1,5-AG在高糖代谢兔尸体玻璃体液中的变化_刘芳芳.pdf

法 医 学 杂 志 2023年 2月 第39卷 第1期1，5-AG在高糖代谢兔尸体玻璃体液中的变化刘芳芳，吴慧，王威，谢英川北医学院基础医学与法医学院，四川 南充 637000摘要：目的 了解 1，5-脱水葡萄糖醇（1，5-anhydroglucitol，1，5-AG）在高糖代谢兔尸体玻璃体液中的浓度水平及变化特点，探讨 1，5-AG在高糖代谢紊乱所致死亡的法医病理学中的鉴定价值。方法 采用四氧嘧啶建立糖尿病高血糖兔模型，选取18只空腹血糖浓度13.80 mmol/L的糖尿病高血糖兔（实验组）和18只空腹血糖浓度6.10 mmol/L 的健康兔（对照组），采用空气栓塞处死，即刻采集血液，于死后 0、12、24、36 h采集玻璃体液，检测兔血液及玻璃体液中1，5-AG的质量浓度。结果 实验组血糖浓度为（25.103.14）mmol/L；1，5-AG质量浓度在死亡即刻血浆中（0.940.20）g/mL与玻璃体液中（0.990.05）g/mL差异无统计学意义（P0.05）。实验组各时间点玻璃体液中1，5-AG质量浓度低于相应对照组（P0.05）。对照组和实验组兔血浆中1，5-AG质量浓度与血糖浓度均呈负相关（对照组 r=-0.79，P0.05；实验组 r=-0.97，P0.05）.The concentration of 1，5-AG in the vitreous humor of the experimental group was lower than that of the corresponding control group at all time points（P0.05）.Correlation analysis showed that the concentration of 1,5-AG in blood was negatively correlated with blood glucose in both control group and experimental group（control group:r=-0.79,P0.05;experimental group:r=-0.97,P13.80 mmol/L8，体质量减轻，精神状态差，出现昏睡、角膜反射迟钝等表现，视为糖尿病高血糖模型建造成功8-9。选取18只糖尿病高血糖模型建造成功的兔作为实验组。对照组：选取 18 只健康兔适应性喂养 2 周后，注射 0.9%的生理盐水，隔夜禁食禁水，测空腹血糖6.10 mmol/L1，精神状态良好，饮食正常。1.3.2 检材取样及处理实验组及对照组兔均采用空气栓塞处死。1.3.2.1 玻璃体液实验组及对照组分别按死后时间分为 4 个时间点（0、12、24、36 h），分别于上述死后时间点采集玻璃体液，具体采集方法如下：实验组及对照组各 6 只，分别于死亡后 0 h（右眼）、12 h（左眼）采集同一只兔的玻璃体液；实验组及对照组各 6 只，分别于死亡后 12 h（右眼）、24 h（左眼）采集同一只兔的玻璃体液；实验组及对照组各 6 只，分别于死亡后 24 h（右眼）、36 h（左眼）采集同一只兔的玻璃体液。得到每组0 h（n=6）、12 h（n=12）、24 h（n=12）、36 h（n=6）各时间点样本，分别置于1.5 mL高温灭菌的微量离心管中，以离心半径8.5 cm，14 000 r/min，离心15 min，取上清液分别置于0.5 mL高温灭菌的微量离心管中，-20 保存，1周内检测。1.3.2.2 血样于死亡当时取心血2 mL，置于5 mL含肝素钠抗凝剂采血管中，以17 170g离心15 min，取上清液分别置于高温灭菌的微量离心管中，-20 保存，于 24 h 内检测。1.4 检测方法采用兔1，5-脱水葡萄糖醇（1，5-AG）ELISA试剂盒检测血浆和玻璃体液中的 1，5-AG，按照试剂盒说明书进行实验，使用MK3酶标仪测得1，5-AG标准品的光密度值，以 1，5-AG 标准品光密度值为自变量（x），相应的标准品浓度为因变量（y），利用 Microsoft Excel 2016（美国微软公司）绘制标准曲线，获得拟合曲线方程，将实验样本检测的光密度值代入拟合曲线方程，获得血浆和玻璃体液中1，5-AG的质量浓度。1.5 统计分析采用SPSS 22.0软件（美国IBM公司）进行统计分析，实验数据以均值标准差（x s）对计量资料进行描述。组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用方差分析，血浆及玻璃体液 1，5-AG质量浓度的相关性采用Pearson相关分析，检验水准=0.05。2结果2.1 四氧嘧啶诱导的糖尿病高血糖兔模型注射四氧嘧啶后，继续常规饲料加高浓度葡萄糖 14法 医 学 杂 志 2023年 2月 第39卷 第1期喂养4周后，18只兔精神状态差，出现昏睡、角膜反射迟钝等表现，且体质量（1.890.21）kg与用药前（2.300.21）kg相比差异有统计学意义（P0.05），血糖浓度均值达到（25.103.14）mmol/L，大于13.8 mmol/L，与初始空腹血糖（5.180.40）mmol/L相比，差异有统计学意义（P0.05，表1）。2.4 玻璃体液在各时间点1，5-AG质量浓度对照组及实验组玻璃体液中 1，5-AG 质量浓度见表 2。实验组死后各时间点的玻璃体液1，5-AG质量浓度均低于对照组（P0.05）。