GB∕T 42491-2023 饲料中淀粉总含量的测定 酶法.pdf

ICS 65.120CCS B 46中年人民共和国国家标准GB/T 424912023饲料中淀粉总含量的测定 酶法Determination of total starch content in feedsEnzymatic method(ISO 15914：2004,Animal feeding stuffsEnzymatic determination of total starch content,MOD)2023-03-17 发布2023-10-01 实施国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会GB/T 424912023前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件修改采用ISO 15914：2004动物饲料 总淀粉含量的酶催化测定。本文件与ISO 15914:2004相比，在结构上有较多调整。本文件与ISO 15914：2004结构编号对照 一览表见附录A。本文件与ISO 15914:2004的技术差异及其原因如下：a）更改了适用范围（见第1章），细化了饲料产品类型；b）更改了淀粉含量定义（注）中含量的表示（见3.2）,将g/kg修改为，并对本文件中葡萄糖标准 溶液浓度和计算公式做了相应更改，以适应我国业内的习惯表示；c）增加了淀粉葡萄糖昔酶活测定方法（见附录B）和醒用量调整说明以及对酶的要求（见5.12）,为 方法使用者提供便利；d）更改了 40%乙醇溶液配制（见5.2）,以符合我国常用分析纯乙醇试剂的实际情况；e）更改了己糖激酶法定量测定葡萄糖试剂盒的规定（见5.13）,便于方法的使用；D 增加了样品制备的细度要求（见第7章），符合我国样品制备要求；g）更改、简化了二甲亚飒分散处理试样的程序（见8.2）,为方法使用者提供便利；h）增加了水解振荡速率要求（见8.2.2）,有利于方法的应用；i）更改了精密度的表述和要求（见第10章），有利于方法的应用；j）删除了检验报告,符合我国标准结构。本文件做了下列编辑性改动：将文件名称更改为饲料中淀粉总含量的测定醒法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。本文件起草单位:广州汇标检测技术中心、广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所、广东农科监测科技有限公司。本文件主要起草人:潘浣钮、王智民、万凯、王威利、周振新、卢丽枝、商方方、郝燕娟、陈诗欣、刘海燕、闵曼、冯敬宾、刘芳芳、何绮霞。IGB/T 424912023饲料中淀粉总含量的测定酶法1范围本文件描述了饲料和饲料原料中淀粉总含量的酶法测定方法。本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和饲料原料中淀粉总含量的测定，同时适用于纯淀 粉的含量测定。本文件不适用于基质中含有在340 nm波长处影响吸光度的成分的试样。本文件方法定量限为4%。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696：1987,MOD）注：GB/T 6682-2008被引用的内容与ISO 3696,1987被引用的内容没有技术上的差异。GB/T 201952006 动物饲料 试样的制备（ISO 6498：1998,IDT）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1淀粉 starch由1,4-a-D葡萄糖单位组成的无分支长直链（直链淀粉）和/或在-1,6位形成支链的a-1,4-糖昔 键连接的葡萄糖单位（支链淀粉）组成的天然植物性多聚物。3.2淀粉含量 starch content根据本文件测定的不溶于40%乙醇的淀粉及其高分子降解产物的质量分数。注：以百分数（）表示。