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第 31 卷第 1 期 2023 年 3 月 纤 维 素 科 学 与 技 术 Journal of Cellulose Science and Technology Vol.31 No.1 Mar.2023 文章编号：1004-8405(2023)01-0016-07 DOI:10.16561/ki.xws.2023.01.08 3-脱氧葡萄糖醛酮代谢产物脱氧葡萄糖醛酮代谢产物 3-脱氧果糖的脱氧果糖的 HPLC 检测方法初步建立检测方法初步建立 李涵艺1,2，江国荣1,3*，许 恒1,3，季亚男1,2，张露蓉1,3（1.南京中医药大学 附属苏州市中医医院 中药临床药学实验室，江苏 苏州 215009；2.南京中医药大学，江苏 南京 210023；3.苏州市吴门医派研究院 中药临床药学实验室，江苏 苏州 215009）摘 要：建立了 3-脱氧果糖（3-DF）初步检测的高效液相色谱（HPLC）方法。先使用气相色谱质谱联用（GC-MS）对合成的 3-DF 标样进行鉴定。再采用 C18 反相色谱柱，流动相为乙腈-水（10%90%90%10%）梯度洗脱 60 min，紫外检测波长 352 nm，应用 2,4-二硝基苯肼柱前衍生法，以薄层色谱高效液相色谱联用（TLC-HPLC）对 3-DF 衍生物峰进行定位，并完善衍生条件，进行方法学考察。结果表明：合成样品为 3-DF；衍生条件以衍生液中 13 添加乙酸乙酯效果最佳；3-DF 衍生物峰出峰时间为 15.972 min，呈尖峰，分离度良好，线性范围为 0.58 mg/mL，方法精密度 RSD 为 2.4%，重复性 RSD 为 4.4%，稳定性 RSD 为 2.4%。本检测方法稳定、可靠，可初步用于 3-DF 定性及相对定量。关键词：3-脱氧果糖；3-脱氧葡萄糖醛酮；2,4-二硝基苯肼；高效液相色谱；气相色谱质谱联用；薄层色谱高效液相色谱联用 中图分类号：O657.7+2;TQ460.1 文献标识码：A 3-脱氧葡萄糖醛酮（3-Deoxyglucosone，3-DG）是一种高反应性的-二羰基化合物（-DCs），是 Mailland反应的重要的中间产物，主要存在于热加工（油炸等）或者长期储存的高糖高脂食物。-DCs 与氨基酸、多肽和蛋白质和磷脂反应，生成晚期糖基化终末产物（AGEs），诱发衰老、糖尿病、阿尔茨海默症、动脉粥样硬化等慢性退化性疾病。生理状态下，人体每日生成及外源性摄入入血的 3-DG，主要通过酶促反应代谢为 3-脱氧果糖（3-DF），从尿液中排出解毒1-5。检测 3-DF 可以对 3-DG 代谢途径做出判断，同时可以辅助检测 3-DG 的代谢水平。但目前市面上无3-DF 标准品商品售卖，虽然文献中有针对 3-DF 的 GC-MS 检测方法，但操作复杂，对仪器要求较高。本团队在前期研究中，建立了一个有效制备 3-DG 的方法，实验中通过硅胶薄层板检测发现副产物为 3-DF6-7，通过 GC-MS8进一步鉴定 3-DF 的存在。另有研究者建立了针对反应性羰基化合物（包括 3-DG）的 LC-MS方法9，操作、仪器要求高。本文在团队前期研究基础上，选用 2,4-二硝基苯肼做为衍生试剂9来建立柱前衍生法，达到建立 3-DF的高效液相初步检测的目的，并为后续建立同时检测 3-DG、3-DF 的 HPLC 方法提供可能性。收稿日期：2023-03-07 基金项目：国家自然科学基金资助项目（81973740）。作者简介：李涵艺（1999），女，硕士；研究方向：临床中药学。*通讯作者：江国荣（1963），男，教授，主任中药师，硕士生导师；研究方向：临床中药学。 第 1 期 李涵艺等：3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶代谢产物3-脱氧果糖的HPLC检测方法初步建立 17 1 实验 1.1 试剂与仪器 3-DG 标准品（苏州中医院合成10，保存在 4冰箱）。2,4-二硝基苯肼（BBI）；methyl-D-galactopyranoside（甲基-D-半乳糖苷）、盐酸羟胺、正己烷、无水吡啶在阿拉丁购买；N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）在 SIGMA 购买；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。1100LC 高效液相色谱仪（G1321A 荧光检测器和 G2175AA 工作站，美国 Agilent 公司）；GC/TQ：Agilent 7010B，GC System Agilent 8890；C18 色谱柱购自依利特。