2.5 兔死亡即刻血浆和玻璃体液中 1，5-AG 质量浓度对照组死亡即刻血浆中1，5-AG质量浓度（1.370.29）g/mL，玻璃体液中 1，5-AG 质量浓度（1.360.30）g/mL；实验组兔死亡即刻血浆中 1，5-AG 质量浓度（0.940.20）g/mL，玻璃体液中 1，5-AG 质量浓度（0.990.05）g/mL，血浆和玻璃体液中 1，5-AG 质量浓度之间差异均无统计学意义（P0.05）。2.6 兔血浆中1，5-AG与血糖的关系对照组18只兔血浆中血糖浓度为4.56.0 mmol/L，血浆 1，5-AG 质量浓度为 1.141.99 g/mL，95%可信区间为（1.22，1.41）g/mL。相关性分析结果显示，1，5-AG与血糖浓度呈负相关（r=-0.79，P0.05；图1A）。实验组 18只兔血浆中血糖浓度为 20.5033.00 mmol/L，血 1，5-AG 质量浓度为 0.531.11 g/mL，95%可信区间为（0.86，0.98）g/mL，相关性分析结果显示，1，5-AG与血糖浓度呈负相关（r=-0.97，P0.05；图1B）。3讨论1，5-AG是一种天然存在的葡萄糖 1-脱氧形式，是人体内主要的多元醇之一，几乎不在细胞内或细胞外合成，主要来自饮食摄入10-11，以游离形式存在于体内循环，以原体随尿液排出体外，绝大部分（99%）在肾小管内被重新吸收，封闭的吡喃环结构决定了其稳定代谢的特点，从而在体内形成稳定的代谢池和浓度状态，并存在于机体血液、脑脊液和玻璃体液中12-14。由于 1，5-AG 与葡萄糖存在肾小管内重吸收的竞争抑制，当机体血糖明显升高，特别是超过肾糖阈值时，肾对原尿中1，5-AG重吸收明显减少，血液中1，5-AG质量浓度降低13，15-16。与其他血糖监测指标不同的是，血表1 兔左眼及右眼玻璃体液中1，5-AG质量浓度Tab.1Mass concentrations of 1，5-AG in left and right vitreous humor of rabbits（n=18，x s，g/mL）组别对照实验左眼1.280.210.880.07右眼1.360.260.910.08表2 玻璃体液中1，5-AG质量浓度Tab.2 Mass concentration of 1，5-AG in the vitreous humor（x s，g/mL）组别对照实验0 h（n=6）1.360.300.990.051）12 h（n=12）1.280.290.900.071）24 h（n=12）1.310.180.920.081）36 h（n=6）1.350.150.980.091）注：1）与对照组相比，P0.05。BAA：对照组；B：实验组。图1 血浆1，5-AG与血糖的关系Fig.1 The relationship between 1，5-AG in plasma and blood glucose 15Journal of Forensic Medicine,February 2023,Vol.39,No.1液1，5-AG能较好地反映近期（13 d）血糖的控制及波动情况，国外有研究主张将血液1，5-AG检测作为短期血糖水平监测的新标志物7，血浆1，5-AG0.05），说明玻璃体液中1，5-AG质量浓度水平在死后36 h内基本保持稳定，不受死亡间隔时间的影响，是高糖代谢紊乱死者体内较为稳定的生化指标。NOWAK 等22研究发现，随着死后间隔时间的增加，非糖尿病死者血中 1，5-AG质量浓度有增加趋势（相关系数 0.29），糖尿病组中未出现这种现象（相关系数-0.06）。但 NOWAK 等的研究检测数据来源于不同的个体，可能存在死亡原因不同、死后间隔时间差异、尸体保存条件不同等外在因素的影响。而本研究显示，在上述条件同质化的前提下，不论是实验组还是对照组，玻璃体液 1，5-AG质量浓度水平不仅在同一机体中死后36 h内保存相对稳定状态，来源于不同机体的 1，5-AG 平均浓度在各时间点差异也没有统计学意义，说明玻璃体液中 1，5-AG质量浓度水平在死后36 h内保持稳定，其检测结果能够反映死亡当时机体1，5-AG真实水平。本研究中实验组和对照组在死亡后0 h血液和玻璃体液 1，5-AG质量浓度差异没有统计学意义，且左右眼玻璃体液中 1，5-AG质量浓度不受眼别的影响，说明玻璃体液是检测机体 1，5-AG 质量浓度水平的很好的血液替代检材，基本等同于死亡当时血液1，5-AG质量浓度。两组玻璃体液 1，5-AG质量浓度均与血糖水平呈负相关，且实验组 1，5-AG质量浓度明显低于对照组（血糖正常）。与 TAKATA 等20人体研究不同的是，本研究中实验组及对照组的血液 1，5-AG质量浓度几乎没有交叉范围，对照组血液 1，5-AG质量浓度最低不低于 1.14 g/mL，而高血糖组 1，5-AG质量浓度最高不高于 1.11 g/mL。其原因可能与本研究对比条件同质化、实验组缺乏血糖轻中度升高者的 1，5-AG质量浓度数据，而其他研究可能与样本来源于不同个体、死亡原因不同、采集样本的死亡间隔时间不同等因素有关。本研究中实验组血糖均高于20 mmol/L，而1，5-AG下降至0.531.11 g/mL，95%可信区间是（0.86，0.98）g/mL，其中仅有一个样本1，5-AG 质量浓度大于 1.10 g/mL，建议将兔血液 1，5-AG 质量浓度1.10 g/mL 作为参考值，当检测出血液 1，5-AG 质量浓度低于该水平时，提示机体生前存在高血糖状态。随着机体血糖浓度的升高，血液及玻璃体液1，5-AG 质量浓度下降，且玻璃体液 1，5-AG 质量浓度在兔死亡36 h内不受死亡时间的影响，是稳定反映机体生前血糖水平的辅助生化指标，可以评估死者临终前的血糖状态，帮助印证死后机体体液血糖浓度的客观性，对高糖代谢紊乱死者高血糖状态的法医病理诊断具有一定的辅助价值，进一步建立人体玻璃体液及血液1，5-AG质量浓度正常参考范围很有必要。