11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较_史春丽.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月11 种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较史春丽，黄中强，范晓瑜，肖艳群*，王雪亮*（上海市临床检验中心 分子生物学室，上海 200126）摘要：收集 11种不同厂家的灭活型样本保存液，将甲型流感病毒加入保存液和生理盐水中，在 4、25 和 37 条件下保存 0 h、2 h、4 h、6 h和 24 h后，分别提取各组的病毒核酸，并通过逆转录实时荧光 PCR 检测病毒载量变化，以探究不同样本保存液对病毒核酸保护效果是否存在差异。结果发现不同样本保存液中的病毒载量随保存时间和温度变化存在显著差异。据此可将 11 种灭活型样本保存液的保存效果分为四类：优秀产品：在任一温度（4、25、37）条件下，即使保存 24h时病毒核酸都未发生明显降解，占比 27.2%（3/11）；良好产品：低温（4）和室温（25）情况下核酸未出现降解，但在高温（37）条件下 6 h后保存效果明显下降，占比 27.2%（3/11）；合格产品：低温（4）条件下对病毒核酸具有较好的保护效果，但在室温（25）和高温（37）情况下随保存时间延长其保护效果显著下降，占比 18.1%（2/11）；不合格产品：任一保存条件下对病毒核酸的保护效果都较差，甚至加入病毒后立即导致病毒核酸发生快速降解，占比 27.2%（3/11）。以上结果说明不同厂家样本保存液对病毒核酸的保护效果存在显著差异，可能会导致病毒核酸检测出现假阴性结果。因此，需重点加强对样本保存液的质量监管，以有效保障病毒核酸检测，尤其是新冠核酸检测质量，以更好地做好疫情防控工作。关键词：样本保存液；保护效果；甲型流感病毒；逆转录实时荧光 PCR；新型冠状病毒中图分类号：R331 R373.9 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02047707DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004244自 2019年底新型冠状病毒肺炎（以下简称新冠肺炎）疫情暴发后，新冠病毒持续突变，逐渐进化为具有更强传染性的奥密克戎变异株1，2，这进一步加速了疫情蔓延，给人们的生活与心理造成了沉重负担3。因此，正确诊新冠肺炎变得尤为关键。目前，新冠病毒核酸检测仍是诊断新冠肺炎的金标准4，其主要包括标本采集、核酸抽提、核酸检测与结果判读等多个流程，其中任何一个环节出现问题都会影响其检测质量5。如先前研究发现不同厂家新冠病毒核酸检测试剂检测性能方面存在较大差异，可能会影响检测结果的准确可靠68。此外，分析前环节的诸多因素，如不规范的样本采集9、不合适的样本保存和运送等，都会对检测结果准确性造成较大影响10。因此，需采取多种措施严格加强新冠核酸检测的质量控制，更好地做好疫情防控工作11。但目前还有一个未能引起足够重视的环节采样管。采样管主要分为灭活型与非灭活型，含胍盐的灭活型样本保存液会更为有效地灭活病毒并保护病毒核酸不被降解，因而在临床被广泛采用11。而随着病毒采样管种类及使用量的激增，相关不良风险事件也随之增多，如样本保存液变色、漏液、管盖损坏等14，都可能影响病毒核酸检测结果。此外，还需尤为关注的一点是样本保存液对病毒核酸的保护能力是否如我们所预期，因其是新冠核酸检测准确可靠的前提条件。为此，本研究以与新冠病毒结构特征相似的流感病毒为替代毒株，选取本地区医疗机构中广泛使用的 11种灭活型样本保存液，观察流感病毒在不同保存温度和时间下其病毒载量的变化情况，以比较不同样本保存液对病毒核酸的保护效果。通过上述评估，一方面为医疗机构选择合适的样本保存液提供参考借鉴，另一方面为相关部门制订相关行业标准提供一定的数据支撑。收稿日期：20220704；接受日期：20221008基金项目：上海市公共卫生体系建设三年行动计划（项目号：GWV2）；上海市“医苑新星”青年医学人才培养资助计划（青年医学人才类临床检验项目）；上海市卫生健康委员会面上项目（项目号：201940264），题目：液态活检中热点突变循环肿瘤 DNA 参考物质的制备与应用；上海市临床检验中心自选课题（项目号：2022ZXKT03），题目：11种灭活型病毒保存液对病毒核酸稳定性及其灭活效果的影响研究。作者简介：史春丽（1995），女，检验技师，从事分子诊断、免疫疾病等相关研究，Email：forever_通讯作者：肖艳群（1964），女，主任技师，从事临床分子检测质量管理，Email：；王雪亮（1981），男，副主任技师，从事临床分子检测质量管理和新技术开发，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷材料与方法1 病毒甲型流感病毒鼠肺适应株（A/PR/8/H1N1）由本科室保存。2 实验试剂与仪器通过前期问卷调查，共选取上海地区医疗机构中广泛使用的 11种不同厂家的一次性样本保存液，分别为杭州医国仁生物科技有限公司、杭州优思达生物技术有限公司、上海孚清生物科技有限公司、上海申启生物科技有限公司、山东威高集团医用高分子制品股份有限公司、江苏康健医疗用品有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、潮州凯普生物化学有限公司、江苏美樊生物科技有限公司、江苏默乐生物科技股份有限公司、江苏康为世纪生物科技股份有限公司，对以上厂家进行随机顺序编号为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。