4 原理试样用40%乙醇除去可溶性糖，经90%二甲基亚碉溶液100 分散，用浓盐酸60 溶解并部分分 解，试样中的淀粉再用淀粉葡萄糖甘酶进一步定量酶解为葡萄糖，葡萄糖的量用己糖激酶法测定，换算 成淀粉含量41。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。1GB/T 4249120235.1 水：GB/T 66822008,三级水。5.2 乙醇溶液（40%）：量取95%乙醇421 mL,加水稀释至1 000 mL,混匀。5.3 盐酸（HCD（12 mol/L）o5.4 氢氧化钠溶液（4 mol/L）：称取氢氧化钠40 g,溶于约50 mL水中，冷却后，定量转移至250 mL容 量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。5.5 乙酸溶液（2 mol/L）：量取59 mL冰乙酸，用水稀释并定容至500 mL,混匀。5.6 乙酸钠溶液（2 mol/L）：称取无水乙酸钠82.0 g,加水溶解并定容至500 mL,混匀。5.7 乙酸钠缓冲溶液（2 mol/L,pH4.8）：取乙酸溶液（5.5）41 mL,与乙酸钠溶液（5.6）59 mL混合，用乙酸或乙酸钠溶液调节pH至4.8,临用5.8 二甲基亚碉（DMSO）水野5.9 Carrez 澄清溶液，罗旗牝5.9.1 亚铁氟化钾海蠲解0.分称取三水合亚铁赢*|M弋*笳泳溶解并定容至1 000 mL,混匀。/5.9.2 乙酸锌濯瓶溶于O.5 mol/L乙酸）：称取二水合乙酸锌1 000 mL容量瓶 中，加水溶解粉冰凝 30 g溶于水，用水稀释并定容至1 000 mL,混匀。、5.11.1 葡萄糖标准溶液（痈于莓香量嬷断%獭扶）,:询萄糖标准溶液（p=15眼）：称取三份 35。mg关水有萄糖（精别哦j：廖）瓣瓶稀释至刻度，*用,配。5.11.2 葡萄糖标准溶液11（用于淀粉含糠恢%-2（）%的试样）：血萄穗标准溶液J=0&g/L）：称取三份35。mg无水葡萄糖（精确至碑置广。0 W容六中.用水稀释至刻度.临用现配。5.12淀粉葡萄糖甘而溶液;含量鼠/m藏专徽液（5.7）混合溶液。应在 并根据酶活调整的的称取/酶活按嬲录豌行测定，并根据酶活调整醉的称取量。/注1：不同破丽也供融的酶活定义不同。本文件中AMG的活性单位定义%.75条件下，1 min从糖 原中释放确蚓蚣 AMG的量即为1单位AMG。注2：10 mL酶溶液麟即定75不5,13 1葡萄糖紫外测般崛万翱 制、操作和保存。酶法，按试剂盒说明书进行配5.13.15.13.25.13.3底物-缓冲溶液：按照试剂盒说明书配制。酶溶液:按照试剂盒说明书配制。显色剂：按照试剂盒说明书配制。6仪器设备6.16.26.36.46.5分析天平：精度0.1 mg。离心机：最大转速不低于6 000 r/min0恒温水浴锅：控温精度士2 o恒温水浴锅：控温精度1。pH计:精度士0.01。2GB/T 4249120236.6 可调移液器：1OO 心、1 000；xL、5 mL。6.7 紫外可见分光光度计(带1 cm石英比色皿)或酶标仪。6.8 振荡器:转速大于或等于100 r/min。6.9 比色管：100 mL,可用于复合玻璃电极测量pH,宽颈,配备磨砂玻璃接头。6.10 旋涡混合器。6.11 恒温水浴振荡器:控温精度2,150 r/min200 r/min,而且能使试管在水浴中固定并平放。6.12 离心管:塑料或玻璃离心管，带盖，可密封，大于20 mL06.13 玻璃珠:直径3 mm。7样品按GB/T 201952006制备试样，至少200 g,粉碎使其全部通过0.425 mm孔径的分析筛，充分混 匀，装入容器中，密闭保存,备用。8试验步骤8.1 可溶性糖的去除平行做两份试验。称取试样约0.2 g,精确至0.1 mg。分别放入两支离心管(6.12)中，加入10 mL 乙醇溶液(5.2),水平放置在振荡器上，以100 r/min振荡10 min后，用1 300 r/min离心10 min,弃去 上清液，残渣重复提取一次，弃去上清液，残渣按8.2继续操作。8.2 淀给溶解和部分分解8.2.1 分散向残渣(8.D中加入15颗玻璃珠(6.13),边涡旋边向试样中加入10.0 mL DMSO水溶液(5.8),继 续涡旋混合直至悬浮液均匀无结块，旋紧管盖。