本研究中每个时间点均同步采集了玻璃体液和血液，但因除了死亡即刻血液外，其他各个时间段采集血液时发现心脏血液呈凝固状态，进行离心后得少许上清液（约 0.1 mL）且为红色，与死后即刻组差别大，考虑存在溶血等因素影响实验结果，故未进行检测。溶血的原因可能是兔死后尸体保存在自然环境下（温度为 2026），血液凝固迅速或在采集血液时破坏了血细胞等。由于死后即刻心脏采血，外周血管（股动脉、颈部血管等）血液可能减少，死后各时间段采集外周血液困难，故本研究未进行死后各时间段血液中 1，5-AG质量浓度的检测，有待进一步进行相关人体研究，探索血液 1，5-AG质量浓度随死后各时间段的变化特点。参考文献：1MURPHY D.Acute complications of diabetes mellitusJ.Nurse Pract Forum，1998，9（2）：69-73.2赵方艳.糖尿病猝死法医学鉴定 1例J.中国法医学杂 志，2016，31（S2）：182-183.doi：10.13618/j.issn.1001-5728.2016.S2.016.ZHAO F Y.Forensic identification of sudden death of diabetes：A case reportJ.Zhongguo Fayixue Zazhi，2016，31（S2）：182-183.3董红梅，朱少华，周亦武，等.1型糖尿病猝死法医学 16法 医 学 杂 志 2023年 2月 第39卷 第1期分析1例C/中国法医学会.全国第九次法医学术交流会论文集.北京，2013.DONG H M，ZHU S H，ZHOU Y W，et al.Forensic analysis of sudden death of type 1 diabetes：A case reportC.Forensic Medicine Association of China.Proceedings of the Ninth National Forensic Medicine Academic Exchange Conference.Beijing，2013.4PALMIERE C.Postmortem diagnosis of diabetes mellitus and its complicationsJ.Croat Med J，2015，56（3）：181-193.doi：10.3325/cmj.2015.56.181.5HESS C，MUSSHOFF F，MADEA B.Disorders of glucose metabolism：Post mortem analyses in forensic casespart J.Int J Leg Med，2011，125（2）：171-180.doi：10.1007/s00414-010-0510-0.6HESS C，MUSSHOFF F，MADEA B.Disorders of glucose metabolism-post mortem analyses in forensic cases：Part IJ.Int J Leg Med，2011，125（2）：163-170.doi：10.1007/s00414-010-0509-6.7BECK R，STEFFES M，XING D Y，et al.The interrelationships of glycemic control measures：HbA1c，glycated albumin，fructosamine，1，5-anhydroglucitrol，and continuous glucose monitoringJ.Pediatr Diabetes，2011，12（8）：690-695.doi：10.1111/j.1399-5448.2011.00764.x.8叶习红.兔急性高血糖和糖尿病时的血液流变性和微循环变化的实验研究D.泸州：西南医科大学，2007.YE X H.Experimental study on property of hemorheo-logy and mesenteric microcirculation of rabbits with acute hyperglycemia or diabetes mellitusD.Luzhou：Southwest Medical University，2007.9陈小明，黄丹丹，李自成.新西兰兔糖尿病肾病模型的建立方法J.中国病理生理杂志，2012，28（4）：765-768.doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.035.CHEN X M，HUANG D D，LI Z C.Construction of a New Zealand rabbit model of diabetic nephropathyJ.Zhongguo Bingli Shengli Zazhi，2012，28（4）：765-768.10 孟建波，康胜群，康素娴，等.四氧嘧啶诱导兔1型糖尿病模型的实验研究J.