细胞培养基本知识.ppt

细细胞培养基本知胞培养基本知识识1.根据中华人民共和国传染病防治法实施办法规定：凡从事致病性微生物实验的科研、教学和生产单位，作为各类传染病菌（毒）研究操作的基本单元，实验室必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防护措施。不同危害群的微生物必须在不同的物理性防护的条件下进行操作，一方面防止实验人员和其他物品受到污染，同时也防止其释放到环境中。2.传染病原危害等级。第一级危害群微生物：与人类成人健康和疾病无关；（无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物第二级危害群微生物：在人类所引起的疾病很少是严重的，而且通常有预防及治疗的方法；（个体危险中等，群体危险低）实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限。第三级危害群微生物：在人类可以引起严重或致死的疾病，可能有预防和治疗的方法；第四级危害群微生物：在人类可以引起严重或致死的疾病，通常无预防和治疗的方法，如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。3.隔离的设备、实验室的设计及实验实施等3个方面所组成.根据其密封程度的不同，分为P1、P2、P3和P4四个生物安全等级。P是英文protect（保护）的缩写。四级生物安全（P4）是生物安全实验室等级最高的实验室，可以有效阻止传染性病原释放到环境中，同时给研究人员提供生物安全的保证。实验室可分：基础实验室一级生物安全水平、基础实验室二级生物安全水平、防护实验室三级生物安全水平最高防护实验室四级生物安全水平。根据操作不同危险度，等级微生物所需的实验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平。有关的手册有叙述：与不同危险度等级相对应的（而非“等同的”）各危险度等级微生物所要求的实验室生物安全水平。生物安全生物安全实验实验室（室（P1、P2、P3、P4）4.11级级基基础实验础实验室室一一级级生物安全水平基生物安全水平基础础的教学、研究的教学、研究,GMT,GMT不需要；开放不需要；开放实验实验台台22级级基基础实验础实验室室二二级级生物安全水平生物安全水平初初级卫级卫生服生服务务；诊诊断、研究断、研究GMTGMT加防加防护护服、生物危服、生物危害害标标志志开放开放实验实验台，此外台，此外需需BSCBSC用于防用于防护护可能生可能生成的气溶胶成的气溶胶5.33级级防防护实验护实验室室三三级级生物安全水平特殊的生物安全水平特殊的诊诊断、研断、研究究，在二，在二级级生物安全防生物安全防护护水平上增加特殊水平上增加特殊防防护护服、服、进进入制度、定向气流入制度、定向气流BSCBSC和或其他所和或其他所有有实验实验室工作所需要的基本室工作所需要的基本设备设备44级级最高防最高防护实验护实验室室四四级级生物安全水平生物安全水平危危险险病原体研究在三病原体研究在三级级生物安全防生物安全防护护水平上增水平上增加气加气锁锁入口、出入口、出口淋浴、口淋浴、污污染物品的特殊染物品的特殊处处理理级级BSCBSC或或级级BSCBSC。穿着正。穿着正压压服、双开服、双开门门高高压灭压灭菌器（穿菌器（穿过墙过墙体）、体）、经过滤经过滤的空气。的空气。BSCBSC：生物安全柜；：生物安全柜；GMTGMT：微生物学操作技：微生物学操作技术规术规范范6.我国在生物安全方面也制定过一些相应的条例和法规。中华人民共和国卫生行业标准（WS2332002）微生物生物医学实验室生物安全通用准则中对生物安全三级（P3）实验室进行了规定。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。7.在一级生物安全水平操作的微生物不太可能引起人类疾病或兽医学意义的动物疾病。但理想的做法是，所有实验室工作人员应进行上岗前的体检，并记录其病史。疾病和实验室意外事故应迅速报告，所有工作人员都应意识到应用规范的实验室操作技术的重要性。在二级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员1、必须有录用前或上岗前的体检。记录个人病史，并进行一次有目的的职业健康评估。2、实验室管理人员要保存工作人员的疾病和缺勤记录。