超声波酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究冷帅辰模板.doc

中国教育部
东北林业大学

毕 业 论 文

论文题目： 超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究
学 生： 冷帅辰
指导老师： 赵晓丹 讲师
学 院： 林学院
专 业： 食品科学和工程级1班

6月

东北林业大学

毕 业 论 文 任 务 书

论文题目 超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究
指导老师 赵晓丹 讲师
专 业 食品科学和工程级1班
学 生 冷帅辰

9月25日

题目名称：超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究
任务内容（包含内容、计划、时间安排、完成工作量和水平具体要求）
榛蘑，生长在针阔叶树干基部、代根、倒木及埋在土中枝条上，关键分布在中国东北地域，是一个中国特有食用菌。榛蘑肉质鲜美，而且富含蛋白质、多糖及多个维生素和矿物质，营养丰富，含有极高食用价值。榛蘑还有着关键药用价值，其多糖成份是一个能够控制细胞分裂分化和调整细胞生长衰老活性多糖，含有抗氧化、抗辐射、促进造血、抗肿瘤、增强免疫力等药理作用。
1.试验内容
（1）取野生榛蘑，洗净、干燥、粉碎、过筛后，制得试验所需榛蘑粉。
（2）采取苯酚—硫酸比色法，绘制葡萄糖标准曲线，从而测定多糖含量。
（3）采取传统水提法，原料经浸提、过滤、浓缩、醇沉、抽滤等操作后，测定吸光值，计算多糖得率。
（4）采取超声波法，提取榛蘑多糖。分别对料液比、超声温度、超声波功率、超声时间
4个原因，进行单原因试验。依据试验结果，进行正交试验，求得超声波法提取榛蘑多糖最好工艺条件。
（5）采取超声波-酶联合提取法，在提取液中加入纤维素酶，经酶解后，在超声波法最好工艺条件下超声处理，提取多糖。分别对加酶率、酶解时间、酶解温度、pH为原因，进行单原因试验。依据结果，进行正交试验，得到超声波—酶法联合提取榛蘑多糖最好工艺条件。
（6）采取酶法提取多糖，依据超声波—酶联合提取法最好工艺条件，只进行酶解，不超声处理，计算多糖得率。
2.时间安排
.02.01——.02.26 文件查阅，方案设计
.02.27——.03.03 准备试验仪器，购置试验材料
.03.04——.03.07 绘制葡萄糖标准曲线
.03.08——.03.20 传统水提法提取榛蘑多糖
.03.21——.04.11 超声波法提取榛蘑多糖条件优化
.04.12——.05.10 超声波—酶法联合提取榛蘑多糖条件优化
.05.11——.05.12 酶法提取榛蘑多糖
.05.13——.05.22 数据处理并撰写、修改论文
.05.23——.06.10 准备答辩
其中： 参考文件篇数： 25篇以上（其中，外文文件3篇以上）
论 文 字 数： 1.1万字以上
专业责任人意见

署名：
年 月 日

超声波—酶法联合提取榛蘑粗多糖工艺优化

摘 要
本试验以榛蘑为原料，研究其多糖提取工艺，经过传统水提法、超声波法、酶法、超声波—酶联合提取法四种方法对榛蘑多糖进行提取，依据单原因和正交试验结果，得到最好提取工艺条件。
结果以下：传统水提法提取榛蘑多糖得率只有5.42%；酶法提取榛蘑多糖得率为10.21%；超声波法提取榛蘑多糖最好工艺条件为料液比1:40，超声时间40min，超声功率300W，超声温度60℃，多糖得率为9.67%；超声波—酶法联合提取最好工艺条件为料液比1:40，加酶率2.2%，pH5.0，酶解温度50℃，酶解时间90min，超声功率300W，超声时间40min，超声温度60℃，此时多糖得率为16.53%。
结论为超声波—酶法联合提取榛蘑多糖提取率是传统水提法3.05倍，超声波法1.71倍，酶法1.62倍，含有显著优势。

