基于Nrf2信号通路研究丁...对高危缺血性卒中的保护作用_王晗彰.pdf

*基金项目:内蒙古自然基金项目(2019MS08206)通讯作者:姜长春【基础医学】基于 Nrf2 信号通路研究丁苯酞对高危缺血性卒中的保护作用*王晗彰1，2，姜长春2，郝喜娃2，陈超2，孙明英2，李洋2，刘海耘3(1 包头医学院中心临床医学院，内蒙古 包头 014040;2 包头市中心医院;3 凤庆县人民医院神经内科)摘要 目的:在急性脑梗死小鼠模型中，检测预使用丁苯酞(n butylphthalide，NBP)是否可通过核因子红系 2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)通路减轻缺血性脑损伤。方法:Nrf2/纯合子和 Nrf2+/+野生型小鼠随机分为 3 组，分别为对照组(C)、低剂量给药组(20 mg/kg)和高剂量给药组(60 mg/kg)，每组 6 只。将丁苯酞用植物油按 30 mg/mL 溶解，低剂量给药组以 20 mg/kg 每天一次灌胃，高剂量给药组以 60 mg/kg 每天一次灌胃，对照组小鼠给予同等剂量的植物油灌胃，1 次/d，持续给药 4 周。4 周末采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型(d MCAO)。在脑梗死模型3 d 及10 d 后，通过 Longa 评分评估小鼠的脑神经功能。通过氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色检测小鼠的脑梗死体积，并通过Western blot 及免疫荧光技术检测小鼠脑组织中 Nrf2 及 H 奎尼酮氧化还原酶 1(NADPH:quinoneoxidoreductase 1，NQO1)、血红素加氧酶(heme oxygenase 1，HO 1)的蛋白表达水平。结果:与Nrf2 野生型小鼠比较，Nrf2 基因敲除小鼠在 dMCAO 术后体重下降幅度更大，小鼠改良 Longa 评分更高，小鼠脑梗体积更大，小鼠脑组织中 Nrf2 及下游 NQO1、HO 1 的蛋白表达水平均显著上调。在 Nrf2+/+野生型小鼠中丁苯酞高剂量给药组(60+/+)小鼠改良 Longa 评分低于未给药小鼠(C+/+)，脑梗体积减少，高剂量 NBP 对高危缺血性脑卒中脑损伤具有预防作用;在敲除 Nrf2 基因的小鼠，高剂量 NBP 对小鼠脑梗水平及神经功能的保护作用消失，无法诱导下游血红素加氧酶(HO 1)和 NAD(P)H 奎尼酮氧化还原酶 1(NQO 1)的蛋白表达水平的上调。结论:预使用丁苯酞对于高危缺血性脑卒中的脑损伤可能具有一定保护作用，能够保护缺血性脑卒中小鼠的神经运动平衡功能，减少梗死体积。Nrf2 的敲除加重了缺血性脑梗死小鼠的脑损伤，大剂量丁苯酞能够上调小鼠脑组织中 Nrf2 及其下游 NQO 1 与 HO 1 蛋白水平的表达，发挥其生理功能。关键词 缺血性卒中;丁苯酞;核因子红系 2 相关因子 2DOI:10 16833/j cnki jbmc 2023 03 001Preventive effect of butylphthalide based on Nrf2 signalingpathway on high risk ischemic strokeWANG Hanzhang1，2，JIANG Changchun2，HAO Xiwa2，CHEN Chao2，SUN Minying2，LI Yang2，LIU Haiyun3(1 Central Clinical Medical College，Baotou Medical College，Baotou 014040，China;12023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.320232 Baotou Central Hospital;3 Department of Neurology，Fengqing County Peoples Hospital)ABSTACTObjective:To investigate whether pre administration of butylphthalide can alleviateischemic brain injury through the nuclear factor erythroid 2 related factor 2(Nrf2)pathway in amouse model of acute cerebral infarction Methods:Nrf2/homozygous and Nrf2+/+wild typemice were randomly divided into 3 groups:control group(C)，low dose butylphthalide group(20mg/kg)and high dose butylphthalide group(60mg/kg)，6 mice in each group Butylphthalidewas dissolved in vegetable oil at 30 mg/ml The low dose group was given 20 mg/kg body weight bygavage，the high dose group was given 60 mg/kg body weight by gavage，and the control group wasgiven the same dose of vegetable oil by gavage Once daily for 4 weeks The mouse focal