毕设论文--五刺加中花青素提取工艺研究.doc

大连工业大学2013届本科生毕业论文 摘 要刺五加是我国东北地区典型的药用植物，有很高的营养价值。本实验以酿酒剩余的刺五加残渣中刺五加籽为原料，提取原花青素，增加刺五加的附加价值。本实验利用超声波辅助提取，从刺五加籽中提取原花青素，优化提取条件，并讨论光照、温度、常见金属离子对原花青素稳定性的影响。以原花青素的提取率为指标，通过单因素实验确立影响原花青素提取量的适宜条件，并通过正交实验确定提取的最佳条件。实验结果表明，原花青素提取的最佳工艺条件为：溶剂乙醇浓度为55%，刺五加籽和乙醇的料液比为1:50，超声时间为25min，超声功率为480W，提取率最高，可以达到0.792%。原花青素对光较为敏感。当温度低于60时，稳定性较好；当温度超过60时，其稳定性较差。所以原花青素应在低温避光的条件下储存、加工。对于常见金属离子，Cu2+对原花青素的影响较大，K+、Ca2+、Mg2+对原花青素影响较小，因此在原花青素提取、精制和加工过程中应尽量避免Cu2+的使用。关键词：刺五加；原花青素；超声波；提取；稳定性AbstractAcanthopanax is a typical medicinal plant in the northeast of China,with a high nutritional value.This experiment extracted proanthocyanidins from Acanthopanax seeds to improve the Acanthopanax value.Ultrasonic wave assisted extraction from Acanthopanax seeds and the influence of light,temperature and common metallic ion were studied in this paper.With the extraction ratio as index，the optimal extraction conditions were determined by the single factor and orthogonal experiment. In the ultrasonic extraction experiments,the results showed that the reaction conditions were concentration of alcohol 55%, solid-liquid ratio 1:35, ultrasonic time 25 min, ultrasonic power 480W,and extraction ratio of proanthocyanidins was 0.792%.Proanthocyanidins were sensitive to light.And its stability was bad when the temperature is over 60.So proanthocyanidins shuold be stored under the condition of low temperature and darkness.Proanthocyanidins had good stability for K+,Ca2+,Mg2+,and bad for Cu2+.So it should avoid using Cu2+ in the process of extracting and refining proanthocyanidins.Key Words: Acanthopanax; proanthocyanidins; ultrasonic; extraction; stability目 录摘 要IAbstractII第一章 文献综述11.1 刺五加研究进展11.1.1 刺五加概述11.1.2 刺五加的主要营养物质11.1.3刺五加药理作用21.2 原花青素概述31.2.1 原花青素的化学结构41.2.2 原花青素的理化性质41.2.3 原花青素的生理功能51.2.4 原花青素的测定71.2.5 原花青素的应用81.3 提取原花青素的方法91.3.1 水溶液浸提法91.3.2 有机溶剂-水提取法91.3.3 超声辅助提取法101.3.4 微波提取法101.3.5 超临界二氧化碳萃取法101.4 本论文研究内容及目的11第二章 