关键词:榛蘑多糖；超声波；酶法；提取；工艺优化

Study on Combined Ultrasonic and Enzyme Hydrolysis Extraction of polysaccharide from Armillaria mellea
Abstract
The optimum conditions for extraction of polysaccharides from Armillaria mellea were studied. The extraction was assisted with water bath, ultrasonic wave,enzyme technology and ultrasonic wave combined with enzymete chnology. The process parameters were optimized by single factor test and orthogonal experiment to obtain the optimum extraction conditions.The extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with traditional water bath method is 5.42%.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave method areas follows solid-liquid ratio is 1:40,ultrasonic power is 300W, the temperature is 60℃and the extraction time is 40 min.Under these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillaria mellea is 9.67%.The optimum extraction conditions of ultrasonic wave combined with enzyme method are as follows: solid-liquid ratio is 1:40, ultrasonic power is 300W, temperature is 60℃, the extraction time is 40 min, the rateof enzyme is 2.2%, the value of pH is 5.0,the temperature of enzyme hydrolysisis 50℃,the time of enzyme hydrolysis is 90min. Under these conditions, the extraction percent of polysaccharides from Arimillaria melleais16.53%;The extraction percent of soluble polysaccharides from Arimillaria mellea with enzyme method is 10.21%.
According to validation experiment, compared with traditional methods, ultrasonic wave combined with enzyme method produced higher extraction percent of soluble polysaccharides(the 3.05 times of the traditional water bath extraction, 1.71 times of the ultrasonic wave method extraction, 1.62 times of the enzyme method extraction ,respectively).

Key words：Armillaria mellea; polysaccharides; ultrasonic wave; enzyme hydrolysis;extraction technology.

目 录

摘要
Abstract
1 绪论 1
1.1榛蘑多糖研究现实状况分析 1
1.1.1榛蘑概述 1
1.1.2榛蘑化学成份 1
1.1.3榛蘑功效及作用 1
1.1.4榛蘑多糖生理功效 2
1.2常见多糖提取技术 3
1.2.1传统水提法 3
1.2.2超临界流体萃取 4
1.2.3微波萃取 4
1.2.4超声波萃取技术 4
1.2.5酶法提取技术 4
1.3本试验目标和意义 5
1.4本试验内容及技术路线 5
2 材料和方法 6
2.1 试验器材 6
2.1.1 试验仪器 6
2.1.2 试验材料 6
2.2 试验方法 7
2.2.1榛蘑粉制备 7
2.2.2 葡萄糖标准曲线绘制 7
2.2.3传统水提法提取榛蘑多糖 7
2.2.4超声波法提取榛蘑多糖 7
2.2.5超声波—酶法联合提取榛蘑多糖 8
2.2.6酶法提取榛蘑多糖 9
3 结果和分析 10
3.1葡萄糖标准曲线绘制 10
3.2传统水提法提取榛蘑多糖 10
3.3超声波法提取榛蘑多糖 11
3.3.1单原因试验结果 11
3.3.2超声波法提取榛蘑多糖工艺优化 13
3.3.3超声波法提取榛蘑多糖最好工艺条件验证 14
3.4超声波-酶法联合提取榛蘑多糖 14
3.4.1单原因试验结果 14
3.4.2超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺优化 16
3.4.3超声波-酶法联合提取榛蘑多糖最好工艺条件验证 17
3.4.4酶法提取榛蘑多糖 18
3.4.5四种提取方法所得榛蘑多糖得率比较 18
4 结论 19
参考文件
致谢