cerebral in-farction model(dMCAO)was established by electrocoagulation at the end of 4 weeks After 3 daysand 10 days of the cerebral infarction model，the neurological function of the mice was evaluated byLonga score The cerebral infarction volume of mice was detected by TTC，and the protein expressionlevels of Nrf2，NQO 1 and HO 1 in mouse brain tissue were detected by Western blot and immuno-fluorescence techniques esults:Compared with Nrf2 wild type mice，Nrf2 knockout mice showedgreater weight loss after dMCAO，higher modified Longa score，larger cerebral infarct volume，andNrf2 and downstream HO 1 and NQO 1 protein expression levels were significantly up regulatedIn Nrf2+/+wild type mice，the modified Longa score of the high dose butylphthalide group(60+/+)was lower than that of the non dose butylphthalide mice(C+/+)，the volume of cerebralinfarction was reduced，and the high dose butylbenzene Phthalophthalene(NBP)has a preventiveeffect on high risk ischemic stroke brain injury;in mice knocked out of the Nrf2 gene，the protectiveeffect of high dose NBP on the level of cerebral infarction and neurological function in mice disap-peared，and the downstream heme oxygenation could not be induced Up regulation of protein ex-pression levels of enzyme(HO 1)and NAD(P)H quinidone oxidoreductase 1(NQO 1)Conclu-sion:Pre administration of butylphthalide may have a certain protective effect on the brain injury ofhigh risk ischemic stroke，which can protect the neuromotor balance function and reduce the infarctsize in ischemic stroke mice Knockout of Nrf2 aggravated the brain injury in mice with ischemic cere-bral infarction High dose butylphthalide can up regulate the expression of Nrf2 and its downstreamNQO 1 and HO 1 proteins in the brain tissue of mice，exerting its physiological functionKEY WODSIschemic stroke;Butylphthalide;nuclear factor erythroid 2 related factor 2脑卒中是全球第二大死亡原因，随着不良习惯的流行，同样导致脑卒中发病率的逐年增加1。核因子红系 2 相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)作为细胞内氧化还原稳态的主要调节者，成为脑卒中发生发展及预防治疗的重要研究靶点。在基本稳态条件下，细胞质中的 Nrf2 主要与 Kelch 样 ECH 结合蛋白 1(Kelch likeECH as-sociating protein1，Keap1)结合，并被蛋白酶体组成性降解。而在应激条件下，Nrf2 蛋白可从 Keap1 介导的抑制中释放出来。目前有 250 多个 NF2 靶基因与氧化还原调节有关，如 NAD(P)H 奎尼酮氧化还原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血红素加氧酶(heme oxygenase 1，HO 1)和 UDP 葡萄糖 醛 酸 转 移 酶(UDP glucuronosyltransferase，UGT)等。此外，Nrf2 还参与许多初级和次级代谢过程的调节。越来越多的研究表明，Nrf2 在缺血性脑损伤的发生发展及治疗中具有重要的靶向作用2 3。