同时取一支洁净的离心管作为试样空白溶液，除不加试 样外，与试样平行进行操作。注：在添加二甲基亚碉的过程中，确保样品均质化，防止形成微凝胶和结块。微凝胶和结块会导致结果偏低。8.2.2 部分水解将离心管水平放置在恒温振荡器中，1009水浴150 r/min,振荡30 min,冷却后，加入1.7 mL盐酸(5.3),混匀。盖好管盖，置(601)C水浴振荡水解30 min。8.2.3 调节 pH冷却后，将8.2.2离心管内容物定量转移至100 mL比色管，加入氢氧化钠溶液(5.4)5.0 mL和乙酸 钠缓冲液(5.7)2.5 mL,混匀，用pH计准确测定溶液的pH后,用稀盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH 至4.8士0.1,用水冲洗pH电极，洗液并入比色管中，用水稀释至刻度。8.3 将淀粉醵解为葡萄糖将比色管中的试样溶液(8.2.3)充分摇匀，迅速用移液管取5.00 mL置于干净离心管中，加入 0.125 mL AMG酶溶液(5.12),旋紧管盖，混匀，在(60士1)C水浴保温16 h以上，于沸水浴中灭活 15 min,取出冷却至室温，加入亚铁锐化钾溶液(5.9.D0.125 mL涡旋1 min,再加入乙酸锌溶液(5.9.2)0.125 mL涡旋1 mine离心管中溶液的量为5.375 mL,6 000 r/min离心10 min,取上清液备用。3GB/T 424912023向离心管剩余残渣中加入少量水，煮沸10 min,冷却，加碘溶液（5.10）0.2 mL,若出现蓝色,说明淀 粉酶解不完全，应重新从8.1检测该试样。8.4用酶法测定葡萄糖的含量8.4.1淀粉含量在20%以上试样：分别准确移取试样溶液（8.3）、试样空白溶液（8.2.1）、三个葡萄糖标准溶液I（5.11.1）和水空白溶液各0.5 mL,准确加水9.5 mL,混匀。8.4.2淀粉含量在4%20%试样：分别准确移取试样溶液（8.3）、试样空白溶液（8.2.1）、三个葡萄糖标准溶液D（5.11.2）和水空白溶液各0.5 mL,准确加水1.5 mL,混匀。如果预期试样淀粉含量较低（20%）,酶解淀粉时，可用其他的稀释比例，以提高测定的灵敏度。此时需用相同比例稀释试样无静随 8.4.3按试剂盒说明书进*加作，以力糖标准溶希码图果更加准确。标准校正的平均校正吸光度 归分析，根据校正于的葡个试样溶液的校正吸光度值式中：、Els试样溶断睡魂EOs试样溶液的应力7 Esb试样空白溶液吸光度用号s从葡萄糖标准溶液线性校准图杳出或线性回归方程计算得出试样溶液中葡萄糖的浓度Pl校准曲线的可靠性说明及排除试样基质对试样吸收影响的方法见附录C。9.2淀粉含量淀粉含量 叫以表示，按公式（3）计算。Pg 叫=一VX X V2 X0.9 y i1 000 X 7n0X 100(3)式中:Pg根据标准图或回归方程算出的试样溶液的葡萄糖含量,单位为克每升（g/L）；V 8.2.3试样调节pH后定容的体积（100 mL）,单位为毫升（mL）4GB/T 424912023V】8.3中所用的淀粉溶液体积(5.00 mL),单位为毫升(mL)；V2 用酶将淀粉转化为葡萄糖时的溶液总体积(5.375 mL),单位为毫升(mL)；0.9葡萄糖折算成淀粉的换算系数；m0-试样质量，单位为克(g)。结果四舍五人，保留至小数点后一位。用公式(3)计算淀粉含量时，应对8.4的试样进行与5.11的葡萄糖标准溶液相一致的稀释。10精密度综合附录D实验室间联合试验的结果及本文件试验研究中测试的数据,认定在重复性条件下，两 次独立测试结果的绝对差值，与其算术平均值的比值d应符合表1要求。表1精密度要求淀粉含量(切*)/%d/%44w,V201520M 38 V5012孙5055GB/T 424912023附录A（资料性）本文件与ISO 15914:2004结构编号对照表本文件与ISO 15914:2004相比在结构上有所调整，结构编号对照情况见表A.1。