3、育龄期妇女应知道某些微生物（如风疹病毒）的职业暴露对未出生孩子的危害。8.培训人人为为的失的失误误和不和不规规范的操作会影响所采取的安全措施范的操作会影响所采取的安全措施对实验对实验室人室人员员的防的防护护效果。因此，熟悉如何效果。因此，熟悉如何识别识别与控制与控制实验实验室危害的、有安全意室危害的、有安全意识识的工作人的工作人员员，是，是预预防防实验实验室感染、差室感染、差错错和事故的关和事故的关键键。管理者管理者应应确保将安全的确保将安全的实验实验室操作及程序融合到工作人室操作及程序融合到工作人员员的基本培的基本培训训中。中。所有所有实验实验室工作人室工作人员员都会都会经经常遇到的高危操作，包括：常遇到的高危操作，包括：1、吸入危、吸入危险险（气溶胶（气溶胶产产物），如使用接种物），如使用接种环环、划、划线线接种接种琼琼脂平板、移液、脂平板、移液、制作涂片、打开培养物、采集血液血清制作涂片、打开培养物、采集血液血清标标本、离心等本、离心等2、食入危、食入危险险，如，如处处理理标标本、涂片以及培养物本、涂片以及培养物3、在使用注射器和、在使用注射器和针头时针头时刺刺伤伤皮肤的危皮肤的危险险4、处处理理动动物物时时被咬被咬伤伤、抓、抓伤伤5、处处理血液以及其他有潜在病理学危害的材料理血液以及其他有潜在病理学危害的材料6、感染性材料的清除、感染性材料的清除污污染和染和处处理。理。9.典型的二级生物安全水平实验室门保持关闭并贴上适当的危险标志。潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开。基本生物安全设备1、移液辅助器避免用口吸的方式移液2、生物安全柜，在以下情况使用：处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则这类材料可在开放实验室离心空气传播感染的危险增大时进行极有可能产生气溶胶的操作时（包括离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。3、一次性塑料接种环，也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。4、螺口盖试管及瓶子。5、用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。6、一次性巴斯德塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。7、在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。10.废弃物处理首要原则：所有感染性材料必须在实验室内清除污染、高压灭菌或焚烧。用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题有：1、是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？2、丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？3.清除污染高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。任何高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、修复必须在高压灭菌或消毒后进行。也可采用其他除去或杀灭微生物的替代方法4.污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理，相关工作要遵守国家和国际规定。11.合适的合适的合适的合适的环环环环境和必需的条件境和必需的条件境和必需的条件境和必需的条件1营营养养需需要要22环环环环境境境境要要要要求求求求3无毒及无无毒及无污污染染12.无无 毒：毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。无无污污染染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染细细菌菌霉菌霉菌支原体支原体等等13.实验准备实验实验用品：用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管14.自动双重纯水蒸馏器 纯水仪16.滤器17.酶标仪 微孔板震荡器18.培 养 板 及瓶19.