脑卒中的临床治疗中，预防脑卒中发作以及预防脑卒中的反复发作，是减轻脑卒中带来的神经损22023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023伤与脑死亡的重要临床管理方式。神经保护剂是指能够通过对抗脑内有害分子事件而不是改善脑血流来减少缺血性脑损伤的任何药剂4。根据最近的一项临床试验结果，丁苯酞(n butylphthalide，NBP)治疗缺血性脑血管病的有效率高达 74 7%，不良反应发生率低5。尽管 NBP 在缺血性卒中的药理机制尚未完全阐明，但由于其对缺血性脑损伤相关的多种病理过程的影响以及其疗效，预计该药物在治疗脑卒中方面的应用将增加。有研究表明，腹腔注射丁苯酞可改善创伤性脑损伤小鼠模型中Nrf2 蛋白的胞质向胞核转移，从而起到抗氧化和减轻脑损伤的作用6。但是，NBP 对高危缺血性卒中的预防作用及其机制尚且没有明确的研究。因此，本研究旨在评估NBP 在缺血性卒中的预防作用，以及 Nrf2 AE 通路在缺血性卒中神经保护中的可能作用。1材料和方法1 1实验动物及分组将 4 月龄健康雄性 IC 背景的 Nrf2/和 Nrf2+/+野生型小鼠 由河北医科大学第二医院神经病学实验室提供，质量合格证号SCXK(京)2019 0010 分为 6 组，分别为 C/组、20/组、60/组、C+/+组、20+/+组、60+/+组。各组分组条件如下:(1):C/:Nrf2 敲除鼠给予溶剂空白对照灌胃;(2)20/:Nrf2 敲除鼠丁苯酞 20mg/kg 体质量每天一次灌胃;(3)60/:Nrf2 敲除鼠丁苯酞 60 mg/kg 每天一次灌胃;(4)C+/+:野生鼠给予溶剂空白对照灌胃;(5)20+/+:野生鼠丁苯酞 20 mg/kg 每天一次灌胃;(6)60+/+:野生鼠丁苯酞60 mg/kg 每天一次灌胃。将丁苯酞用植物油按30 mg/mL 溶解，根据小鼠体重进行灌胃，对照组小鼠给予同等剂量的植物油灌胃，1 次/d，持续给药 4周。4 周末在麻醉状态下给予结扎一侧颈总动脉，并同时电凝烧灼同侧大脑中动脉，造成脑梗死模型。1 2观察指标1 2 1运动功能评定实验采取 Longa 评分对小鼠梗死后运动功能进行评估，各组小鼠分别在术后3 d 和 10 d 放在地板上，观察其行走有无绕圈行为，用 Longa 分级法进行行为学评分，评价其运动感觉平衡功能。0 分，无缺陷;1 分，不能解折叠侧前肢;2 分，对侧前肢屈曲;3 分，轻度向对侧转圈;4 分，严重向对侧转圈;5 分，向对侧跌倒。12 2脑梗死体积评估采取氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法测量梗死体积。小鼠麻醉后生理盐水灌注冲净血液，自额极向后冠状面切成 2 mm 厚的切片，放入 2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中，37 恒温孵育，后移至 4%多聚甲醛中固定，无染色区为梗死组织，拍照后应用 Image Pro Plus6 0软件进行图像分析，计算梗死体积。1 2 3Nrf2、HO 1、NQO1 蛋白表达水平测定实验动物在麻醉状态下进行活体取材，将脑组织取出，放入 80 保存，参照总蛋白提取试剂说明书提取总蛋白。采用 BCA 法测定蛋白浓度，采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测脑组织中 Nrf2、HO 1、NQO1 蛋白表达水平。1 2 4免疫荧光染色测定 Nrf2 表达小鼠麻醉后，经心脏灌注固定后，取大脑于固定液(4%多聚甲醛)中过夜固定，梯度脱水，将大脑置于切片机中完全冰冻后固定切片。挑选合适的脑片，置于0 03%PBST 中洗 3 次，5 min/次。10%山羊血清室温封闭2 h，后置于相应一抗中4 孵育过夜。用0 03%PBST 漂洗3 次，5 min/次。避光置于二抗中室温孵育 2 h，用0 03%PBST 漂洗 3 次，5 min/次，用含 DAPI 的抗荧光衰减封片剂进行封片，在荧光显微镜下观察 Nrf2 表达情况。1 3统计学分析应用 SPSS 21 0 专业统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数 标准差(x s)表示;多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用 LSD t 法。以 P 0 05 为差异具有统计学意义。2结果2 1NBP 能够减小脑梗死体积采用 TTC 染色发现，dMCAO 术 后，野 生 型 小 鼠 中，NBP 高 剂 量(60+/+)小鼠脑组织梗死体积较对照组(C+/+)小32023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023(P 0 05)，而在 Nrf2 敲除鼠中，NBP 低剂量(20/)及高剂量(60/)与对照组脑组织梗死体积相比差异无统计学意义(P 0 05)，见图 1、图 2。图 1小鼠脑组织 TTC 染色图图 2小鼠脑组织梗死体积统计图注:*与 C+/+组相比，P 0 052 2高剂量 NBP 能够改善神经功能障碍在小鼠清醒时采用 Zea Longa 方法进行神经行为学评分。dMCAO 术后，在野生型小鼠中，NBP 高剂量小鼠(60+/+)神经功能障碍明显减轻，与野生型小鼠相比，NBP 高剂量小鼠的神经行为学评分(1 00 0 00)明显降低(P 0 05)，而在 Nrf2 敲除鼠中，NBP 低剂量(20/)及高剂量(60/)对小鼠神经功能障碍无明显作用，神经行为学评分无明显降低，见图 3。图 3小鼠改良 Longa 评分统计图术后 3 d 小鼠改良 Longa 评分均明显升高，其中对照组升高较为明显，10 d 时，各个实验组改良longa 评分较 3 d 时均有下降。