材料与方法122.1实验材料122.1.1 材料122.1.2 试剂与药品122.1.2 仪器与设备122.2实验方法132.2.1 原料的预处理132.2.2 原花青素的提取132.2.2.1提取单因素实验152.2.2.2 提取正交实验152.2.3 原花青素的测定152.2.3.1 标准曲线的绘制152.2.3.2 样品的测定152.2.4 原花青素稳定性的研究162.2.4.1光照对原花青素的影响162.2.4.2温度对原花青素的影响162.2.4.3金属离子对原花青素的影响16第三章 实验结果与讨论173.1 标准曲线的绘制173.2 单因素实验173.2.1选择最佳溶剂浓度173.2.2 选择最佳料液比183.2.3选择最佳超声时间193.2.4 选择最佳超声功率203.3 正交实验203.4 原花青素稳定性研究223.4.1 光照对原花青素的影响223.4.2 温度对原花青素的影响223.4.3 金属离子对原花青素的影响23第四章 结论25第五章 工厂设计265.1 项目名称265.2 厂址选择265.2.1 厂址选择的原则265.2.2厂址选择265.3 可行性论证265.4 主要原料及辅料275.5 工艺流程及操作要点275.5.1工艺流程275.5.2操作要点275.6 物料衡算275.7 设备选型295.8 全厂平面图295.9 车间平面图29参考文献33致 谢33- 33 -第一章 文献综述1.1 刺五加研究进展1.1.1 刺五加概述刺五加Acanthopanax senticosous (Rupr.et Maxim.) Harms为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)植物。刺五加别名有：五加皮、刺拐棒、一百针等，是我国东北地区典型的药用植物，主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、河北等地区1。刺五加主要生于低山，散生或丛生于丘陵阔叶或针阔叶混交林下及林缘，耐寒，地下茎发达，对土壤的要求不严。本草纲目称刺五加为“本经上品”，能“补中益气，坚筋骨，强意志，久服轻身耐老”。民间有“ 宁得一把五加，不用金玉满车”的说法2。刺五加中含有多种活性成分，包括原花青素、黄酮、皂苷、多糖、微量元素和氨基酸等化学成分。刺五加具有抗疲劳、抗炎症、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、增强耐缺氧能力等功效，能益气健脾、补肾安神、益精壮骨。同时还有促性腺、防止记忆衰退等活性，在医学上称之为“适应原”样药物3。尤其是所含有的多种糖类和刺五加苷是理想的干扰素促诱生剂、可提高肌体内的干扰素水平，增强肌体的免疫能力。刺五加是我国传统的珍贵药用植物，近些年来出现大量加工制品，使其使用量日益增加，刺五加的应用也越来越广泛。每年刺五加的需求量为500万公斤以上，以刺五加为原料的药类很多，如刺五加注射液、刺五加片、安神补脑片等，另一方面中医处方对刺五加需求也很大。近些年，在中医药理论的基础之上，医学工作者在资源分布、生药鉴定、生化药理、化学成分及临床应用等各个方面进行有计划的研究工作4。1.1.2 刺五加的主要营养物质刺五加中含有多种对人体有益的营养成分，如：皂苷类、黄酮、多糖、多种微量元素及氨基酸等，它们主要分布在刺五加的根、茎、种子种。皂苷类化合物为刺五加主要活性成分之一，Shao等人在刺五加中共发现出13种刺五加皂苷分别为A1、A2、A3、A4、B、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3 和E，并命名为刺五加苷，它们都是在齐墩果烷型的配基上连有双糖链或者单糖链,其中A1、A2、A3、A4 和D3 是他们从叶新分离的皂苷5。郭明全、宋凤瑞等人用分光光度计法测定了回流、超声、浸泡等不同提取方法提取的刺五加中皂苷含量，结果表明，超声方法比较较好，提取的总皂苷含量达到18.59%。研究还表明，刺五加皂苷有的抗疲劳、抗肿瘤、耐缺氧、降血糖、并且还有保护心脏移植手术中受体心脏的作用6。黄酮类化合物广泛地存在于植物界，分布于植物体的各个部位，主要以花、叶为多，是现在很受关注的天然活性产物。刺五加中总黄酮是刺五加中很重要的活性成分。程昆木，王斌，曾伟芹等人采用比色法测定了刺五加根皮、茎皮和叶柄等部位中总黄酮的含量，结果表明根皮中的黄酮总含量较高7。