甲型流感检测试剂盒（硕世生物科技有限股份公司，江苏）；医用级生理盐水；全自动核酸提取仪Autra 9600 及配套核酸提取试剂（上海之江生物科技股份有限公司，上海）；QuantStudioTM5（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，美国）等。3 甲型流感病毒样本准备和核酸提取将未灭活的甲型流感病毒原液样本加入生理盐水中，以 2倍体积进行倍比稀释，用核酸提取试剂盒和甲型流感病毒检测试剂分别进行流感病毒核酸提取与核酸检测，以确定甲型流感病毒浓度及 Ct 值。而后，根据不同厂家样本保存液的体积，按照 1：108的稀释比例将流感病毒加入到编号为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共 11种样本保存液和生理盐水对照中，并将其分别置于 4、25 和 37 条件下保存。在 0 h、2 h、4 h、6 h 和 24 h 后，分别从每组中取出 3管，向 96 孔预装板中加入 300L 样本，使用 Autra 9600进行核酸提取。4 逆转录实时荧光 PCR方法（RTPCR）使用甲型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）进行流感病毒的核酸检测。严格按照试剂说明书进行操作，其运行程序为：逆转录 50，10min；预变性 95，5min；变性 95，10s 和退火、延伸检测荧光 58，30 s 循环 45 次，在 QuantStudio 5 实时荧光 PCR仪上进行检测。5 核酸检测结果判读根据甲型流感病毒检测试剂盒说明书要求判读结果：FAM 通道检测甲型流感病毒基因，Ct值37且曲线呈 S 型为阳性；Ct 值40 或未检出为阴性，37Ct40 为灰区，需要进行重复检测，如仍在此范围并呈 S型曲线，则判定为阳性。6 数据处理每组实验至少有三个独立重复，本研究将未检出样本的 Ct值定义为 40。每组数据用为均数标准差表示，Graphpad prism 8.0进行作图并进行差异显著性分析。结 果1 11种灭活型样本保存液的基本信息11 种不同厂家的样本保存液的主要成份、规格、保存液的颜色、样本保存条件见表 1。2 流感病毒倍比稀释浓度及对应 Ct值将流感病毒用生理盐水 2 倍体积进行倍比稀释，以确定本研究加入样本保存液中的起始病毒浓度，结果见图 1。当流感病毒浓度稀释到 1.56108时，Ct值为 35 左右，可满足本实验中弱阳性病毒样本的需求。因此，本研究以此 Ct值作为稀释流感病毒样本低浓度的起始浓度。此外，为进一步评估编号为 11的厂家样本保存液的保护效果，分别将病毒浓度稀释到 1107和1106分别为中、高浓度的起始浓度。3 不同样本保存液对低浓度病毒核酸的保护效果比较将含有病毒的 11 种保存液和生理盐水对照组分别置于不同保存温度与时间下，通过 RTqPCR检测流感病毒，其 Ct值变化见图 2。生理盐水对照组结果显示，在 4 时随着保存时间的延长其 Ct值逐渐增高。保存 24h 后，相比 4 平均增高 2 个 Ct值，25 和 37 保存条件下未检出 Ct值（Ct=40）。以上结果说明生理盐水对照组在不同温度下，随着保存时间延长核酸逐渐发生降解，其对病毒核酸的保护效果不佳。对于编号为 1、2、3 厂家的样本保存液，其在4、25 和 37 温度下，随着保存时间延长其 Ct值始终在起始 Ct值（0h）上下些微波动，说明这三个厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果优秀。对于编号为 4、5、6厂家的样本保存液，其在 4 和 25 的保存温度下 Ct值未随保存时间延长而升高；但在 37 下保存 24 h 后，其 Ct值明显升高。以上结果表明此三个厂家的样本保存液在低温和室温 4782期史春丽，等.11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较条件下对病毒核酸具有良好的保护效果，但高温条件下 6 h后其保护效果明显下降。对于编号为 7和 8厂家的样本保存液，在 4 时其 Ct值在初始 Ct值附近波动；在 25 时保存 6 h内其病毒载量较为稳定，但保存 24 h时其 Ct值明显升高；而在 37 时其 Ct 值随着保存时间延长 Ct 值逐渐升高，以上结果说明此类厂家的样本保存液在低温情况下对病毒核酸具有较好的保护效果；但在室温和高温情况下，随保存时间延长其保护效果显著下降，总体来讲保护效果一般。对于编号为 9、10、11 厂家的样本保存液，其在4、25 和 37 温度下，随着保存时间的延长其Ct值逐渐升高，直至未能检出。这说明此类厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果较差。尤其是11厂家样本保存液，在低浓度病毒加入 0 h后，其较初始 Ct值即升高 2个 Ct，这表明其不仅未对病毒核酸产生保护作用，反而导致了病毒核酸发生降解。4 11厂家样本保存液对高中浓度病毒核酸的保护效果评价由于 11 厂家样本保存液加入低浓度流感病毒后，初始 Ct值就有部分未检出（Ct=40）。为了进一步验证 11 厂家样本保存液对其它浓度流感病毒核酸的保护效果，我们随后分别向 11厂家样本保存液加入高浓度（1106）和中浓度（1107）的病毒后，在不同条件下保存一定时间后，观察流感病毒 Ct值的变化情况。