1.2 3-脱氧果糖（3-DF）的合成 参考文献10，取无水葡萄糖 6 g、对甲苯胺 3.3 g、无水乙醇 135 mL、乙酸 6.6 mL 于 90油浴，沸腾0.5 h 后加入苯甲酰肼 9.9 g，搅拌回流 67 h（从析出沉淀开始），静置过夜。沉淀物甲醇、乙醚各清洗三次，干燥后，加入乙醇 90 mL、水 50 mL、乙酸 1.5 mL、苯甲醛 1.6 mL，90回流 4 h。放置过夜取滤出液，浓缩后用乙醚洗六次，2 g 活性炭脱色，抽滤液浓缩至 3 mL，加入水 5 mL、95%乙醇 10 mL，分别用阴阳离子交换树脂交换。浓缩后用柱层析法分离纯化：95 g 硅胶干法上柱，洗脱剂为三氯甲烷-甲醇-水（820.1）。1.3 3-脱氧果糖（3-DF）的 GC-MS 分析 取 0.1 mg 3-DF 粉末，1 mg 甲基-D-半乳糖苷，与 5 mL 盐酸羟胺溶液（10 mg/mL，无水吡啶溶液配制）在 80下孵育 30 min，然后取 1 mL 蒸发至干燥。在残渣中加入 1 mL 的 N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，旋流搅拌 0.5 min，在室温下孵育 2 h，然后加入 1 mL 的正己烷，将 80 L 的等量转移到 GC 小瓶中，然后进行 GC-MS 分析。参考文献色谱及质谱条件进行检测8。1.4 衍生法 TLC-HPLC 联用检测 3-DF 参考文献，使用薄层层析硅胶板，以三氯甲烷-甲醇-水混合溶液（体积比 730.3）为展开剂，显色剂显色并加热至斑点显色清晰。对 3-DF 的薄层板斑点用 PBS 复溶后按“1.5.3”条件进样。1.5 建立检测方法 1.5.1 溶液配制 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液 称取 12.895 g Na2HPO412H2O 及 2.184 g NaH2PO42H2O，溶于 1 000 mL重蒸馏水，得到 pH7.4、浓度为 50 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液。以水可稀释成 10 mmol/L 的磷酸盐缓冲 溶液。衍生试剂配制 取过量的 2,4-二硝基苯肼，加 70 L 的磷酸，以乙腈定容成 10 mL，得到饱和 2,4-二硝基苯肼（含 0.6%的磷酸）溶液。3-脱氧果糖溶液配制 3-DF 粉末称取 4 mg，用 10 Mm PBS 溶液 1 mL 溶解，配制浓度为 4 mg/mL 的3-DF 溶液。显色剂配制 2,4-二硝基苯肼溶于 2 M 盐酸中成过饱和状态。1.5.2 衍生条件 取标准品溶液 200 L、300 L 饱和 2,4-二硝基苯肼（含 0.6%的磷酸）及 500 L 乙腈，反应 15 min 后，添加 0、1、2、3、4、5 倍量乙酸乙酯或正丁醇，于 10 000 r/min、4条件下离心，取上清液。18 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 1.5.3 色谱条件 色谱柱：C18 反相色谱柱（0.460.25 cm，5 m）；流动相：梯度洗脱 060 min，乙腈/水（10%90%90%10%）；流速：1 mL/min；柱温：30；检测波长：DAD 为 352 nm；进样量：5 L。1.5.4 方法学考察 考察检测方法的线性范围、精密度试验、重复性试验、稳定性试验。2 结果与讨论 2.1 GC-MS 检测 3-脱氧果糖 图 1 为 3-DF（m/z191）溶液经盐酸羟胺和 BSTFA 衍生后的选择离子色谱图。3-DF 样品在 16.101 min出峰，洗脱峰的质谱在 m/z 191（定量离子）和 m/z 217（定性离子）处与文献8具有一致的信号。表明样品为 3-DF。0.8 0.2 0 12 13 14 15 16 17 18 19 采集时间/min 峰强/mV a 0.4 0.6 102 1 3.2 0.8 0 40 80 160 200 280 360 440 480 质荷比（m/z）峰强/mV b 1.6 2.4 107 4 120 240 320 400 520 560 600 图 1 3-脱氧果糖（3-DF）的选择离子监测色谱图（m/z 191）（a）；3-脱氧果糖（3-DF）在 16.101 min 下洗脱峰的质谱图（b）2.2 3-DF 衍生物高效液相色谱的系统适应性与专属性 按“1.5.2”、“1.5.3”条件下处理 3-DF 并进样，得图 2,3-DF 衍生物相对保留时间约为 15.972 min，峰呈尖峰，无拖尾峰，干扰峰少，与相邻峰分离度1.5，则该色谱条件下 3-DF 能被良好检测。