清洗清洗 在在在在组织细组织细组织细组织细胞培养中，体外胞培养中，体外胞培养中，体外胞培养中，体外细细细细胞胞胞胞对对对对任何有害物任何有害物任何有害物任何有害物质质质质都非都非都非都非常敏感常敏感常敏感常敏感,均能影响培养均能影响培养均能影响培养均能影响培养细细细细胞的生胞的生胞的生胞的生长长长长 微生物微生物微生物微生物产产产产品附品附品附品附带杂带杂带杂带杂物物物物 上次上次上次上次细细细细胞残留物胞残留物胞残留物胞残留物 非非非非营营营营养成分的化学物养成分的化学物养成分的化学物养成分的化学物质质质质 需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗 塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗20.玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 包括包括包括包括浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸和和和和冲洗冲洗冲洗冲洗四个步四个步四个步四个步骤骤骤骤浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲洗、洗、60烘干、酸泡（烘干、酸泡（24小小时时）、流水冲洗、）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、60烘干烘干 清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿 干干干干净净净净透明无油迹透明无油迹透明无油迹透明无油迹 不能残留任何物不能残留任何物不能残留任何物不能残留任何物质质质质21.浸泡浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物浸泡，以使附着物浸泡，以使附着物浸泡，以使附着物软软软软化或被溶掉化或被溶掉化或被溶掉化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生新的初次使用的玻璃器皿，在生新的初次使用的玻璃器皿，在生新的初次使用的玻璃器皿，在生产产产产及运及运及运及运输过输过输过输过程中，玻璃表程中，玻璃表程中，玻璃表程中，玻璃表面面面面带带带带有大量的干固的灰有大量的干固的灰有大量的干固的灰有大量的干固的灰尘尘尘尘，且玻璃表面常呈碱性及，且玻璃表面常呈碱性及，且玻璃表面常呈碱性及，且玻璃表面常呈碱性及带带带带有一有一有一有一些些些些对细对细对细对细胞有害的物胞有害的物胞有害的物胞有害的物质质质质等等等等 先用自来水先用自来水先用自来水先用自来水简单简单简单简单刷洗，然后用刷洗，然后用刷洗，然后用刷洗，然后用5 5稀稀稀稀盐盐盐盐酸液浸泡酸液浸泡酸液浸泡酸液浸泡过过过过夜，夜，夜，夜，以中和其中的碱性物以中和其中的碱性物以中和其中的碱性物以中和其中的碱性物质质质质 再次使用的玻璃器皿再次使用的玻璃器皿再次使用的玻璃器皿再次使用的玻璃器皿则则则则常附有大量常附有大量常附有大量常附有大量刚刚刚刚使用使用使用使用过过过过的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质质质质，干，干，干，干固后不易洗掉固后不易洗掉固后不易洗掉固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上浮在液面上浮在液面上浮在液面上22.刷洗：刷洗：用毛刷沾洗用毛刷沾洗涤剂涤剂刷洗，以除去器皿表面附刷洗，以除去器皿表面附着着较较牢的牢的杂质杂质 刷洗要适度，刷洗要适度，过过度会度会损损害器皿表面光害器皿表面光泽泽度度23.