超声波-酶法联合提取榛蘑多糖工艺研究

1 绪论

1.1榛蘑多糖研究现实状况分析
1.1.1榛蘑概述
榛蘑为真菌植物门真菌蜜环菌子实体。通常生长在浅山区榛柴岗上，所以得名“榛蘑”。其外型呈伞状，土黄色，广泛分布在中国东北地域，被称为“东北第四宝” [1]。然而榛蘑是一个野生菌类，人工无法培育。在大家追求健康饮食今天，榛蘑因为其肉质鲜美，营养丰富及出色药用功效，受到越来越多人欢迎[2]。
1.1.2榛蘑化学成份
榛蘑中富含大量多糖，除多糖外，榛蘑中蛋白质含量达44%，含有18种氨基酸及钾、钙、镁、铁、锌等矿物质元素，维生素B1、B2和维生素C含量也较高[3]。
1.1.3榛蘑功效及作用
榛蘑不仅是食材，还可入药，自古以来一直是一个中医药材，含有清目、利肺、益肠胃及活血化瘀，强筋健骨功效。常被人用于诊疗羊癫风，腰酸腿疼，佝倭病等；常常食用榛蘑，能够保护视力，预防视力失常。常常食用可加强肌体免疫力，益智快乐，延年轻身等作用，还能够预防皮肤干燥，预防一些心脑血管疾病和呼吸道及消化道疾病[4]。
利用榛蘑和天麻共生关系，还可用榛蘑培育药材──天麻，从而提升天麻产量[5]。
1.1.4榛蘑多糖生理功效
(1)榛蘑多糖免疫增强作用
大量文件报道榛蘑多糖含有免疫增强作用，能增强小鼠免疫能力、促进生长，但对其作用机理叙述得并不完全一致。李延平等[6]研究表明，榛蘑多糖经过刺激骨髓细胞使幼稚细胞增多，分化成成熟细胞，致使分叶核细胞增多，保护骨髓造血系统，拮抗环磷酰胺对骨髓细胞损伤，其作用结果呈剂量依靠性关系。Li YP[7]等在使用昆明纯种小鼠研究榛蘑多糖时发觉，榛蘑多糖对环磷酰胺引发小鼠骨髓细胞损伤含有保护作用。王惠国等[8]研究表明，给小鼠腹腔注射AMP含有增加小鼠吞噬细胞吞噬功效，促进脾脏T 淋巴细胞增殖能力，提升小鼠血清溶血素水平作用。于敏等[9]研究结果表明，AMP 能抵御环磷酰胺作用前期白细胞数下降和环磷酰胺作用后期白细胞数过分升高，一定剂量AMP 能显著降低肝脏重量，表明其对免疫器官有一定程度影响。AMP能显著增强T 细胞介导迟发型变态反应，说明可增强小鼠体液免疫反应及细胞免疫反应能力[10]。另有报道AMP能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红作用[11]，并可诱导巨噬细胞产生NO且展现一定浓度相关性，在高浓度时，对巨噬细胞分泌IL－1有一定促进分泌作用。AMP能增强机体特异性和非特异性免疫功效，可作为免疫增强剂。综合上述，榛蘑多糖是经过调整免疫细胞和免疫分子等多方面发挥其正向免疫调整作用，含有很好药用价值，蜜环菌多糖是否可作为骨髓细胞保护剂，抗放射，抗化学药品对骨髓造细胞损伤，是值得深入研究课题。
(2)榛蘑多糖抗肿瘤作用
经试验研究可知，榛蘑多糖亦含有抗肿瘤生理活性。试验中，将肝癌细胞SMMC－ 7721进行体外培养，研究AMP抗肿瘤作用。在倒置显微镜下观察AMP以0.05mg/mL、0.10mg/mL 及0.20mg/mL 三个浓度给药48h后，肝癌细胞SMMC－7721形态学改变; 采取MTT法检测蜜环菌多糖对肝癌细胞SMMC－7221增殖抑制作用; 采取Brandford 法测定AMP对肝癌细胞SMMC－7221关键蛋白合成影响;采取免疫细胞化学法分析其对凋亡相关蛋白bcl－2表示影响。