研究证明，黄酮类化合物具有抗自由基抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，且无毒无害，对入类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义8。刺五加多糖是免疫活性成分之一。孟繁磊、陈瑞战等人采用正交试验优化超声提取工艺参数，用苯酚-硫酸法测定刺五加多糖含量，结果发现：70的提取温度，90min的提取时间，500W的提取功率为最佳的提取条件，同时研究发现刺五加多糖具有一定的抗氧化活性，能清除有机自由基9。刺五加中还含有多种矿物质元素及氨基酸，其中包括K、Na、Mg、Ca、P、Al、Si等宏量元素，还有Fe、Cr、Mn、Cu、B、Sr、Ni、Mo、Bi、Ti等多种微量元素。李筱玲等测得刺五加叶中含有16 种氨基酸，其中7种为必需氨基酸，并且天门冬氨酸和谷氨酸的含量较高10。1.1.3刺五加药理作用大量实验研究表明，刺五加具有免疫调节，抗疲劳，抗衰老，抗辐射，抗菌抗病毒，增强适应能力，增强机体抵抗防御能力的作用，还可以用于治疗心脑血管疾病，神经衰弱等症状。（1）抗疲劳作用 实验表明刺五加提取物具有明显的抗疲劳作用。徐峰，赵江燕等人用小鼠负重游泳的方法对刺五加的抗疲劳作用进行了初步研究，实验表明：小鼠运动耐力肝糖原含量以及清除乳酸能力等抗疲劳作用指标是随着总苷量的增加而增强，刺五加提取物及苷类物质具有明显的抗疲劳作用11。从刺五加中分得的糖苷给大鼠口服22d，剂量为50 mg/(kg.d)，服药第8日起进行负荷游泳试验，共进行8次试验，在第6次游泳试验中大鼠即表现出显著的抗疲劳作用。这些实验表明刺五加具有明显的抗疲劳作用12。 （2）提高免疫力作用 刺五加多糖和刺五加苷类均能明显提高人体免疫能力。刺五加中含有的各种功能成分，如：皂苷、黄酮、原花青素、胡萝卜素、维生素E等都能有效的抵抗自由基，防止脂质被过氧化，增强机体的免疫能力。另外，刺五加多糖对重建B细胞有较好的效果，并且能够使白细胞减少的情况有所改善。刺五加还能增强网状内皮系统的吞噬能力。郑日男等人对剌五加对人体免疫机制的作用进行了研究。他们的实验方法是通过研究小鼠的胃缺血再灌注损伤的防护效果来研究其免疫机制的，实验结果表明刺五加提取物对免疫系统有显著调节作用13。（3）抗衰老：衰老是人体各器官功能开始逐步降低的一种生理现象，是一个缓慢的过程，是一种不可避免的自然规律。刺五加中含有多种酚类物质，能够清除体内自由基，防止脂质过氧化，延缓人体的衰老。（4）抗菌消炎的作用：刺五加对切除肾上腺的小鼠，在夏、秋和冬季可减轻热性发炎性水肿，在春季有消炎作用。对切除肾上腺的大鼠，在冬天和春天能阻止甲醛性关节炎症的发展14。用李司忒氏菌感染小鼠，然后注射刺五加提取液，免疫力明显增强，所以认为它有提高机体肠道杆菌的能力。贺立人应用刺五规注射液治疗26例重症肝炎，并随机以13例作对照，结果治疗组在改善临床症状、无毒副作用方面明显优于对照组，其对病毒性肝炎也有一定的作用15。1.2 原花青素概述原花青素（Proanthocyanidins或Procyanidins，简称PC），是植物王国中广泛存在的一大类聚多酚类化合物的总称，广泛地存在于各种植物的核、皮、种籽中，葡萄籽中的原花青素含量最高，种类丰富。原花青素具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、防止血小板凝结，增强心血管活性等多种生物活性和药理作用，是目前国际上公认的清除自由基最有效的天然抗氧化剂，并且广泛地应用于食品、饮料、化妆品及保健食品等领域16。1995年末，美国Whole Foods杂志举行了由公众自由投票选举自己信赖的植物药的民意测验，在未设候选药物的情况下，89.9%的选票集中在10种植物药名下，其中原花青素被认为是最受美国公众青睐并风靡美国草药市场的植物药。1.2.1 原花青素的化学结构原花青素起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和对此类物质研究和认识的深入，现在已经将该类物质列为相对独立的一大类物质并称为原花青素。1961年，德国Karl等从英国山楂新鲜果实的乙醇提取物中首次分离出2种多酚化合物；1967年，美国Joslyn等又从葡萄皮和籽提取物中分离4种多酚化合物，他们所得到的多酚化合物在酸性介质中加热均可产生花青素，故将此类多酚化合物命名为原花青素17。原花青素是由不同数量的儿茶素、表儿茶素及其没食子酸缩合而成的多聚体，主要包括儿茶素的单体、二聚体、三聚体、十聚体等。根据聚合度的不同，通常将二至四聚体称为低聚原花青素，简称OPC。