浸酸：浸酸：玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清玻璃器皿浸泡到清洁洁洁洁液中液中液中液中 清清清清洁洁洁洁液液液液对对对对玻璃器皿无腐玻璃器皿无腐玻璃器皿无腐玻璃器皿无腐蚀蚀蚀蚀作用，而其作用，而其作用，而其作用，而其强强强强氧化作用可除掉刷洗氧化作用可除掉刷洗氧化作用可除掉刷洗氧化作用可除掉刷洗不掉的微量不掉的微量不掉的微量不掉的微量杂质杂质杂质杂质 浸泡浸泡浸泡浸泡时时时时器皿要充器皿要充器皿要充器皿要充满满满满清清清清洁洁洁洁液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清液，勿留气泡或器皿露出清洁洁洁洁液面液面液面液面 浸泡浸泡浸泡浸泡时间时间时间时间：一般：一般：一般：一般为过为过为过为过夜，不夜，不夜，不夜，不应应应应少于少于少于少于6 6 6 6 小小小小时时时时 清清清清洁洁洁洁液液液液 常用三种：重常用三种：重常用三种：重常用三种：重铬铬铬铬酸酸酸酸钾钾钾钾（g g g g）浓浓浓浓硫酸（硫酸（硫酸（硫酸（mlmlmlml）蒸）蒸）蒸）蒸馏馏馏馏水（水（水（水（mlmlmlml）强强强强清清清清洁洁洁洁液液液液 631000200 631000200 631000200 631000200 次次次次强强强强清洗液清洗液清洗液清洗液 120 2001000 120 2001000 120 2001000 120 2001000 弱清弱清弱清弱清洁洁洁洁液液液液 100 1001000 100 1001000 100 1001000 100 1001000 配制配制配制配制时应时应时应时应注意安全，注意安全，注意安全，注意安全，须须须须穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和穿戴耐酸手套和围围围围裙，并要保裙，并要保裙，并要保裙，并要保护护护护好面部好面部好面部好面部及身体裸露部分及身体裸露部分及身体裸露部分及身体裸露部分 配制配制配制配制过过过过程中可使重程中可使重程中可使重程中可使重铬铬铬铬酸酸酸酸钾钾钾钾溶于水中，然后慢慢加溶于水中，然后慢慢加溶于水中，然后慢慢加溶于水中，然后慢慢加浓浓浓浓硫酸。并不硫酸。并不硫酸。并不硫酸。并不停的用玻璃棒停的用玻璃棒停的用玻璃棒停的用玻璃棒搅搅搅搅拌，使拌，使拌，使拌，使产产产产生的生的生的生的热热热热量量量量挥发挥发挥发挥发，配制溶液，配制溶液，配制溶液，配制溶液应选择应选择应选择应选择塑料塑料塑料塑料制品。配成后清制品。配成后清制品。配成后清制品。配成后清洁洁洁洁液一般液一般液一般液一般为为为为棕棕棕棕红红红红色色色色24.冲洗冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必在使用后，刷洗及浸泡后都必在使用后，刷洗及浸泡后都必在使用后，刷洗及浸泡后都必须须须须用水充分用水充分用水充分用水充分冲洗。使之尽量不留冲洗。使之尽量不留冲洗。使之尽量不留冲洗。使之尽量不留污污污污染或清染或清染或清染或清洁洁洁洁液的残迹液的残迹液的残迹液的残迹 最好用洗最好用洗最好用洗最好用洗涤涤涤涤装置装置装置装置 如用手工操作如用手工操作如用手工操作如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水需流水冲洗十次以上，每次水须须须须灌灌灌灌满满满满及倒干及倒干及倒干及倒干净净净净，最好用蒸最好用蒸最好用蒸最好用蒸馏馏馏馏水清洗水清洗水清洗水清洗3-5 3-5 3-5 3-5 次，晾干次，晾干次，晾干次，晾干备备备备用用用用25.胶塞的清洗胶塞的清洗 新新新新购购购购置的瓶塞置的瓶塞置的瓶塞置的瓶塞带带带带有大量滑石粉及有大量滑石粉及有大量滑石粉及有大量滑石粉及杂质杂质杂质杂质，应应应应先用先用先用先用自来水冲洗，再做常自来水冲洗，再做常自来水冲洗，再做常自来水冲洗，再做常规处规处规处规处理理理理 常常常常规规规规清洗方法清洗方法清洗方法清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 或洗衣粉或洗衣粉或洗衣粉或洗衣粉煮沸煮沸煮沸煮沸10-20 10-20 10-20 10-20 分分分分钟钟钟钟（以除掉培养中的蛋白（以除掉培养中的蛋白（以除掉培养中的蛋白（以除掉培养中的蛋白质质质质），自来），自来），自来），自来水冲洗，蒸水冲洗，蒸水冲洗，蒸水冲洗，蒸馏馏馏馏水冲洗水冲洗水冲洗水冲洗2-32-32-32-3次，晾干次，晾干次，晾干次，晾干备备备备用用用用26.