试验结果表明，和对照组相比，榛蘑多糖可使细胞间隙增大，悬浮细胞增多，能够抑制肿瘤细胞增殖; 同时在给药浓度为0.10mg/ml和0.20mg /mL时，能够显著抑制肿瘤细胞蛋白质合成; 榛蘑多糖还能够下调凋亡抑制蛋白bcl－2表示水平，此试验指出，榛蘑多糖是经过抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡，从而达成抗肿瘤作用。榛蘑多糖抗肿瘤作用不仅在体外试验中得到验证，也表现在化学结构判定和体内试验中，经红外光谱检测，榛蘑多糖含有β－型糖苷键，这种构效关系多糖含有抗肿瘤药理活性，而且在对移植S180小鼠进行在体抗肿瘤试验，也证实其抗肿瘤作用。
(3)榛蘑多糖降糖作用
研究发觉榛蘑多糖(AMP－1) 能使正常小鼠糖耐量增强。能使四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖显著降低。同时发觉AMP－1对胰岛细胞分泌也有一定促进作用［12］。操玉平等［13］经过培养大鼠胰岛素瘤细胞(INS－1) ，并以四氧嘧啶(AXN) 损伤细胞，培养液中加入不一样浓度AMP－1，检测其对INS－l细胞葡萄糖刺激胰岛素和C 肽分泌量影响，并检测细胞存活率。结果发觉，在一定浓度范围内AMP－l对AXN损伤INS－l细胞分泌胰岛素和C肽均含有一定促进作用，尤其是在葡萄糖浓度为16.7mmol/L时，效果显著; 所以能够得出AMP－l可降低AXN对INS－l细胞损伤，增加INS－l细胞存活率。陆军等［14］研究发觉AMP－1能使INS－1细胞NOS活性降低，NO和MDA含量降低，同时使SOD活性增强，增加了GSH含量，所以在一定浓度范围AMP－1对葡萄糖刺激下INS－1细胞胰岛素分泌促进作用，可能和AMP－l能够增加细胞清除自由基能力相关。AMP对血糖作用机制尚不明确。而榛蘑多糖可在较短时间内大量取得，多糖含量高，便于对榛蘑多糖相关血糖影响研究。
(4)榛蘑多糖抗氧化及抗衰老作用
榛蘑多糖抗氧化抗衰老作用近些年来取得较大研究进展。现代研究发觉一部分糖类复合物可经过清除自由基、抑制脂质过氧化、调整免疫功效、调整核酸和蛋白质代谢等路径起到抗氧化作用从而延缓机体衰老。榛蘑多糖作为蜜环菌关键成份之一亦被发觉有此项作用，在研究培养药用型真菌蜜环菌抗氧化作用活性时，发觉蜜环菌匀浆提取物榛蘑多糖含有强大清除自由基和抗脂质过氧化作用［15］。在研究蜜环菌诱导细胞间粘附因子ICAM－1表示能力时，发觉榛蘑多糖在诱导ICAM－1和THP－1细胞中mRNA表示存在剂量和时间依靠关系，在人体单核细胞中，榛蘑多糖诱导ICAM－1 表示是经过ROS/JNK信号通路去激活转录因子NF－KB、AP－1、SP－1和STAT－1［16］。沈明花［17］等研究结果显示榛蘑多糖对羟基自由基和二苯基苦味酰基苯肼含有较显著清除能力，甚至能够提升肝组织中SOD、CAT、GSH－Px活性而且抑制MDA 生成，所以含有显著抗氧化作用。虞磊［18］等从自由基代谢角度探讨了蜜环菌菌索多糖抗衰老机制，经过观察D－半乳糖致衰小鼠模型跳台法和迷宫法学习记忆能力，测定衰老小鼠部分组织中SOD、MDA、NO、GSH－Px，发觉榛蘑菌索多糖可经过调整生物机体免疫功效或清除自由基来延缓机体组织衰老，观察果蝇寿命发觉蜜环菌菌索多糖亦可显著延长果蝇平均寿命和提升果蝇最长寿命。丁老实［19］等经过观察榛蘑壳聚糖对D－半乳糖致衰老小鼠影响和对果蝇寿命影响，测定受试小鼠血清中SOD活性、MDA含量和分析小鼠记忆学习行为等能够得出榛蘑壳聚糖有显著抗衰老作用。
(5)榛蘑多糖抗突变作用