而将五聚体以上的称为高聚原花青素，简称PPC。OPC是水溶性的，拥有强有力的抗氧化能力，在体内其抗氧化、清除自由基的能力很强，并吸收迅速完全，口服20min即可达到最高血浓度，代谢半衰期约为7h。最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，在二聚体中由于两个单体的构象和键合位置的不同，可以形成很多种不同的异构体，现在已经确定分离出来8种结构，分别命名为B1B8，其中B1B4是由C4C8键合，B5B8是由C4C6键合18。在各种原花青素种类中，二聚体分布最广，研究也是最多，二聚体是一类最重要的原花青素。1.2.2 原花青素的理化性质原花青素由于纯度的不同，其颜色也不同，呈现由浅黄色到棕红色不等的颜色，这也和分子中的共轭体系及含有甲氧基，羟基等的数量也有关。由于原花青素结构含有不对称的碳原子，因此具有旋光性19。另外，原花青素结构中有较多的羟基，使其更易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮等极性溶剂，不溶于非极性溶剂，如：氯仿、石油醚、乙醚等。较多的羟基使得原花青素成为很好的供氢体，这样原花青素就有很好的抗氧化的性质。含有羟基的数量越多，在水中的溶解度越大；如果羟基被甲基化，就会增加原花青素在溶剂中的溶解度20。原花青素可以与蛋白质结合，把其放入口腔中人可以感觉到涩味，这是由于原花青素与口腔中的唾液蛋白结合，因此原花青素具有鞣性或收敛性。原花青素易在水溶液和原花青素氧化酶存在的条件下被氧化，而且其稳定与原花青素的结构，聚合度有关21。聚合度不同稳定性不同，低聚原花青素具有一定的耐光、耐热性，而高聚原花青素却很容易凝聚沉淀。 原花青素在280nm处有最大的吸收波长，这说明原花青素具有很强的紫外吸收的能力，因此原花青素能大量应用于化妆品和保健食品等的研发领域。1.2.3 原花青素的生理功能原花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂之一，它的抗氧化能力是维生素E的50倍以上，是维生素C的20倍以上。原花青素有抗氧化、清除自由基、抗衰老，调血脂、防止心血管疾病，抗肿瘤、抗癌，抗辐射、抗诱变，皮肤保健及美容，改善视力等作用22。 （1）抗氧化、清除自由基、抗衰老作用：现代医学及营养保健学认为，体内自由基过多可直接引起多种疾病或和多种疾病的发生有关，如消化、炎症、呼吸、泌尿、血液、内分泌等系统的疾病都与自由基的作用密切相关。1956年Harmon自由基学说认为自由基对细胞成分的进攻是衰老的原因，因此使体内有适当的自由基清除剂和抗氧化剂是非常必要的，这样可以延迟衰老并能延长寿命23。大量研究表明，原花青素是很强的抗氧化剂，能显著清除自由基并能抑制脂质被过氧化，它可保护VE的生理活性、延缓其氧化消耗。另外，原花青素低聚体在生理环境下有更高效的抗氧化活性，其清除自由基的能力比常用的天然抗氧化剂，比如-胡萝卜素、维生素C和E、槲皮素、儿茶素、茶多酚等都要强很多，它在低浓度时就能保护机体，使之免遭氧自由基的损害。（2）降低血压和保护心脑血管：随着人年龄的增长，血管中弹性纤维因逐渐氧化而变硬，这是导致老年人高血压的主要原因。原花青素可以通过提高血管弹性而降低血压。另外OPC能降低血液中的胆固醇水平，减少血管上胆固醇的沉积，以及抑制血管紧张素酶活性以降低血压。心脑血管疾病危害着人类的健康，近年来越来越受到人们的关注。自由基和过氧化是导致心血管疾病非常重要的原因，原花青素可以透过血脑屏障，对脑细胞能提供抗氧化的保护作用，故有预防早老年痴呆作用，并能稳定血脑屏障，使有害物质无法进入大脑而对大脑起到保护作用25。（3）抗癌、抗肿瘤作用：大量的流行病学研究与动物试验表明，多酚类物质能阻止和抑制癌症的发生。作为一种抗氧化剂和抗诱变因素，原花青素能使致癌物质毒性降低或消失，还能通过诱导细胞分化抑制癌症的发展，对癌症发展的3个阶段具有明显的抑制作用。钟进义等人用原花青素进行体外试验，试验表明：原花青素对乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、骨髓白血病细胞有抑制作用，其24h、48h、72h的生产抑制率分别为7%、30%、43%。研究证明：原花青素对多种癌细胞的基因突变有不同程度的抑制作用，其作用机理可能与有丝分裂的信号传导改变、细胞周期阻滞，从而抑制细胞生长及诱导细胞凋亡等有关26。