表A.1本文件与ISO 15914:2004的结构编号对照表本文件结构编号ISO 15914:2004 结构编号1122334455666.16.16.26.26.36.36.46.46.56.56.66.66.76.76.86.86.96.126.106.136.116.146.126.156.136.1677888.18.1,8.2,8.38.28.48.2.18.4.1,8.4.2,8.4.38.2.28.4.2,8.4.38.2.38.4.48.38.58.48.68.4.18.6.16GB/T 424912023表A.1本文件与ISO 15914:2004的结构编号对照表（续）本文件结构编号ISO 15914：2004 结构编号8.4.28.6.28.4.38.6.2991011附录A附录B附录C附录C附录D附录 B,10.1,10.2,10.37GB/T 424912023附录B(规范性)淀粉葡萄糖昔酶酶活测定方法B.1 原理在pH4.75的缓冲溶液中，以糖原作为底物,加入待测的淀粉葡萄糖甘酶，于25 水浴中准确孵育 5 min,之后终止反应，测定葡萄糖含量。B.2 试剂或材料B.2.1 乙酸溶液(2 mol/L)：同 5.5。B.2.2 乙酸钠溶液(2 mol/L):同5.6。B.2.3 乙酸钠缓冲溶液工(2 mol/L,pH4.8)：同5.7。B.2.4 乙酸钠缓冲液11(0.2 mol/L)：取乙酸钠缓冲液工(B.2.3)与水以1：9的比例混合，用乙酸或乙 酸钠溶液调节pH至4.75,临用现配。B.2.5 糖原溶液:称取牡蛎源糖原80 mg溶于10 mL水中，混匀。B.2.6 Tris溶液(0.3 mol/L)；取Tris试剂(三羟甲基氨基甲烷，Hn NO3)363 mg溶于10 mL水 中，混匀。B.3 仪器设备B.3.1 分析天平:精度0.1 mg。B.3.2 离心机:最大转速不低于6 000 r/minoB.3.3 具塞试管。B.3.4 恒温水浴锅:可调精度1七。B.3.5 pH 计:精确至 0.01。B.3.6 可调移液器：100 juLJ 000 山、5 mL。B.3.7 紫外可见分光光度计:带1 cm石英比色皿。B.3.8 旋涡混合器。B.3.9 秒表或定时器。B.4 试睡步骤B.4.1 样品:平行做两份试验，量取0.2 mol/L乙酸钠缓冲溶液(B.2.4)0.54 mL和糖原溶液(B.2.5)0.25 mL,置具塞试管中，混合，置于25匕水浴中预热5 min,加淀粉葡萄糖昔酶试样0.01 mL,混合，置 于25 水浴中精确计时反应5 min,迅速、准确地加入0.3 mol/L Tris溶液(B.2.6)0.2 mL,于沸水浴中 加热5 min,停止反应。参照&4的方法测定葡萄糖含量mi。B.4.2 空白溶液:量取0.2 mol/L乙酸缓冲液(B.2.4)0.54 mL和糖原溶液(B.2.5)0.25 mL,置具塞试管 中，混合，置于25 水浴中预热5 min,随后加入0.3 mol/L Tris溶液(B.2.6)0.2 mL,混合，加淀粉葡萄 糖昔酶试样0.01 mL,于沸水浴加热5 min,停止反应。参照&4的方法测定葡萄糖含量。B.5 酶活计算试样中淀粉葡萄糖昔酶酶活以X表示，按式(B.1)计算。8GB/T 424912023X 一（my m0）X N-180 X 5 X 0.01 X m 式中：m.试样中葡萄糖的含量，单位为微克（ptg）;m.空白溶液中葡萄糖的含量，单位为微克5g）;N酶的稀释倍数；180葡萄糖的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；5 反应时间，单位为分（min）；0.01反应的酶液的体积，单位为毫升（mL）；9GB/T 424912023附录C（资料性）操作程序中的注意事项C.1从统计学角度看,基于一个空白溶液和一个标准溶液，每个测定做三个重复，以线性回归方法计算 得到的校准曲线，比用一个空白溶液和五个不同浓度的标准溶液，每个测定做一次得到的校准曲线的可 靠性要好。C.2本方法假设试样基质对试样的吸收无影响，但每次做新基质的试样时都需要按下述方法证明这 一点。