结果如图 3所示，与生理盐水相比，11厂家样本保存液在加入高中浓度的病毒后，任一时间和温度情况下流感病毒的 Ct 值均大于生理盐水对照组病毒 Ct 值，这都说明 11 厂家样本保存液对病毒核酸具有明显的降解作用。表 111种灭活型样本保存液的主要成份、规格及样本保存条件Table 1Main components，specifications and sample storage conditions of 11 inactivated samplepreservation solutionsOrder1234567891011Main ingredientsH2O，trihydroxyaminomethane（tris），EDTA，sodium dodecyl sarcosinate，guanidine isothiocyanate（or guanidine hydrochloride，urea）Guanidine saltGuanidine saltGuanidine salt、SurfactantGuanidine saltDimethyl sulfoxide，ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate，Tween20，guanidine isothiocyanate，or other viral lysis solutionsGuanidine saltPhenol，guanidine isothiocyanateAlcoholbased TTRIS buffer system，guanidinium isothiocyanateGuanidine isothiocyanate，sodium acetate trihydrate and glacial acetic acidNP40，Triton x100，trimethylolaminomethane，EDTA，protease，etc.Volume（mL）33333.511.52333colorColorlessPinkredColorlessColorlessColorlessColorlessColorlessredredredPreservation conditions4，24 h2 37，7 d2 8，7 d2 8，24 h2 8，48 h2 8，72 h28，24 h2 8，24 h25，7 d37，30 d25，7 d图 1流感病毒 2倍体积稀释浓度和对应 Ct值注：X轴为稀释倍数，Y轴为 Ct值Figure 1Twofold volume dilution of influenzavirus concentration and the corresponding Ct valueNotes：The Xaxis is the dilution time and the Yaxis is the Ct value 479病 毒 学 报39卷图 2同保存温度与时间下 11个厂家样本保存液在对低浓度流感病毒核酸检测的影响注：A为生理盐水，BL为编号为 111不同厂家样本保存液，X轴为保存时间，Y轴为 Ct值Figure 2Effect of samplepreservation solutions from 11 manufacturers on the detection of low concentrations of influenzavirus nucleic acids at different preservation temperatures and timesNotes：A is physiological saline，BL is sample preservation solution of different manufacturers numbered 111，Xaxis is the preservation time，Y axis is Ct value图 3不同保存温度与时间下编号为 11的厂家样本保存液对高、中浓度流感病毒核酸检测的影响注：A，C为生理盐水稀释的高（1106）、中（1107）浓度流感病毒，B，D为 11厂家样本保存液稀释的高（1106）、中（1106）浓度流感病毒。X轴为保存时间，Y轴为 Ct值Figure 3Effect of samplepreservation solution from manufacturer 11 on the detection of high and medium concentrations of influenzavirus nucleic acids at different preservation temperatures and timesNotes：A，C are high（1106）and medium（1107）concentration influenza viruses diluted in physiohological saline，and B and D are high and medium concentration influenza viruses diluted in sample preservation solution of the 11 manufacturer.Xaxis is the preservation time，Y axis is Ct value 4802期史春丽，等.11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较讨 论核酸检测技术由于具有特异性强、灵敏度高等特点，目前仍是诊断新冠肺炎的主要手段15，其检测结果的准确可靠对疫情防控具有重要意义5，16。