（4）抗辐射、抗诱变作用：将荷S180肉瘤小鼠分别用60Co射线做局部照射，或口服原花青素同时做局部照射，于接种瘤细胞12天后做指标检测。结果发现：照射加原花青素的肿瘤抑制率明显高于未加原花青素单纯照射组，说明原花青素可抑制由辐射所引发的的脂质过氧化27。（5）皮肤保健及美容作用：原花青素能降低黑色素酰胺酶活性，抑制黑色素的产生。另外能够抑制由紫外线照射引起的色素沉着，从而使皮肤更加白净。原花青素还能阻断皮肤中弹性蛋白酶的产生，从而改善皮肤的松弛褶皱等现象。故在欧美国家原花青素有“皮肤维生素”、“口服化妆品”的美誉。（6）改善视力作用：将原花青素给予75例因长期在显示屏前工作的眼疲劳者，每天给予300mg，2个月后，其相对敏感性和客观症状均有明显改善。在对200名进士视网膜非炎性患者服用原花青素，每天服用150mg共两个月，结果受试者视力有明显的改善。1.2.4 原花青素的测定原花青素是单体按照不同的聚合度形成的聚合体，由于构象和键合位置的不同使得原花青素的结构复杂，因此目前国际上仍没有统一的原花青素测定方法。常见的测定方法有：香草醛-强酸法、铁盐催化比色测定法、高效液相色谱测定法、紫外分光光度法等。（1）香草醛-强酸法：本方法适用于各种植物组织、器官及其制剂中原花青素的测定。测定原理是：原花青素上的A环较为活泼，在酸性条件下，其上的间苯二酚或间苯三酚会与香草醛发生缩合缩合，生成在500nm处有最大吸收的有色物质，可通过比色法测其含量。该方法操作较为简单，反应灵敏度较好28。（2）铁盐催化比色测定法：原花青素素是植物王国中广泛存在的一类黄烷-3-醇衍生物的总称，因聚合度的不同以及单体构象或键合位置的不同可形成多种化合物。原花青素氧化后能生成红色的花青素。通常用铁盐催化比色法测定总量，利用硫酸高铁的催化作用，以盐酸水解将之变为红色的花青素，花青素在550nm处有最大吸收峰，比色测定其吸光值，与原花青素化学对照品比较，便可定量计算出样品中原花青素的含量。该方法的反应中易形成副产物，且受结构影响较大，聚合度、单体间键的连接方式等因素均会影响反应转化率，同时对比色反应的条件要求较高，重复性较差29。（3）高效液相色谱测定法：该方法是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法分为正向液相色谱和反向液相色谱，两者侧重点不同，正向是分离不同聚合度原花青素，而反向则分离不同异构体的原花青素30。（4）紫外分光光度法：原花青素是无色物质，在可见光区无特征吸收峰，而在紫外区有唯一特征吸收峰，最大吸收波长在280nm处。该方法简单快捷，但是适用于测量较纯的原花青素。1.2.5 原花青素的应用原花青素的血管活性、抗弹性酶活性及抗氧化活性使其在药品、化妆品、食品等领域中有广泛的应用。（1）药品领域。原花青素对血管疾病的治疗价值在20世纪80年代初即已被人所承认。在法国，用葡萄籽原花青素制成的专利产品用于治疗微循环疾病，包括眼睛与外周毛细血管通透性疾病及静脉与淋巴功能不全；法国Sanofi公司用葡萄籽原花青素与大豆卵磷脂制成复合物，用作血管保护剂和抗炎剂；德国的Berkhman等研制了用于治疗酒精中毒的原花青素制剂31。（2）化妆品领域。1990年法国Masquelier对原花青素在化妆品领域的可行性进行了研究。结果表明，原花青素的治疗作用与其清除自由基的能力密切相关，原花青素所具有的强力抗氧化活性和清除自由基的能力是它在化妆品领域使用的基础。于是许多化妆品公司纷纷开发添加原花青素的乳液、面霜等。（3）食品领域。由于原花青素来源于食物性原料且生产过程中基本未引入有害物质，因此其安全性毋庸置疑，在食品中作为抗氧化剂来使用没有任何问题。目前其在食品中主要是作为天然抗氧化剂、保健食品原料及营养强化剂来使用，具体表现在以下几个方面32。用于维生素类产品：原花青素可以防止维生素B1等的光氧化变质。在维生素B2溶液中添加0.002%的原花青素后，在紫外灯下照射，观察到原花青素的防止光氧化效果十分显著。用于色素类的防护：-胡萝卜素在光照射下，容易氧化分解而致产品褪色，如果在该产品中添加一定浓度的OPC，可有效防止其褪色。用于鱼肉加工产品：可防止咸鲑鱼、红鱼的褪色和变味，鲑鱼的主要呈色物质是虾青素，咸鲑鱼在冷藏或冷冻保存中虾青素会氧化降解而造成红色消失。添加原花青素的食盐水浸渍咸鲑鱼，放置不同时间测定，发现鲑鱼的红色色度变化不大，这表明原花青素对防止鲑鱼褪色效果显著。用于其它食品：利用原花青素的抗氧化性质，应用于火腿等肉制品可防止变色和氧化变味；应用于糕点类可防止油炸糕点的光氧化；应用于发酵食品防止葡萄酒等的变味；应用于调味料亦可防止其氧化变味。