第 1 期 李涵艺等：3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶代谢产物3-脱氧果糖的HPLC检测方法初步建立 19 a 800 600 400 0 2 4 6 8 10 14 16 18 t/min h/mAU b 1 2 3 200 12 20 22 图 2 3-脱氧果糖与 2,4-二硝基苯肼衍生产物（a）；3-脱氧果糖衍生物的高效液相色谱图（1.3-DF 衍生物；2.DNPH；3.PBS）（b）2.3 TLC-HPLC 联用分析 3-DG 和 3-DF 衍生物 硅胶薄层板结果如图 3a，参考文献6-7认为课题组前期制备 3-DG 标准品过程中，副产物为 3-DF，则可以改进方法在纯化阶段得到 3-DF 样品。如图 3b，复溶 3-DF 衍生物斑点在“1.5.3”色谱条件下进样，出峰时间约 16.353 min，与“2.2”结果相符。200 150 100 0 2.5 0 5 7.5 10 15 17.5 20 t/min h/mAU b 1 50 12.5 22.5 图 3 3-DF-3-DG 混合品及 3DG 标准品薄层色谱图（1.3-DG 衍生物斑点；2.3-DF 衍生物斑点）（A）；3-DF 衍生物（TLC 斑点）的高效液相色谱图（1.3-DF 衍生物色谱峰）（B）2.4 衍生条件的方法考察 2.4.1 乙酸乙酯与正丁醇终止衍生效果对比 以 11、12、13 的比例向衍生溶液中加入正丁醇或乙酸乙酯，检测放置 0.30、7.93、15.04 小时后对各反应液 3-DF 衍生物峰面积的影响（如图 4）。乙酸乙酯对稳定 3-DF 衍生物峰的效果优于正丁醇，13 比例的乙酸乙酯效果最好。a 20 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 051015500600700800峰面积/浓度/(mLmg-1)时间/h 11 正丁醇 12 正丁醇 13 正丁醇 11 乙酸乙酯 12 乙酸乙酯 13 乙酸乙酯 图 4 添加不同比例正丁醇或乙酸乙酯对各时间点反应液 3-DF 衍生物峰面积的影响 2.4.2 不同比例乙酸乙酯终止衍生效果对比 以 11、12、13、14、15 的比例向衍生溶液中加入乙酸乙酯，检测放置 0.30、7.93、15.04小时后对各反应液 3-DF 衍生物峰面积的影响（如图 5）。13 比例的乙酸乙酯对稳定 3-DF 衍生物峰的效果最好。051015500600700800900时间/h峰面积/浓度/(mLmg-1)11 乙酸乙酯 12 乙酸乙酯 13 乙酸乙酯 14 乙酸乙酯 15 乙酸乙酯 图 5 添加不同比例乙酸乙酯对各时间点反应液 3-DF 衍生物峰面积的影响 2.4.3 条件优化后 3-DF 衍生物的高效液相色谱图 3-DF 衍生物峰出峰时间为 15.972 min，呈尖峰，无拖尾峰。主峰与其相邻峰分离度1.5，主峰与杂质峰互不干扰，认为在此色谱条件下成分得到良好分离。70 60 40 0 0 2.5 5 7.5 10 15 17.5 20 t/min h/mAU 1 2 30 12.5 22.5 50 20 10 图 6 3-DF 衍生物的高效液相色谱图（1.3-DF 衍生物；2.DNPH）第 1 期 李涵艺等：3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶代谢产物3-脱氧果糖的HPLC检测方法初步建立 21 2.5 方法学考察 2.5.1 标准曲线的建立 取 8、4、2、1、0.5 mg/mL 的 3-DF 粗品标准溶液在“2.4.3”条件下衍生后测定，以峰面积对浓度作回归方程，得标准曲线方程为 y194.88 x12.267，R0.999 6，线性关系良好。2.5.2 精密度实验 取 4 mg/mL 的 3-DG 粗品标准溶液在“2.4.3”条件下衍生后测定，连续进样 5 针。RSD 为 2.4%，结果表明设备精密度良好。2.5.3 重复性实验 按“2.1.3”配制五份 4 mg/mL 的 3-DG 粗品标准溶液，在“2.4.3”条件下衍生后测定。RSD 为 4.4%，重现性良好。2.5.4 稳定性实验 取 4 mg/mL 的 3-DG 粗品标准溶液，在“2.4.3”条件下衍生 0.33、1.17、2.33、3.50、4.67 h 后测定，RSD 为 2.4%，有较好的稳定性。2.6 研究过程中的要点 3-DF 目前暂无标准品供应，课题组改进合成方法达到合成 3DF 样品的目的，并通过 TLC-HPLC 联用及 GC-MS 分析对样品进行鉴定，符合预期结论。