其中在 3 d 及 10 d两个时间节点，对照组与野生鼠丁苯酞高剂量组的改良 Longa 评分之间均存在统计学差异(P 0 05)。2 3NBP 对 Nrf2 蛋白表达的影响通过免疫组化方法，检测了小鼠脑组织切片中 Nrf2 的表达水平。结果显示，与野生型小鼠相比，敲除 Nrf2 小鼠脑组织中 Nrf2 表达明显降低(P 0 01)。在野生型小鼠中，给予高剂量 NBP 能诱导 Nrf2 蛋白表达(P 0 05)，见图 4。图 4小鼠脑组织切片中 Nrf2 表达水平注:与 C+/+相比，*P 005，P 00124NBP 可诱导 NQO 1 与 HO 1 蛋白的表达结果显示，在 Nrf2/小鼠脑组织中，Nrf2 在细胞质细胞核中的蛋白表达水平低于 Nrf2+/+野生型小鼠，该基因的敲降有效(P 0 01)。Nrf2+/+野生型小42023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023鼠组中，NBP 低剂量给药组(20)与高剂量给药组(60)均能诱导 Nrf2 的上调，包括胞质蛋白水平的上调以及细胞核中蛋白表达水平的上调(P 0 05)，剂量越高，诱导效果越明显。在 Nrf2+/+野生型小鼠组中，NBP 低剂量给药组(20)与高剂量给药组(60)小鼠脑组织中 NQO 1 与 HO 1 蛋白的表达水平均高于对照组(P 0 05)，剂量越高，诱导效果越明显。除此之外，在 Nrf2/小鼠脑组织中，NQO 1与 HO 1 蛋白表达水平低于 Nrf2+/+野生型小鼠(P 0 01)。见图 5。图 5小鼠脑组织中胞质胞核 Nrf2 蛋白表达水平及下游 HO 1 和 NQO 1 的蛋白表达的影响5A:蛋白印迹分析图。5B:胞核内 Nrf2 蛋白表达结果。5C:胞质内 Nrf2 蛋白表达结果。5D:HO 1 蛋白表达。5E:NQO1 蛋白表达。与 C+/+相比，*P 005，P 0013讨论NBP 因其显著的神经保护作用而被研究7，其主要药理作用包括重建微循环、保护线粒体功能、抑制氧化应激、抑制炎症反应和抑制神经元凋亡8。NBP 在临床上越来越多地作为辅助治疗方案用于缺血性脑卒中的治疗9，但对于一些高危缺血性卒中的发生，NBP 是否具有预防性的保护作用尚未见相关研究报道。本研究中，Longa 评分评估小鼠的神经损伤程度显示，在野生型小鼠组中，丁苯酞高剂量给药组(60+/+)小鼠在改良 Longa 评分低于未给药小鼠(C+/+)，表明预先给予高剂量丁苯酞具有减轻脑卒中小鼠神经功能缺损的作用。Nrf2 的表达有利于维持小鼠 dMCAO 术后生理状态。本研究探讨了 Nrf2 通路在 NBP 介导的 dM-CAO 小鼠脑损伤预防保护中的作用机制。实验通过 Western Blot 探究了 Nrf2 的下游 NQO 1 及 HO1 的蛋白水平表达改变。结果显示，在 Nrf2/小鼠脑组织中，NQO 1 与 HO 1 蛋白表达水平显著低于 Nrf2+/+野生型小鼠，因此敲降 Nrf2 基因，其下游蛋白的表达同样受到抑制，Nrf2 的基因缺失降低了细胞抗氧化系统的能力，这表明 Nrf2 的减少降低了细胞抗氧化系统的能力，并抑制了缺血时其靶细胞保护蛋白的上调10。过去也已经有大量证据表明抑制 Nrf2 在脑缺血损伤中的有益作用。在梗死周围和核心梗死区域，Nrf2 表达在 2 h 开始增加，在8 h 达到峰值，然后在再灌注 24 h 和 72 h 下降。本研究发现，Nrf2 敲除后，HO 1 表达较野生组减低，且 TTC 染色提示脑梗死体积较野生组增大，提示敲除 Nrf2 可通过下调 HO 1 表达从而减弱保护作用，加重脑梗死损伤。此外本研究使用丁苯酞预处理了 Nrf2 敲除鼠及野生型小鼠，验证了丁苯酞是否可通过 Nrf 及其下游信号通路发挥保护作用。结果发现，在 Nrf2+/+野生型小鼠组中，丁苯酞可使小鼠脑组织中 NQO 1 与 HO 1 蛋白的表达水平均显著提高。NQO 1 与 HO 1 是细胞内抗氧化系统重要的组成成分，抗氧化系统的破坏会导致严重的细胞损伤和血管效应，OS 在小鼠脑组织中堆积，攻击脂质、蛋白质及 DNA，破坏细胞结构完整性和细胞功能，导致神经元组织破坏和细胞凋亡，进而加剧梗死，损伤神经功能11。在相同剂量给药组间，丁苯酞在野生型小鼠中的 NQO 1 与 HO 1 蛋白也 高于Nrf2/纯合子对照组，这提示丁苯酞可以(下转第 15 页)52023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023 26 Zhang W，Moskowitz W，Nuki G，et al OASI rec-ommendations for the management of hip and knee osteo-arthritis，Part:OASI evidence based，expert con-sensus guidelines J Osteoarthr Cartil，2008，16(2):137 162 27Wang CJ，Weng LH，Ko JY，et al Extracorporealshockwave therapy shows chondroprotective effects inosteoarthritic rat kneeJ Arch Orthop Trauma Surg，2011，131(8):1153 1158 28 Kawcak CE，Frisbie DD，McIlwraith CW Effects of ex-tracorporeal shock wave therapy and polysulfated glyco-saminoglycan treatment on