1.3 提取原花青素的方法提取原花青素的方法有很多，常用的方法有水提取法、有机溶剂-水提取法、还有仪器辅助提取法，其中仪器辅助提取法包括微波辅助提取法、超声辅助提取法、超临二氧化碳萃取法33。1.3.1 水溶液浸提法原花青素在植物体内通常是以结合态存在，与纤维素、蛋白质以氢键结合在一起，沸水可以使氢键断裂，从而达到提取原花青素的目的。水溶液浸提法是使用最早的提取方法，把样品在水溶液中加热浸泡，该方法的优点是成本低，操作简单；缺点是提取的产品纯度较低，提取时间较长，提取率也较低，所以水溶液提取法一般很少单独使用。1.3.2 有机溶剂-水提取法有机溶剂萃取法是目前使用最为广泛的方法之一，根据相似相容原理，即各组分在溶剂中的溶解度不同，选用对原花青素溶解度大而对无效成分不容或少溶的溶剂从而将原花青素溶解出来。美国，波兰等均有专利介绍了采用甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯等有机溶剂提取原花青素的方法。这四种有机溶剂对原花青素有很好的溶解性，由于乙醇价格低廉，来源丰富，毒副作用小，所以常选乙醇作为提取溶剂。常用的有机溶剂萃取法有：浸渍法、渗透法、回流法等。浸渍法是将原料置于有盖容器中，加入规定量溶剂盖严，浸渍一定时间，使有效成分浸出，此法简单但有效成分不易完全浸出。渗透法是将已经粉碎的原料用溶剂润湿膨胀后，装入渗透筒中，不断添加溶剂，在渗透筒下口收集渗出液。回流法是通过不断回流原料和溶剂互溶物来提高提取率。总的来讲，有机溶剂萃取法的优点是提取率较水提法高，缺点是成本高，有机溶剂的消耗大，且有机试剂有毒，还容易燃烧，不利于安全生产。1.3.3 超声辅助提取法超声波提取法是一种物理物理的破碎过程，就是对样品中要提取的部分进行超声强化处理。超声波的研究已经有很长时间，超声波能产生独特的空化作用和机械震荡，能够瞬间破坏植物细胞壁结构，同时震动作用能增加溶剂湍流强度及接触面积，从而加快了细胞内物质的释放、溶解，从而有利于细胞内有利成分的提取。超声波提取法的优点是操作简单，提取效率高，而且无污染，因此有很好的运用前景。目前，超声波提取法已经有一些研究成果。例如，李瑞丽，乔五忠，王艳辉等用超声辅助提取技术对葡萄籽中原花青素的提取进行了研究，在单因素实验和正交实验的基础上，得出最佳工艺条件为：在40下，料液比为1:40，乙醇溶液为40%，超声功率120 W，超声时间10min34。1.3.4 微波提取法微波提取法是指通过微波反应器，使用合适的溶剂从而提取有效成分的技术和方法。微波辅助提取是将传统有机溶剂萃取与微波技术相结合的一项新型萃取技术，分子偶极高速旋转运动转换为热能，这种热能对介质进行加热，同时还使微波穿透到介质的内部，形成独特的加热方式。在固液浸提过程中，固体表面的液膜常常是由强极性分子溶剂所构成，而在微波辐射下，强极性溶剂分子会快速摆动以跟上交变电场的变化，这就可能对液膜层产生一定的微观扰动影响，使附在固相周围的液膜变薄，使促进扩散过程。吕丽爽等人用微波辅助的方法从葡萄籽中提取原花青素，原花青素的提取率远远超过了传统的水提法，这表明该工艺具有快捷、高效的特点35。1.3.5 超临界二氧化碳萃取法超临界二氧化碳萃取法是近20年来发展起来的提取技术，是以超临界流体为萃取剂，在临界温度和临界压力附近的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离组分，用于超临界流动的物质很多，但最为常见的是二氧化碳。该方法萃取能力强，溶解力大，效率高，但是由于设备昂贵，推广使用比较困难36。1.4 本论文研究内容及目的本论文的主要研究内容是：确定刺五加籽中原花青素的最佳提取工艺条件，重点考察溶剂浓度、料液比、超声时间、超声功率等工艺参数对提取工艺的影响，通过单因素和正交实验来确定最终最佳提取工艺条件。并进行稳定性研究，主要研究光照、温度、金属离子对刺五加稳定性的影响。本论文用的实验原料是实验室酿酒剩余的刺五加废渣，将废渣再利用，变废为宝，实现资源的再利用，减少环境污染。刺五加废渣中含有较多的碳水化合物、蛋白质等营养成分，然而如果不好好处理将会有大量的微生物繁殖生长，使其腐烂，产生酸味、臭味，还会招引来苍蝇，给周围的环境带来严重的污染。目前，我国对这方面的残渣处理不是很重视，这不仅造成资源的浪费，还会导致环境污染。探讨刺五加的综合利用途径，在废弃的刺五加残渣中提取一些有价值、有生理活性的功能性成分，这不仅能使废弃的天然有机化学资源得到合理的研究、开发、利用，进一步增加刺五加的附加值，而且还有利于环保，具有重要的经济价值和广阔的市场前景。