张颖等人在研究榛蘑多糖对低能离子束诱变作用恢复效应时，发觉从蜜环菌Am99－1菌株人工发酵菌体内分离出来榛蘑多糖Aml，诱变源为低能N+离子束，受试动物为黑腹果蝇，并检测Aml对离子束诱变果蝇恢复功效。此试验结果表明，1.0%和l.5%浓度榛蘑多糖Aml 能够使受试果蝇蛹孵出率提升，现代及F2代果蝇突变率降低，同时染色体水平上检测也证实了此结论。所以得出榛蘑多糖对于低能离子束诱变含有一定防护作用［20］。
(6)其它作用
榛蘑多糖含有镇静作用，能显著降低小鼠自发活动，并能使环己烯巴比妥钠或戊巴比妥钠引发小鼠睡眠时间显著延长。研究发觉榛蘑多糖能够并经过抑制NO、INOS、COX－2和THP－1细胞中活性因子表示，而达成抗炎作用［21］。在临床上榛蘑多糖还用于诊疗肢麻、佝偻病、颈椎病、风湿病、腰腿酸痛，能够强壮筋骨。另外，榛蘑多糖对癫痫、耳鸣、眩晕症也有一定疗效［22］。
1.2常见多糖提取技术
1.2.1传统水提法
水作为溶剂提取多糖是最常使用一个方法，能够用热水提取，也能够用冷水浸泡。水提取多糖多数是中性多糖［23］。通常多糖提取大多数采取热水提取，得到了多糖能够直接或离心去除不溶物，或利用多糖不溶于高含量乙醇性质，用高浓度酒精沉淀净化多糖。
1.2.2超临界流体萃取
超临界流体萃取(SFE)是以某一介质(CO2、H2O、N2)作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离组分一个提取分离技术。其特点是产物纯度高，质量好，尤其适适用于热敏性原料，但提取率较溶剂萃取法低[23]。广泛应用于玫瑰精油、不饱和脂肪酸等植物中液态物质和芳香物质提取。
1.2.3微波萃取
微波辅助萃取，是使用微波加热接触样溶剂，化合物从要求样品分离，进入一个溶剂过程。广泛应用于植物活性成份，如多糖提取[23]。
1.2.4超声波萃取技术
超声波是指频率为15KHz～60MHz之间一个高频弹性机械波，通常需要介质如空气、水等进行传输。超声提取法机理是分成热机理、力学机制，超生汽蚀机理。分散在样本和溶剂之间产生空化效应，小气泡形成，增加和爆破压缩，产生5000℃高温和50MPa局部高压，从而使固体样品分散和溶液产生高速碰撞，增大样品和溶剂之间接触面积，从而加速植物细胞内目标物转移到溶剂中，提升传质速率[23]。是提取植物（中药）中活性成份最常见方法之一。
1.2.4.1超声波萃取特点：
（1）常温萃取。超声波可在常温条件下进行萃取，适合部分热不稳定植物活性成份萃取。
（2）常压萃取。无需高压，对试验仪器及玻璃器皿要求较低，操作简单易行。
（3）萃取效率高。因为超声波产生强烈空化作用，大大增加了萃取剂和物料接触面积，使用超生比技术两小时左右即可达成最好提取率，大大缩短了萃取时间。
（4）适用性广。几乎适合全部植物性和动物性材料。
（5）节能环境保护。超声波可在常温、常压条件下萃取，且萃取时间短，萃取剂消耗量也较低，所以降低能耗。
（6）其它优点，如药材原料处理量大，杂质少，有效成份易于分离、净化。萃取工艺成本低，综合经济效益显著。
1.2.5酶法提取技术
植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、木质素、果胶、物质组成，通常提取剂添加适量纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和分解细胞壁,半纤维素、果胶、破坏细胞壁结构,加速细胞有效成份溶出率，提升提取效率，缩短提取时间[23]。适适用于所提取多糖。