在衍生实验改善环节，首先考虑通过萃取法终止衍生反应，一是衍生反应液是水与乙腈的混合液，故无法用常用试剂（乙酸乙酯、正丁醇等）将所需成分萃取出来；二是用氯化钠将水与乙腈分层，所需成分处于乙腈层，但目标峰的检测值仍受放置时间影响较大。故暂不考虑用萃取法来改善衍生条件。而在比较正丁醇和乙酸乙酯作为终止试剂的效果时，使用对于稳定目标峰效果较差的正丁醇作为终止试剂时，随放置时间变长，目标峰减小至无，而保留时间 60 min 后会出现新的峰（流动相重新稳定阶段），可做为探究的新方向；使用乙酸乙酯做为终止试剂，可以发现在比较不同比例添加乙酸乙酯对检测结果的影响时，发现 14 比例添加时，平行组的即时检测值相差大（RSD 远大于 5%），较为特殊。但本方法仍存在缺陷：1）3-DF 目前仍无标准对照品，无法进行绝对定量，可用于 3-DG 还原酶酶促反应中11，以组内反应前后的差异、组外相同条件反应下的差异，来相对定量。2）目前检测限仍偏高，无法应用于临床样本检测。3 结论 本文建立了 3-脱氧果糖的 HPLC 初步检测方法，稳定、方便、可行，希望为相关研究提供帮助。参考文献：1 马毛毛.-二羰基化合物的产生规律和机制D.天津科技大学,2017.2 Knecht K J,Feather M S,Baynes J W.Detection of 3-deoxyfructose and 3-deoxyglucosone in human urine and plasma:Evidence for intermediate stages of the Maillard reaction in vivoJ.Arch Biochem Biophys,1992,294(1):130-137.3 Wells-Knecht K J,Lyons T J,McCance D R,et al.3-Deoxyfructose concentrations are increased in human plasma and urine in diabetesJ.Diabetes,1994,43(9):1152-1156.4 Fujii E,Iwase H,Ishii-Karakasa I,et al.The presence of 2-keto-3-deoxygluconic acid and oxoaldehyde dehydrogenase 22 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 activity in human erythrocytesJ.Biochem Biophys Res Commun,1995,210(3):852-857.5 Lal S,Kappler F,Walker M,et al.Quantitation of 3-deoxyglucosone levels in human plasmaJ.Arch Biochem Biophys,1997,342(2):254-260.6 唐文敏.3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系的建立及其初步应用D.南京中医药大学,2009.7 江国荣,张露蓉,姚霏.3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶药物筛选体系的建立及应用J.华西药学杂志,2011,26(5):441-443.8 Degen J,Beyer H,Heymann B,et al.Dietary influence on urinary excretion of 3-deoxyglucosone and its metabolite 3-deoxyfructoseJ.J Agric Food Chem,2014,62(11):2449-2456.9 Tang Y,Zhao Y,Wang P,et al.Simultaneous determination of multiple reactive carbonyl species in high fat diet-induced metabolic disordered mice and the inhibitory effects of rosemary on carbonyl stressJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2021,69(3):1123-1131.10 唐文敏.3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系的建立及其初步应用D.南京中医药大学,2009.11 江国荣,张露蓉,姚霏.3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶药物筛选体系的建立及应用J.