第二章 材料与方法2.1实验材料2.1.1 材料实验原料为实验室制刺五加酒所剩的残渣。2.1.2 试剂与药品表2.1 试剂与药品名称种类生产厂家香草醛分析纯天津市大茂化学试剂厂无水乙醇分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司盐酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司甲醇分析纯北京化工厂石油醚分析纯北京化工厂儿茶素分析纯成都曼斯特生物科技有限公司结晶硫酸镁分析纯天津市大茂化学试剂厂氯化钾分析纯北京化工厂无水氯化钙分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸铜分析纯天津市大茂化学试剂厂2.1.3 仪器与设备表2.2 仪器与设备设备名称生产厂家DK-S26型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司722S分光光度计上海精密科学仪器有限公司NJL07-5超声波细胞粉碎机南京杰全微波设备有限公司XT-350A型高速摇摆粉碎机浙江永康市红太阳机电有限公司电子天平上海友声衡器有限公司 真空抽滤机科大创新股份有限公司2.2实验方法2.2.1 原料的预处理将实验室酿酒剩余的刺五加残渣烘干，去皮去梗后得到刺五加籽，粉碎，用一定比例的石油醚浸泡一段时间，抽滤，脱脂后的刺五加籽粉保存备用。2.2.2 原花青素的提取准确称取一定量的样品，与一定浓度的乙醇溶液按照一定的料液比进行混合。设定超声时间和超声功率，进行超声波辅助浸提。浸提后，抽滤得到滤液。2.2.2.1提取单因素实验用超声辅助提取原花青素主要考虑到乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率的影响，分别对这些条件进行单因素实验，优化原花青素的提取率。（1） 乙醇浓度 准确地称量2.0g刺五加籽粉置于100mL的小烧杯中，分别加入60mL浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在200W的超声波作用20min。（2） 料液比 准确地称量4.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入40mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:10；准确地称量3.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入60mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:20；准确地称量2.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入60mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:30；准确地称量2.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入80mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:40；准确地称量1.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入50mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:50；准确地称量1.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入60mL浓度为50%的乙醇溶液使得料液比为1:60；在200W的超声波作用20min。（3） 超声时间 准确地称量1.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入50mL浓度为50%的乙醇溶液，在200W的超声波下分别作用10min、15min、20 min、25 min、30 min。（4） 超声功率准确地称量1.0g刺五加籽粉于100mL的小烧杯中，加入50mL浓度为50%的乙醇溶液，分别在100W、200 W、300 W、400 W、500 W的超声波作用20min。