1.3本试验目标和意义
中国榛蘑资源丰富，广泛生长于中国东北地域。榛蘑肉质鲜美，营养价值丰富，富含蛋白质、多糖及多个维生素和矿物质，含有极高食用价值。榛蘑还有着关键药用价值，其多糖成份含有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫力、降血糖等药理作用，在食品行业中有着广泛应用前景，所以榛蘑多糖引发了很多人关注，不少科研工作者开始研究榛蘑多糖提取纯化及多种理化性质。现在榛蘑多糖提取多采取传统水提法，提取率偏低，所以本试验经过进行传统水提法、超声波法、酶法和超声波—酶联合提取法提取榛蘑多糖，从而得到最好工艺条件，提升榛蘑多糖提取率，为创建高效、经济多糖提取工艺提供参考，为以后榛蘑多糖精深产品加工提供一定理论和技术支持。
1.4本试验内容及技术路线
榛蘑粉

传统水提 超声波法 超声波-酶联正当 酶法

加酶率
酶解温度
酶解时间
PH
料液比
超声功率
超声温度
超声时间

回流浸提

超声处理
浓缩

除蛋白

离心

醇沉

榛蘑多糖

计算提取率

2 材料和方法

2.1 试验器材
2.1.1 试验仪器
超声波细胞清洗器
KQ500DE
昆山超声波仪器
电热恒温水浴锅
DK-S12
上海森信试验仪器
台式低速离心机
TDL-5W
湖南星科科学仪器
恒温水浴摇床
HZS-HA
哈尔滨东联电子技术开发
循环水多用真空泵
SHB-3
郑州杜甫仪器厂
旋转蒸发器
RE- 52A
上海亚荣生化仪器厂
中草药粉碎机
FW135
天津市泰斯特仪器
可见光分光光度计
722S
上海精密科学仪器
台秤
YPN
上海精密科学仪器
分析天平
JA-
上海良品仪器仪表
pH计
PB-10
Sartorius
电冰箱
BCD-215KS
Haier
2.1.2 试验材料
榛蘑

购于家乐福超市
纤维素酶

购于美国Sigma企业
苯酚
分析纯
天津市瑞金特化学试剂
浓硫酸
分析纯
北京化工厂
正丁醇
分析纯
天津市天力化学试剂
盐酸
分析纯
北京化工厂
氢氧化钠
分析纯
天津市天力化学试剂
无水乙醇
分析纯
天津市天力化学试剂
三氯甲烷
分析纯
天津市津东天正精细化学试剂厂
2.2 试验方法
2.2.1榛蘑粉制备
将榛蘑洗净、晾晒后，置于烘箱中，80℃下恒温烘干后用粉碎机粉碎，过80目筛，得到榛蘑粉。
2.2.2 葡萄糖标准曲线绘制
采取苯酚—硫酸比色法测定多糖含量[24]。精密称取干燥恒质量分析纯葡萄糖0.05 g，加水定容至100mL，得到质量浓度为500 μg/mL 葡萄糖标准溶液，正确吸收0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，补加蒸馏水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均匀后快速加入98%浓硫酸7 mL，摇匀后室温放置30 min，在波长490nm下测定吸光值A。以吸光值A为纵坐标，以葡萄糖质量浓度为横坐标制作标准曲线。
2.2.3传统水提法提取榛蘑多糖
依据邵信儒、孙海涛等人用热水浸提法提取山榛蘑多糖得到最好工艺条件，取1.00g榛蘑粉， 装瓶备用。加入25ml蒸馏水，在95℃下回流浸提5h，回流结束后搜集滤液； 相同条件下，再将滤渣洗入圆底烧瓶二次浸提， 浸提3次后，合并滤液并用旋转蒸发器浓缩（原料重：浓缩液=1:2） ，向浓缩液内加入Sevag试剂除蛋白，根据滤液体积1/4量加入Sevag试剂（氯仿:丁醇=4:1），直到没有乳白色变性蛋白质析出后，在150r/min下振荡20min，4000r/min下离心10min，取上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。
2.2.3.1榛蘑多糖质量浓度测定及得率计算
从得到榛蘑多糖中取0.01g，定容至100 mL 后正确吸收200 μL 于10 mL 容量瓶中，补加蒸馏水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均匀后快速加入98%浓硫酸7 mL，摇匀后室温放置30 min，以不含样品溶液作为空白，于490 nm测定吸光度，依据葡萄糖标准曲线回归方程可计算出对应多糖质量浓度。同时, 可依据多糖得率公式计算出榛蘑多糖得率：
多糖得率(%)=(50 ×V × C × f × W2 /W3× W1 )×100%
式中: W1：称取榛蘑粉质量( g )
W2：由W1 提取榛蘑多糖质量( g )
W3：从W2 中称取用于分析测定榛蘑多糖质量( g )
V：溶解W3 定容后体积( L )
f ：多糖校正系数, f= 0.9
C：由回归方程计算所得多糖质量浓度( g/L )。
试验反复3次，得到传统水提法多糖得率。
2.2.4超声波法提取榛蘑多糖
正确称取榛蘑粉1.00g，按一定料液比加入蒸馏水，置于超声波清洗机中于一定温度下作用一定时间，得到提取液抽滤，向滤液内加入Sevag试剂除蛋白，在 150r/min下振荡20min, 离心10min，取上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1方法测定榛蘑多糖质量浓度并计算得率，每个处理反复3 次。
2.2.4.1超声波法提取榛蘑多糖单原因试验
分别对料液比、超声温度、超声波功率、超声时间4个原因进行单原因试验[26].
（1）料液比对榛蘑多糖得率影响
在超声温度60℃，超声波功率250W，超声30min条件下，分别配制料液比为1:30、1:35、1:40、1:45、1:50，提取多糖，计算得率。
（2）超声时间对榛蘑多糖提取率影响
在超声波功率250W，料液比1:40，超声温度60℃条件下，分别超声10、20、30、40、50min，提取多糖，计算得率。
（3）超声波功率对榛蘑多糖提取率影响
在料液比1:40，超声温度60℃，超声30min条件下，分别设定超声波功率为200、250、300、350、400W，提取多糖，计算得率。
（4）超声温度对榛蘑多糖提取率影响
在超声波功率250W，料液比1:40，超声30min条件下，分别设超声温度为40、50、60、70、80℃，提取多糖，计算得率。
以上每个处理均反复3 次。
2.2.4.2依据单原因试验结果，选择正交表L9(34)研究超声波提取榛蘑多糖最好条件
超声波法提取榛蘑多糖正交原因水平表L9(34)
水平
原因
A料液比
B时间/min
C功率/W
D温度/℃
1