塑料制品的清洗塑料制品的清洗 塑料制品塑料制品塑料制品塑料制品现现现现多是采用无毒并已多是采用无毒并已多是采用无毒并已多是采用无毒并已经经经经特殊特殊特殊特殊处处处处理的包装，打理的包装，打理的包装，打理的包装，打开包装即可用，多开包装即可用，多开包装即可用，多开包装即可用，多为为为为一次性物品一次性物品一次性物品一次性物品 必要必要必要必要时时时时用用用用2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 浸泡浸泡浸泡浸泡过过过过夜，用自来水充分冲洗，再夜，用自来水充分冲洗，再夜，用自来水充分冲洗，再夜，用自来水充分冲洗，再用用用用5%5%5%5%盐盐盐盐酸溶液浸泡酸溶液浸泡酸溶液浸泡酸溶液浸泡30 30 30 30 分分分分钟钟钟钟，最后用自来水和蒸，最后用自来水和蒸，最后用自来水和蒸，最后用自来水和蒸馏馏馏馏水水水水冲洗干冲洗干冲洗干冲洗干净净净净，晾干，晾干，晾干，晾干备备备备用用用用 本本本本实验实验实验实验：自来水洗、蒸自来水洗、蒸自来水洗、蒸自来水洗、蒸馏馏馏馏水洗、蒸水洗、蒸水洗、蒸水洗、蒸馏馏馏馏水煮、甩干水、干水煮、甩干水、干水煮、甩干水、干水煮、甩干水、干燥、装盒；燥、装盒；燥、装盒；燥、装盒；消毒。消毒。消毒。消毒。27.消毒消毒 细细细细胞培养的最大危胞培养的最大危胞培养的最大危胞培养的最大危险险险险是是是是发发发发生培养物的生培养物的生培养物的生培养物的细细细细菌、菌、菌、菌、真菌和病毒等微生物的真菌和病毒等微生物的真菌和病毒等微生物的真菌和病毒等微生物的污污污污染染染染 常常常常见见见见原因：原因：原因：原因：操作操作操作操作间间间间或周或周或周或周围围围围空空空空间间间间的不的不的不的不洁洁洁洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不培养器皿和培养液消毒不合格或不培养器皿和培养液消毒不合格或不培养器皿和培养液消毒不合格或不彻彻彻彻底底底底 由于有关培养的每个由于有关培养的每个由于有关培养的每个由于有关培养的每个环节环节环节环节的失的失的失的失误误误误均能均能均能均能导导导导致培致培致培致培养失养失养失养失败败败败，故，故，故，故细细细细胞培养的每个胞培养的每个胞培养的每个胞培养的每个环节环节环节环节都都都都应严应严应严应严格遵格遵格遵格遵守操作常守操作常守操作常守操作常规规规规，防止，防止，防止，防止发发发发生生生生污污污污染染染染28.消毒消毒灭灭菌方法菌方法 物理消毒物理消毒物理消毒物理消毒灭灭灭灭菌法菌法菌法菌法 紫外紫外紫外紫外线线线线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法用于空气，操作台表面和不能使用其它法用于空气，操作台表面和不能使用其它法用于空气，操作台表面和不能使用其它法进进进进行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，30min30min30min30min 湿湿湿湿热热热热（高（高（高（高压压压压蒸气蒸气蒸气蒸气灭灭灭灭菌法）：菌法）：菌法）：菌法）：121121121121，20min20min20min20min 干烤：干烤：干烤：干烤：160,2 160,2 160,2 160,2 小小小小时时时时 过滤过滤过滤过滤：0.220.220.220.22mmmm 化学消毒化学消毒化学消毒化学消毒灭灭灭灭菌法菌法菌法菌法 70%70%70%70%酒精酒精酒精酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处处处处理理理理 1111新新新新洁洁洁洁尔尔尔尔灭灭灭灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试试试试消毒消毒消毒消毒 抗生素抗生素抗生素抗生素 主要用于培养用液主要用于培养用液主要用于培养用液主要用于培养用液灭灭灭灭菌或菌或菌或菌或预预预预防培养物防培养物防培养物防培养物污污污污染染染染29.细细胞培养基胞培养基应应用用选择选择选择选择培养基没有一定的培养基没有一定的标标准，有几点建准，有几点建议议可供参考：可供参考：(1(1）建立某种）建立某种细细胞株所用的培养基胞株所用的培养基应该应该是培养是培养这这种种细细胞首胞首选选的培养的培养基。可以基。可以查阅查阅参考文献，或在参考文献，或在购买细购买细胞株胞株时时咨咨询询。(2)(2)其它其它实验实验室室惯惯用的培养基不妨一用的培养基不妨一试试，许许多培养基可以适合多种多培养基可以适合多种细细胞。胞。(3)(3)根据根据细细胞株的特点、胞株的特点、实验实验的需要来的需要来选择选择培养基。如小鼠培养基。如小鼠细细胞株胞株多多选选 RPMI1640 RPMI1640。