2.2.2.2 提取正交实验在上述单因素实验的基础上，为讨论各工艺参数的交叉影响，以乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率为因素，设计L9(34)正交表进行实验，以确定适宜的提取条件。2.2.3 原花青素的测定 采用浓盐酸-香草醛比色法测定原花青素的含量37。2.2.3.1 标准曲线的绘制准确地称量儿茶素（对照品）10.0mg，用去离子水溶解并定容至25.0mL，再精密称量香草醛8.0g，用甲醇溶解并定容至200mL；用移液管取儿茶素标准溶液1.0mL，2.5mL，4.0mL，5.5mL，7.0mL，分别用去离子水定容至10mL。分别取不同浓度的儿茶素标准溶液1.0mL，加入香草醛-甲醇溶液6mL，摇匀，再加入浓盐酸3mL，混合均匀，每组三个平行，避光反应4h。以1mL甲醇溶液，6mL香草醛-甲醇溶液和1mL浓盐酸混合溶液作为空白对照，在500nm处测吸光度，以儿茶素的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线38。2.2.3.2 样品的测定吸取1.0mL滤液于大试管中，加入6mL香草醛-甲醇溶液，摇匀，然后加入3mL浓盐酸，摇匀，避光反应4h，同样以1mL甲醇溶液，6mL香草醛-甲醇溶液和1mL浓盐酸混合溶液作为空白对照，在500nm处测吸光度，测得吸光值，根据原花青素的标准曲线计算出原花青素的提取率。计算公式如下： 提取率（%）=提取出的原花青素的质量/刺五加籽粉的质量*100%2.2.4 原花青素稳定性的研究2.2.4.1 光照对原花青素的影响取一定量的原花青素提取液分别置于阳光下和避光处，密封并分别在经过0h、2h、4h、8h、1d、2d时，观察原花青素的变化情况，测定其含量每组做三个平行试验。2.2.4.2温度对原花青素的影响取一定量的的刺五加籽原花青素提取液4份，密封并分别放置在室温和40、60、80的水浴锅中恒温2h，测量其含量，每组做三个平行试验。2.2.4.3金属离子对原花青素的影响选取四种常见的金属离子，分别是K+、Mg2+、Cu2+、Ca2+。在不超过各金属离子在一般食品中的最大安全使用量（0.01mol/L）的前提下，分别配制0.1mol/L氯化钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化钙的盐溶液，与一定的提取液混合，使得提取液中金属离子的浓度为0.01mol/L。避光密封置于室温下，分别在经过0h、3h、1d、3d时取样测定其中原花青素含量的变化，先观察颜色变化，再测含量，每组做三个平行试验。第三章 实验结果与讨论3.1 标准曲线的绘制标准曲线如图3.1所示，回归方程为：A=0.002C0.0119，R2=0.9981式中：A:吸光度；C:原花青素质量浓度ug/mL；R2:相关性因数图3.1原花青素的标准曲线3.2 单因素实验3.2.1选择最佳溶剂浓度提取刺五加籽中的原花青素以乙醇溶液为溶剂，由图3.2可知，随着提取所用的乙醇溶液中乙醇浓度的升高，原花青素的提取率先上升后下降，在乙醇浓度为50%时提取率达到了最大值，原花青素为极性化合物，根据相似相溶原理，通过调节乙醇和水的配比改变乙醇溶液的极性，对原花青素的提取效果有较大影响。因此乙醇浓度为50%为最佳提取浓度。图3.2 乙醇浓度对原花青素提取的影响3.2.2 选择最佳料液比图3.3 料液比对原花青素提取的影响采用不同的原料量和乙醇溶液之比提取原花青素，随着料液比的增加原花青素的提取率明显增大，从图3.3可以看出在料液比为1:50之前，原花青素的提取率明显呈线性增加，当料液比为1:50时，刺五加籽中的原花青素已经基本溶出，再增加料液比，虽然提取率也有所增加，但是增加幅度明显减小。据实验结果考虑到原料和乙醇的利用率，选择1:50的料液比较为合适。3.2.3选择最佳超声时间图3.4 超声时间对原花青素提取的影响以乙醇为溶剂用超声波辅助的方法提取刺五加籽中的原花青素时，超声时间不同，提取率有较大影响。由图3.4可见，刚开始随着超声时间的增加，原花青素的提取率明显增加，当超声时间为20min时，原花青素提取率达到最大值。继续延长超声时间，曲线略显下降，提取率开始降低。产生这一趋势的原因可能为：超声时间较短时，原花青素溶出不完全，提取率随着超声时间的延长而增大；但超声时间过长，提取温度升高，原花青素会因为长时间受热而发生分解，不利于原花青素的提取。因此，最佳超声时间应选为20min。3.2.4 选择最佳超声功率图3.5 超声