河北医药，2009，31（1）：19-20.MENG J B，KANG S Q，KANG S X，et al.Experimental study of alloxan induced type 1 diabetes in rabbitsJ.Hebei Yiyao，2009，31（1）：19-20.11 YAMANOUCHI T，TACHIBANA Y，AKANUMA H，et al.Origin and disposal of 1，5-anhydroglucitol，a major polyol in the human bodyJ.Am J Physiol Endocrinol Metab，1992，263（2）：E268-E273.doi：10.1152/ajpendo.1992.263.2.e268.12 YING L W，MA X J，YIN J，et al.The metabolism and transport of 1，5-anhydroglucitol in cellsJ.Acta Diabetologica，2018，55（3）：279-286.doi：10.1007/s00592-017-1093-8.13 YAMANOUCHI T，AKANUMA Y.Serum 1，5-anhydroglucitol（1，5 AG）：New clinical marker for glycemic controlJ.Diabetes Res Clin Pract，1994，24（S）：S261-S268.doi：10.1016/0168-8227（94）90 259-3.14 TAZAWA S，YAMATO T，FUJIKURA H，et al.SLC5A9/SGLT4，a new Na+-dependent glucose transporter，is an essential transporter for mannose，1，5-anhydro-D-glucitol，and fructoseJ.Life Sci，2005，76（9）：1039-1050.doi：10.1016/j.lfs.2004.10.016.15 KAMETANI S，HASHIMOTO Y，YAMANOUCHI T，et al.Reduced renal reabsorption of 1，5-anhydro-D-glucitol in diabetic rats and miceJ.J Biochem，1987，102（6）：1599-1607.doi：10.1093/oxfordjournals.jbchem.a122210.16 AKANUMA Y，MORITA M，FUKUZAWA N，et al.Urinary excretion of 1，5-anhydro-D-glucitol accompanying glucose excretion in diabetic patientsJ.Diabetologia，1988，31（11）：831-835.doi：10.1007/BF00 277486.17 DUNGAN K M.1，5-anhydroglucitol（GlycoMarkTM）as a marker of short-term glycemic control and glycemic excursionsJ.Expert Rev Mol Diagn，2008，8（1）：9-19.doi：10.1586/14737159.8.1.9.18 HESS C，STRATMANN B，QUESTER W，et al.Clinical and forensic examinations of glycemic marker 1，5-anhydroglucitol by means of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometryJ.Forensic Sci Int，2012，222（1/2/3）：132-136.doi：10.1016/j.forsciint.2012.05.010.19 HESS C，MUSSHOFF F，MADEA B.1，5-Anhydroglucitol-a marker for ante mortem hyperglycaemia?J.Toxichem Krimtech，2011，78（S）：363-366.20 TAKATA T，YAMASAKI Y，KITAO T，et al.Measurement of postmortem 1，5-anhydroglucitol in vitreous humor for forensic diagnosisJ.J Forensic Sci，2016，61（S1）：S150-S153.doi：10.1111/1556-4029.12963.21 SYDOW K，WIEDFELD C，MUSSHOFF F，et al.Evaluation of 1，5-anhydro-d-glucitol in clinical and forensic urine samplesJ.Forensic Sci Int，2018，287：88-97.doi：10.1016/j.forsciint.2018.03.002.22 NOWAK K，JUREK T，ZAWADZKI M.Postmortem determination of short-term markers of hyperglycemia for the purposes of medicolegal opinionsJ.Diagnostics，2020，10（4）：236.doi：10.3390/diagnostics100 40236.（收稿日期：2021-04-06）（本文编辑：张建华）17