本研究通过比较 11 种灭活型样本保存液对病毒核酸的保护效果，发现不同厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果存在较大差异。而样本中病毒核酸的稳定性是核酸检测准确可靠的前提条件，因此必须加强样本保存液的质量管理和控制。因本实验室非生物安全三级实验室，不能进行新冠活病毒操作工作。本研究选用了与新冠病毒具有类似结构的甲型流感病毒 PR8株，两者均为包膜包裹的单链 RNA 病毒。与之前报道使用假病毒不同17，本研究可最大程度模拟新冠活病毒在样本保存液中被灭活和核酸受保护过程，具有更多的实际参考价值。此外，PR8株具有种属特异性，只感染鼠类而不感染人18，因而可方便安全地应用于本研究中。本研究结果显示 11 种不同厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果大体可以分为 4 类：第一类保护效果优秀，其在任一温度（4、25 和 37）下放置 24 h 时仍对病毒核酸具有很好的保护效果。这可能与样本保存液中的有效成份及占比有关，但具体机制还有待进一步研究。第二类保存效果良好，其在低温与室温保存 24 h 内均具有良好的保护效果，但在 37 保存 24 h 后保存效果减弱，其仍可满足 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）中对样本保存和管理相关要求。第三类保存效果一般，在低温时对病毒核酸具有较好的保护效果，但在室温和 37 时病毒核酸随保存时间延长逐渐发生降解19，20。建议医疗机构使用这类样本保存液时，尽量及时检测并保持低温运输，从而有效保证检测质量。第四类保存效果较差，这类样本保存液不能有效保存样本中病毒核酸，因此在检测中低载量病毒时极有可能造成检测假阴性结果。这可能与其保存液中缺乏某些特定保护成份有关。样本保存液的关键组成成份为商业机密，因此表 1 所列出成份仅供参考。此外，样本保存液说明书中规定的样本保存温度虽大多为 2 8，但考虑实际样本采集、运送和保存过程中很多情况无法按照采样管要求温度进行，特别是在进行区域大筛查时。因此，本研究不仅评估了 2 8 条件，还尽量模拟了多种实际情况下样本的运输和保存条件，如 25 和 37，从而更为全面且真实地反映了样本保存液对病毒核酸的保护效果。综上所述，本研究通过比较 11种样本保存液对病毒核酸的保护效果后发现其保存效果存在较大差异。因此，建议医疗机构能够选择病毒核酸保存效果较好的样本保存液，且在采集样本时应规范采集，而后尽快低温送检。此外，也积极呼吁相关部门能够通过制订相关行业标准以加强对样本保存液的质量控制。通过以上措施，尽量避免因为样本保存液问题导致临床上出现检测假阴性问题，从而更好的做好常态化疫情防控。参考文献：1 Callaway E.Heavily mutated Omicron variant puts scientists on alertJ/OL.Nature，2021，600（7887）：21.DOI：10.1038/d4158602103552w.2 Arora S，Grover V，Saluja P，Algarni Ya，Saquib Sa，Asif Sm，Batra K，Alshahrani My，Das G，Jain R，Ohri A.Literature Review of Omicron：A Grim Reality Amidst COVID19 J/OL.Microorganisms，2022，10（2）.DOI：10.3390/microorganisms10020451.3 Lin Yh，Chiang Tw，Lin Yl.Increased Internet Searches for Insomnia as an Indicator of Global Mental Health During the COVID19 Pandemic：Multinational Longitudinal Study J/OL.J Med Internet Res，2020，22（9）：e22181.DOI：10.2196/22181.4 Afzal A.Molecular diagnostic technologies for COVID19：Limitations and challengesJ/OL.J Adv Res.2020，26：149159.DOI：10.1016/j.jare.2020.08.0025 蒯文和，吴忠兰，韩坤，马学平，张薇，杨东智，曹慜，袁芳，赵建华.新冠病毒核酸检测实验室质量控制措施建立初探J.