subchondral bone，serum bio-markers，and synovial fluid biomarkers in horses withinduced osteoarthritisJ Am J Vet es，2011，72(6):772 779 29 Gollwitzer H，Saxena A，DiDomenico LA，et al Clini-cally relevant effectiveness of focused extracorporealshock wave therapy in the treatment of chronic plantarfasciitis:a randomized，controlled multicenter study J JBJS，2015，97(9):701 708(收稿日期:2022-06-14)(上接第 5 页)提高 NQO 1 和 HO 1 发挥保护作用。Nrf2 基因敲除后，NQO 1 的保护作用不能充分发挥，这也提示了 Nrf2 是丁苯酞发挥保护机制的重要靶点之一。本研究还发现在 Nrf2 基因敲除组中予以丁苯酞可提高 HO 1 的表达，这说明丁苯酞可能通过其他通路促进了 HO 1 的表达，从而发挥了卒中后的神经保护作用。本研究未发现 Nrf2 基因敲除后给予丁苯酞可影响 NQO 1 的表达，但由于试验数量有限，仍需要进一步研究。综上，本研究发现预使用丁苯酞对于高危缺血性脑卒中的脑损伤可能具有一定保护作用，使用丁苯酞后可以显著减少梗死体积并保护缺血性脑卒中小鼠的神经运动平衡功能。该保护作用可能是通过Nrf2 信号通路及其下游的 HO 1 蛋白所介导的。参考文献 1 Kim JS，Bae，Kim M，et al Stroke prediction in patientspresenting with isolated dizziness in the emergency de-partment J Sci ep，2021，11(1):6114 2 Farina M，Vieira LE，Buttari B，et al The Nrf2 pathwayin ischemic stroke:a reviewJ Molecules，2021，26(16):5001 3 Liu L，Locascio LM，Dor S Critical role of Nrf2 in ex-perimental ischemic strokeJ Front Pharmacol，2019，10:153 4Adams HP Jr Emergent use of anticoagulation for treat-ment of patients with ischemic strokeJ Stroke，2002，33(3):856 861 5Dong Y，Yin JY，Chen T，et al Dl 3 n bu-tylphthalidepretreatmentattenuatesrenalischemia/reperfusion injuryJ Biochem Biophys es Commun，2021，557:166 173 6 Liu ZW，Wang HD，Shi XF，et al DL 3 n bu-tylphthalide(NBP)provides neuroprotection in the micemodels after traumatic brain injury via Nrf2 AE signa-ling pathway J Neurochem es，2017，42(5):1375 1386 7 Xu ZQ，Zhou Y，Shao BZ，et al A systematic review ofneuroprotective efficacy and safety of DL 3 N bu-tylphthalide in ischemic strokeJ Am J Chin Med，2019，47(3):507 525 8 Xiang HL，Zhang Q，Han YK，et al Novel brain tar-geting 3 n butylphthalide prodrugs for ischemic stroketreatment J J Control elease，2021，335:498 514 9Ding YL，Gu ZQ，Zhai TT，et alEffect of bu-tylphthalide on new cerebral microbleeds in patientswith acute ischemic strokeJ Medicine(Baltimore)，2020，99(32):e21594 10 Parada E，Egea J，Buendia I，et al The microglial 7 acetylcholine nicotinic receptor is a key element inpromoting neuroprotection by inducing heme oxygenase1 via nuclear factor erythroid 2 related factor 2 J Antioxid edox Signal，2013，19(11):1135 1148 11 Chen J，egan F Targeting the Nrf2 heme oxygen-ase 1 axis after intracerebral hemorrhageJ CurrPharm Des，2017，23(15):2226 2237(收稿日期:2022-09-22)512023 年第 39 卷第 3 期Vol 39No.32023