制备不含己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸一脱氢酶的显色剂（5.13.3）,取稀释过的试样溶液（按8.4.3）,同 时准备一个试样空白溶液于玻璃试管中，按测定方法将试样溶液与试样空白溶液分别和不含己糖激酶 和葡萄糖-6-磷酸一脱氢薄的显色液混合，反应30 min60 min后于340 nm处，测定其吸光度,试样溶 液与试样空白溶液吸光度之差不应超过0.002,如差异大于此值,则本方法不能用于该试样。本文件研 究的试样基质，包括淀粉、动物饲料、谷物（玉米、小麦、印第安粟）、冷冻干燥的马铃薯，均能满足此要求。10GB/T 424912023附录 D（资料性）实验室间联合试验结果D.1实验室间试验是在1998年根据ISO 5725-2进行的，有12个实验室参加试验，研究的试样包括脱 水木薯、蛋鸡料、小猪料、豌豆和奶牛复合饲料。统计得出的精密度试验结果见表D.lo表D.1实验室间对比试验的统计结果统计项目剔除界外值后保留的洲室 可接受的结果数 淀粉含量平均嘛%39.4重复性标准中隆（s，重复性变异鬃数/,重复性限（第 再现性标溜偏差*r）/%再现性变黑系数？/再现性限（量2.5月2小3牛饲4-脱水木嚼5蛋鸡料。D.2根据D.1提出的精密度D.2.1 重复性在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测定方法，在短时间内，对同一被测试样，相 互独立进行测定获得两个测定结果之间的绝对偏差，超过以下给出的重复性限r值的情况不大于5%0 豌豆、奶牛复合饲料和木薯：1.4%；小猪饲料：1.7%；蛋鸡饲料：4.8%。D.2.2再现性在不同实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测定方法，对同一被测试样，相互独立进 行测定获得两个测定结果之间的绝对偏差，超过以下给出的重复性限R值的情况不大于5%：11GB/T 424912023-小猪料：2.5%；-木薯：3.4%；奶牛复合饲料：3.6%蛋鸡饲料48%；-豌豆：5.0%012GB/T 424912023参考文献Cl ISO 5725-1：1994 Accuracy(trueness and precision)of measurement methods and results一 Part 1：General principles and definitions2 ISO 5725-2 Accuracy(trueness and precision)of measurement methods and results-Part 2：Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method3 BRUNT K.,SANDERS P.and ROZEMA T.The enzymatic determination of starch in food,feed and raw materials of the starch industry.Starch/Starke,50,1998,pp.413-4194 Method of enzymatic bioanalysis and food analysis.Boehringer Mannheim,1995,pp.46-49 and 126-129MILLER J.C.and MILLER J.N.Statistics for analytical chemistry,2nd edition,1992,pp.112-115,Ellis Horwood,New York,London,Toronto,Sydney,Tokyo,Singapore6 BRUNT K.Collaborative study concerning the enzymatic determination of starch in food,feed,and raw material for the starch industry.Starch/Starke,52,2000,pp.73-7513