中国公共卫生管理，2021，37（06）：838841.6 Wang X，Huang 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200126，China）Abstract：Inactivated samplepreservation solutions（SPSs）from 11 manufacturers were collected.Influenza A virus was added to each SPS and saline.Viral nucleic acids was extracted from each group after being storage at 4 C，25 C and 37 C for 0，2，4，6 and 24 h.Changes in viral loads were detected by realtime reverse transcription fluorescence polymerase chain reaction to identify differences in the protection of VNAs in different SPSs.We discovered that the viral load in different SPSs varied significantly with the preservation time and temperature.The 11 inactivated SPSs could be classified into four categories.The first category was“excellent products”（VNAs were not degraded significantly at any temperature（4C，25C，37C）even after storage for 24 h）and accounted for 27.2%（3/11）.The second category was“good products”（no degradation of VNAs occurred at low temperature（4 C）and room temperature（25 C），but the preservation effect decreased significantly after 6 h at high temperature（37C），and accounted for 27.2%（3/11）.The third category was“qualified products”（the protection of VNAs was good at low temperature（4C），but decreased significantly with an extension of storage time at room temperature（25C）and high temperature（37C）and accounted for 18.1%（2/11）.The fourth category was“substandard products”（protection of VNAs was poor under either storage condition，and even caused rapid degradation of VNAs immediately after the addition of virus）and accounted for 27.2%（3/11）.Our results indicated a significant difference in the effect of SPSs from different manufacturers to protect VNAs from degradation，which could lead to falsenegative results in VNA testing.Therefore，strengthening the quality control of SPSs must be done to guarantee the quality of VNA testing for better prevention and control of epidemics.Key words：Samplepreservation solution；Protective effect；Influenza A virus；Realtime reverse transcription fluorescent PCR；Coronavirus disease 2019（COVID19）.Funding：Threeyear action plan for the construction of the Shanghai public health system（No.GWV2）；Shanghai Rising Star Young Medical Talents Training Grant Program（Young Medical Talents Clinical Laboratory Project）；Shanghai Municipal Health Commission Project（No.201940264），tiltle：Preparation and application of hot spot mutant circulating tumor DNA reference material in liquid biopsies；Shanghai Center for Clinical Laboratory Selfselected Project（No.2022ZXKT03），title：Effect of eleven inactivated virus preservation solutions on the stability of virus nucleic acid and its inactivation.Corresponding author：XIAO Yanqun，Email： and；WANG Xueliang，Email： 483