(4)(4)用多种培养基培养目的用多种培养基培养目的细细胞，胞，观观察其生察其生长长状状态态，可以用生，可以用生长长曲曲线线、集落形成率等指、集落形成率等指标标判断，根据判断，根据实验结实验结果果选择选择最佳培养基，最佳培养基，这这是是最客最客观观的方法，但比的方法，但比较较繁繁琐琐。常用的培养基种常用的培养基种常用的培养基种常用的培养基种类类类类 RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640（标标标标准型）、准型）、准型）、准型）、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-高糖（高糖（高糖（高糖（标标标标准型）、准型）、准型）、准型）、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-低糖（低糖（低糖（低糖（标标标标准型）、准型）、准型）、准型）、McCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5A、M199M199M199M199、F10F10F10F10等等等等 30.制备1000mlRPMI1640培养基RPMI1640干粉培养基10.4g（1包）蒸馏水400ml磁力搅拌至完全溶解加三蒸馏水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-细胞培养液31.胰蛋白胰蛋白胰蛋白胰蛋白酶酶酶酶溶液溶液溶液溶液：胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间间粘粘蛋蛋白白及及糖糖蛋蛋白白，影影响响细细胞胞骨骨架架，从而使从而使细细胞分离。胞分离。胰胰蛋蛋白白酶酶液液浓浓度度越越高高，作作用用越越强强，但但超超过过一一定定限度会限度会损伤细损伤细胞。胞。胰蛋白胰蛋白酶酶液消化液消化时间时间：2-102-10分分钟钟。用含血清培养液用含血清培养液终终止其止其对细对细胞的消化作用胞的消化作用 32.称取胰蛋白称取胰蛋白酶酶粉末置粉末置烧烧杯中，用少杯中，用少许许D-D-Hanks Hanks 平衡平衡盐盐溶液溶液调调成糊状，再成糊状，再补补足足D-D-Hanks Hanks 平衡平衡盐盐溶液，溶液，搅搅拌混匀，置室温拌混匀，置室温4 4 小小时时或冰箱或冰箱过过夜，不断夜，不断搅搅拌振拌振荡荡 次日，先用次日，先用滤纸滤纸粗粗滤滤，再，再进进行行过滤过滤除菌，分除菌，分装入瓶中，装入瓶中，-20-20保存保存备备用用（以免分解失效）（以免分解失效），常用常用浓浓度度为为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）胰蛋白胰蛋白酶酶溶液偏酸，使用前可用碳酸溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠氢钠溶溶液液调调pH pH 至至7.2 7.2 左右左右胰蛋白胰蛋白酶酶溶液配制溶液配制33.D-Hanks D-Hanks D-Hanks D-Hanks 平衡平衡平衡平衡盐盐盐盐溶液溶液溶液溶液(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)KClKClKClKCl0.40g0.40g0.40g0.40gKH2PO4KH2PO4KH2PO4KH2PO40.06g0.06g0.06g0.06gNaClNaClNaClNaCl8.00g8.00g8.00g8.00gNaCO3NaCO3NaCO3NaCO3 0.35g 0.35g 0.35g 0.35gNa2HPO4Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO40.048g0.048g0.048g0.048gD-GlucoseD-GlucoseD-GlucoseD-Glucose1.00g1.00g1.00g1.00gPhenol RedPhenol RedPhenol RedPhenol Red0.01g0.01g0.01g0.01g34.血清血清 热灭热灭热灭热灭活：活：活：活：56,30 56,30 56,30 56,30 分分分分钟钟钟钟加加加加热热热热已完全解已完全解已完全解已完全解冻冻冻冻的血清的血清的血清的血清 热灭热灭热灭热灭活目的：活目的：活目的：活目的：灭灭灭灭活血清中的活血清中的活血清中的活血清中的补补补补体成分。体成分。体成分。