2

3

2.2.4.3超声波法提取榛蘑多糖最好工艺条件验证试验
取1.00g榛蘑粉，依据正交试验得出最好工艺条件，提取多糖，反复3次，得到最好条件下多糖得率。和正交试验中各条件下得到得率比较，观察该值是否最高。
2.2.5 超声波—酶法联合提取榛蘑多糖
取1.00g榛蘑粉，按超声波法提取榛蘑多糖正交试验得到最好料液比加入一定量水，再向溶液中加入一定量纤维素酶，调整溶液pH为某一固定值，并在一定温度下水浴一定时间后，进行超声处理，其中超声功率、时间、温度参考超声波法提取榛蘑多糖得到最好工艺条件，对得到提取液抽滤，向滤液内加入Sevag试剂除蛋白，在150r/min下振荡20min, 离心10min，取上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1方法测定榛蘑多糖质量浓度并依据公式计算得到多糖得率[27]。
(1)加酶率对榛蘑多糖得率影响
在温度为50℃、pH 4.0，酶解时间为90 min 条件下，根据加酶率为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，再经超声处理提取多糖，计算得率。
（2）酶解时间对榛蘑多糖得率影响
加酶率为2.0%，温度为50℃，pH 4.0条件下，分别酶解30、60、90、120、150 min，再经超声处理提取多糖，计算得率。
（3）酶解温度对榛蘑多糖得率影响
在pH4.0时，加酶率为2.0%，酶解时间为90 min 条件下，分别设酶解温度为40、45、50、55、60℃，再经超声处理提取多糖，计算得率。
（4）pH对榛蘑多糖得率影响
在50℃，加酶率为2.0%，酶解时间为90 min 条件下，分别调整pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ，再经超声处理进行多糖提取，计算得率。
以上每个处理均反复3 次。
2.2.5.2依据单原因试验结果，选择正交表L9(34)研究超声波—酶法联合提取榛蘑多糖最好条件[28]
超声波-酶法联正当提取榛蘑多糖正交原因水平表L9(34)
水平
原因
A加酶率/%
B时间/min
C温度/℃
DpH
1

2

3

2.2.5.3超声波—酶法联合提取榛蘑多糖最好工艺条件验证试验
取1.00g榛蘑粉，依据正交试验得出最好工艺条件进行酶解，再经超声波处理后得到提取液，反复3次，得到最好条件下多糖得率。和正交试验中各条件下得到得率比较，观察该值是否最高。
2.2.6酶法提取榛蘑多糖
依据超声波—酶法最好工艺条件中酶解条件，只进行酶解，提取液不再用超声波处理，进行抽滤、除蛋白、离心、醇沉等操作后，得到榛蘑多糖，按2.2.3.1方法测定榛蘑多糖质量浓度并依据公式算出多糖得率。试验反复三次，得到酶法提取榛蘑多糖得率。

