冻冻保存。保存。12.四、四、试剂试剂的的优优化化l2、对对照血清照血清l阴性阴性对对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对对照血照血清微清微红红或淡黄色略微混或淡黄色略微混浊浊的液体。阴阳性的液体。阴阳性对对照照血清可在血清可在-15到到-20保存，有效期保存，有效期 1 年。年。l3、稀、稀释释液液l稀稀释释液无色透明，一般情况液无色透明，一般情况 48保存。用前保存。用前建建议议将稀将稀释释液放液放 室温或室温或37温箱中半小温箱中半小时时后后摇摇匀再用匀再用较较好。好。试剂试剂不能放置太久，最好新不能放置太久，最好新进现进现用。用。13.五、五、样样品血清的品血清的优优化化l新分离血清尽快新分离血清尽快检测检测完，未完，未检检血清血清-20保存。冷保存。冷冻冻血清待血清待检时检时需融化，同需融化，同时时避免避免血清反复血清反复冻冻融影响融影响检测结检测结果。果。严严重溶血、重溶血、严严重重污污染、腐染、腐败败或有或有悬悬浮浮杂质杂质的血清的血清样样品品不宜不宜检测检测，以免，以免发发生非特异性反生非特异性反应应。14.六、六、实验过实验过程程优优化化l正向血凝正向血凝实验过实验过程包括：加稀程包括：加稀释释液，稀液，稀释释待待检检血清，稀血清，稀释释阴性、阳性血清，加血凝阴性、阳性血清，加血凝抗原，震抗原，震荡荡静置，静置，结结果判定。在果判定。在试验试验中要中要注意以下的注意以下的问题问题：l1、加稀、加稀释释液液l在血凝板上在血凝板上16 排的排的 19 孔；第孔；第 7 排的排的 14孔，第孔，第6-7孔；第孔；第 8 排的排的 112 孔各加孔各加稀稀释释液液 50 微升。微升。15.六、六、实验过实验过程程优优化化l2、稀、稀释释待待检检血清血清l取取1号待号待检检血清血清 50 微升加入第微升加入第 1 排第排第 1 孔，并孔，并将将枪头枪头插入孔底，混匀后，从插入孔底，混匀后，从该该孔吸取孔吸取 50 微升微升移入第移入第 2 孔，混匀后从孔，混匀后从该该孔吸取孔吸取 50 微升移入第微升移入第 3 孔直至第孔直至第 9 孔。此孔。此时时第第 1 排排 19 孔待孔待检检血清血清的稀的稀释释度（稀度（稀释释倍数）倍数）依次依次为为 1 2、1 4、1 81 256、1 512。每个待。每个待检检血清血清样样品均按品均按上述方法稀上述方法稀释释，每稀，每稀释释一份血清要一份血清要换换吸嘴。每吸嘴。每次滴加次滴加样样本后本后应应吸取稀吸取稀释释液并冲洗几次，最后液并冲洗几次，最后将滴将滴头头内的残液完全排尽，以尽可能的保内的残液完全排尽，以尽可能的保证样证样品被全部加入反品被全部加入反应应孔。作倍比稀孔。作倍比稀释释前，前，应应且且记记将滴将滴头头内的空气排尽，避免稀内的空气排尽，避免稀释时释时孔内孔内产产生气生气泡，直接影响泡，直接影响结结果判定。果判定。16.六、六、实验过实验过程程优优化化l3、稀、稀释释阴性阴性对对照血清照血清l在血凝板上的第在血凝板上的第 7 排第排第 1 孔加阴性血清孔加阴性血清 50 微升，微升，对对倍稀倍稀释释至第至第4 孔。此孔。此时时阴性阴性血清的稀血清的稀释释倍数依次倍数依次为为 1 2、1 4、1 8、1 16。第。第 6-7孔孔为为稀稀释释液液对对照孔。照孔。17.六、六、实验过实验过程程优优化化l4、稀、稀释释阳性阳性对对照血清照血清l在血凝板上的第在血凝板上的第 8 排第排第 1 孔加阳性血清孔加阳性血清 50 微升，微升，对对倍稀倍稀释释至第至第 12 孔。此孔。此时时阳性阳性血清的稀血清的稀释释倍数依次倍数依次为为 1 2、1 4、1 81 2048、1 4096。l每次每次试验试验要做阴阳性要做阴阳性对对照，最好也做二孔照，最好也做二孔空白空白对对照，即孔中加照，即孔中加 50 微升稀微升稀释释液后加液后加25 微升抗原。每次微升抗原。每次检测时检测时阴性、阳性和阴性、阳性和稀稀释释液液对对照只需各做一份。照只需各做一份。18.六、六、实验过实验过程程优优化化l5、加血凝抗原、加血凝抗原l被被检检血清各孔、阴性血清各孔、阴性对对照各孔、阳性照各孔、阳性对对照照各孔、稀各孔、稀释释液液对对照孔均各加血凝抗原照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分微升。血凝抗原用前要充分摇摇匀，瓶底匀，瓶底应应无血球沉淀。一次无血球沉淀。一次实验过实验过程程应选择应选择同一批同一批号的抗原，并先从稀号的抗原，并先从稀释释度高的孔加起，避度高的孔加起，避免滴免滴头头和孔内的液体直接接触。