华西药学杂志,2011,26(5):441-443.Preliminary HPLC Method for the Determination of 3-Deoxyfructose,a Metabolite of 3-Deoxyglucuronide LI Han-yi1,2,JIANG Guo-rong1,3*,XU Heng1,3,JI Ya-nan1,2,ZHANG Lu-rong1,3（1.Laboratory of Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine,Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing University of Chinese Medicine,Suzhou 215009,China;2.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;3.Laboratory of Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine,Suzhou Institute of Wu Men Medical School,Suzhou 215009,China）Abstract:A high performance liquid chromatography(HPLC)method for the preliminary determination of 3-deoxyfructose(3-DF)was established.3-DF samples were identified using gas chromatography mass spectrometry(GC-MS).A C18 reverse phase chromatographic column was used,and the mobile phase was acetonitrile water(10%90%90%10%)gradient elution for 60 minutes.The UV detection wavelength was 352 nm.A pre column derivatization method of 2,4-dinitrophenylhydrazine was used to localize the peaks of 3-dF derivatives using thin layer chromatography coupled with high performance liquid chromatography(TLC-HPLC),and the derivatization conditions were optimized for methodological investigation.The results showed that the synthesized sample was 3-DF.The best derivatization conditions were 13 addition of ethyl acetate to the derivatization solution.The peak time of the 3-DF derivative was 15.972 minutes,showing a sharp peak.The resolution was good,with a linear range of 0.58 mg/mL,a method precision RSD of 2.4%,a repeatability RSD of 4.4%,and a stability RSD of 2.4%.This detection method was stable and reliable,and could be initially used for qualitative and relative quantitative analysis of 3-DF.Key words:3-deoxyfructose;3-deoxyglucuronide;2,4-dinitrophenylhydrazine;high performance liquid chromatography;gas chromatography-mass spectrometry;thin layer chromatography-high performance liquid chromatography