3 结果和分析

3.1葡萄糖标准曲线绘制
将葡萄糖配制成不一样浓度溶液，采取苯酚-硫酸法测定其在490nm处吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，得到图3-1

图3-1葡萄糖标准曲线

试验结果显示，葡萄糖浓度在0μg/mL-30μg/mL区间，呈线性关系，其相关系数为 0.998。
回归方程为：y = 0.057x-0.008，R2=0.998
x为葡萄糖质量浓度，μg/mL
y为吸光值
3.2传统水提法提取榛蘑多糖
传统水提法提取榛蘑多糖，加入25mL蒸馏水， 在95℃下回流浸提5h，回流结束后搜集滤液;；相同条件下， 再将滤渣洗入圆底烧瓶二次浸提， 浸提3次后，合并滤液并用旋转蒸发器浓缩(原料重:浓缩液= 1:2) ，向浓缩液内加入Sevag试剂除蛋白，根据滤液体积1/4量加入Sevag试剂(氯仿:丁醇= 4:1)，直到没有乳白色变性蛋白质析出后，在 150r/min下振荡20min，离心10min，取上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀多糖，再离心10min，将得到沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得到榛蘑多糖。按2.2.3.1方法测定榛蘑多糖质量浓度并依据多糖得率公式计算得到榛蘑多糖得率为5.42%。
3.3超声波法提取榛蘑多糖
3.3.1单原因试验结果
3.3.1.1料液比对榛蘑多糖得率影响
固定超声波功率250W，温度60℃，超声时间30min，改变料液比。

图3-2不一样料液比下榛蘑多糖得率

试验结果图3-2所表示：伴随料液比增大，多糖得率先大幅增加，料液比为1:40时多糖得率达成最大，以后多糖得率缓慢下降，添加溶剂量过多时，超声波被溶剂吸收较多，作用于料液相对降低，从而影响榛蘑多糖析出。料液比太大不利于对多糖提取。所以，本试验选择料液比1:40比较适宜。
3.3.1.2提取时间对榛蘑多糖得率影响
固定料液比1：40，温度60℃，超声功率为250W，改变超声时间。

图3-3不一样提取时间下榛蘑多糖得率

试验结果图3-3所表示：伴随超声时间增加，多糖得率不停升高，在时间达成30min时，得率达成最大，以后略有下降趋势。可能是超声波机械剪切作用会使一部分多糖降解，造成得率降低。所以多糖提取时超声时间不宜过长，本试验选择超声30min，得率最高。
3.3.1.3超声波功率对榛蘑多糖得率影响
固定料液比1:40，温度60℃，提取时间30min，改变超声功率。

图3-4不一样超声功率下榛蘑多糖得率

试验结果图3-4所表示：伴随超声波功率不停提升，多糖得率不停升高，在功率达成300W时，得率达成最大，以后伴随功率提升得率呈下降趋势。因为强超声波作用可能造成多糖糖苷键断裂, 造成榛蘑多糖降解为单糖或小分子还原糖，使得率下降，所以提取功率不宜太高。所以本试验中，超声功率控制在300W很好。
3.3.1.4超声温度对榛蘑多糖得率影响
固定超声波功率250W，提取时间30min，料液比1:40，改变温度。

图3-5不一样温度下榛蘑多糖得率

试验结果图3-3所表示：伴随温度升高，多糖得率缓慢提升，在60℃时，得率达成最大，以后略微下降。说明过高温度不利于多糖提取，在植物中多糖多和蛋白质结合为糖蛋白。温度高使蛋白质变性，不利于糖蛋白析出。所以本试验中，把超声温度控制在60℃较为适宜。
3.3.2超声波法提取榛蘑多糖工艺优化
依据单原因试验结果，得出对多糖得率影响突出相关原因，关键影响原因为料液比、超声温度、超声波功率、超声时间。所以，为了愈加好地考察提取最优条件，综合各个单原因，从而深入设计正交试验，各组试验均根据常规试验方法进行，经过测定各组试验多糖