和孔内的液体直接接触。19.六、六、实验过实验过程程优优化化l6、振、振荡荡混匀混匀l将血凝板置于微量振将血凝板置于微量振荡荡器上振器上振荡荡 10 秒秒钟钟，如无振如无振荡荡器，用手器，用手轻轻摇轻轻摇匀即可。然后将匀即可。然后将血凝板放在白血凝板放在白纸纸上上观观察各孔察各孔红红血球是否混血球是否混匀，以没有血球沉淀匀，以没有血球沉淀为为合格。盖上玻板，合格。盖上玻板，室温下或室温下或 37下静置下静置 2 小小时时，判定，判定结结果，果，也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。20.七、判定七、判定标标准准l将血凝板放在白将血凝板放在白纸纸上，先上，先观观察阴性察阴性对对照血清照血清1 16孔和孔和稀稀释释液液对对照孔，均照孔，均应应无凝集（血球全部沉于孔底形成无凝集（血球全部沉于孔底形成边缘边缘整整齐齐的小的小圆圆点），或点），或仅仅出出现现“+”凝集（血球大部凝集（血球大部分沉于孔底，分沉于孔底，边缘边缘稍有少量血球凝集）。阳性稍有少量血球凝集）。阳性对对照血照血清清 1 2 到到 1 256 各孔（各孔（18 孔）孔）应应出出现现“+”到到“+”凝集凝集为为合格（少量血球沉于孔底，大部分血合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如球凝集）。如图图 1 所示，所示，该该阳性血清滴度阳性血清滴度为为1 512 倍倍或或记为记为 9log2。21.七、判定七、判定标标准准l在在对对照孔合格的前提下，照孔合格的前提下，观观察待察待检检血清各血清各孔，以呈孔，以呈现现“+”凝集的最大稀凝集的最大稀释释倍数倍数为为该该份血清的抗体效价。因此正确份血清的抗体效价。因此正确识别识别“+”的凝集的凝集现现象是最后象是最后结结果判定的先决条件。果判定的先决条件。一般的判定方法是将血凝板放在白一般的判定方法是将血凝板放在白纸纸上，上，在各在各对对照孔符合要求的前提下，从开始出照孔符合要求的前提下，从开始出现现沉淀的孔沉淀的孔观观察起，至血球全部沉淀孔，察起，至血球全部沉淀孔，综观这综观这几孔，前后几孔，前后对对比血球凝集和沉淀的比血球凝集和沉淀的发发展情况，以展情况，以1/2血球沉淀孔的血清稀血球沉淀孔的血清稀释释倍数倍数为该为该份血清的效价。份血清的效价。22.七、判定七、判定标标准准附：血凝附：血凝试验试验强强度度23.七、判定七、判定标标准准l例如例如 1 号待号待检检血清血清15孔呈孔呈现现“+”到到“+”凝集，凝集，67 孔呈孔呈现现“+”凝集，第凝集，第8孔呈孔呈现现“+”凝集，第凝集，第 9 孔不凝集，那么就孔不凝集，那么就可判定可判定该该份血清的抗体效价份血清的抗体效价为为 1 128，或，或者者说说 7log2。接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜。接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜群免疫抗体效价达到群免疫抗体效价达到1 32（即（即 5log2；第；第 5 孔）呈孔）呈现现“+”凝集凝集为为免疫合格。免疫合格。24.八、注意八、注意问题问题l1、鉴鉴于有些于有些场场猪瘟猪瘟间间接血凝接血凝试验试验的的样样品品与与 ELISA 方法相比符合率不一致，不少方法相比符合率不一致，不少学者学者认为认为是牛病毒性腹泻抗体的干是牛病毒性腹泻抗体的干扰导扰导致致的，提出了的，提出了间间接血凝方法接血凝方法虽虽然然简单简单，但不，但不能区分猪瘟抗体与牛病毒性腹泻抗体。在能区分猪瘟抗体与牛病毒性腹泻抗体。在实验实验中如果遇到中如果遇到这这种情况，建种情况，建议议采用猪瘟采用猪瘟抗体抗体单单抗阻断抗阻断ELISA 方法方法进进行行检测检测，其，其结结果更可靠些。果更可靠些。25.八、注意问题l2、血凝板的孵育、血凝板的孵育时间时间和判定和判定l试剂试剂盒要求使用盒要求使用 110底角的血凝板，判底角的血凝板，判读结读结果果时间应时间应在在 2 小小时时后后为为妥，冬天妥，冬天还还可可适当适当长长一点，低于一点，低于 1.5 小小时时会判断不准。会判断不准。血凝板第血凝板第 4 孔和第孔和第 5 孔的判断是孔的判断是这这个个试试验验的关的关键键，判了第，判了第 4 孔孔则该则该份血清份血清为为阴性，阴性，判了第判了第 5 孔孔则为则为阳性，阴阳之差往往就在阳性，阴阳之差往往就在这这一下，不能不引起重一下，不能不引起重视视。26.27.