体成分。如果不做如果不做如果不做如果不做细细细细胞因子和免疫相关的胞因子和免疫相关的胞因子和免疫相关的胞因子和免疫相关的实验实验实验实验，建，建，建，建议议议议血清不要血清不要血清不要血清不要灭灭灭灭活。活。活。活。因因因因为热处为热处为热处为热处理会造成血清沉淀物理会造成血清沉淀物理会造成血清沉淀物理会造成血清沉淀物显显显显著增多，著增多，著增多，著增多，还还还还会影会影会影会影响血清的响血清的响血清的响血清的质质质质量。量。量。量。灭灭灭灭活后活后活后活后严严严严重影响重影响重影响重影响细细细细胞生胞生胞生胞生长长长长速度，且速度，且速度，且速度，且细细细细胞胞胞胞贴贴贴贴壁率降低。壁率降低。壁率降低。壁率降低。血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物 絮状物絮状物絮状物絮状物：血清中的脂蛋白：血清中的脂蛋白：血清中的脂蛋白：血清中的脂蛋白变变变变性及解性及解性及解性及解冻冻冻冻后血清中后血清中后血清中后血清中纤维纤维纤维纤维蛋白造蛋白造蛋白造蛋白造成，成，成，成，这这这这些絮状物不会影响血清本身的些絮状物不会影响血清本身的些絮状物不会影响血清本身的些絮状物不会影响血清本身的质质质质量。可用离心量。可用离心量。可用离心量。可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 3000rpm,5 3000rpm,5 分分分分钟钟钟钟去除，也可不用去除，也可不用去除，也可不用去除，也可不用处处处处理理理理 显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下“小黑点小黑点小黑点小黑点”：经过热处经过热处经过热处经过热处理理理理过过过过的血清，沉淀物的形的血清，沉淀物的形的血清，沉淀物的形的血清，沉淀物的形成会成会成会成会显显显显著增多。有些沉淀物在著增多。有些沉淀物在著增多。有些沉淀物在著增多。有些沉淀物在显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下观观观观察象察象察象察象“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常，常，常，常误认为误认为误认为误认为血清受血清受血清受血清受污污污污染。一般情况下，此小黑点不会影响染。一般情况下，此小黑点不会影响染。一般情况下，此小黑点不会影响染。一般情况下，此小黑点不会影响细细细细胞生胞生胞生胞生长长长长，但如果，但如果，但如果，但如果怀怀怀怀疑血清疑血清疑血清疑血清质质质质量，量，量，量，则应则应则应则应立即停止使用，更立即停止使用，更立即停止使用，更立即停止使用，更换换换换另一批号的血清另一批号的血清另一批号的血清另一批号的血清35.血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟血清的消毒：过滤除菌36.EDTA4Na EDTA4Na 溶液溶液 一种化学螯合一种化学螯合剂剂，对细对细胞有一定的离散作胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液常用工作液浓浓度度为为0.02%0.02%。注意：使用注意：使用注意：使用注意：使用EDTA EDTA EDTA EDTA 处处处处理理理理细细细细胞后，要用平衡胞后，要用平衡胞后，要用平衡胞后，要用平衡盐盐盐盐液冲液冲液冲液冲洗干洗干洗干洗干净净净净，因残留的，因残留的，因残留的，因残留的EDTA EDTA EDTA EDTA 会影响会影响会影响会影响细细细细胞生胞生胞生胞生长长长长 EDTA EDTA 溶液配制：用溶液配制：用D-Hanks D-Hanks 平衡平衡盐盐溶溶液溶解后，高液溶解后，高压压蒸汽蒸汽灭灭菌，分装成小瓶，菌，分装成小瓶，44冰箱保存冰箱保存37.消化液消化液 分离分离组织组织和分散和分散细细胞胞 常用的有胰蛋白常用的有胰蛋白酶酶和二乙胺四乙酸二和二乙胺四乙酸二钠钠(EDTA)(EDTA)两种溶液两种溶液 单单独或混合使用独或混合使用38.pH pH 调调整液整液 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 溶液溶液溶液溶液 常用常用常用常用浓浓浓浓度度度度为为为为7.5%7.5%7.5%7.5%。配制。配制。配制。配制时时时时用三蒸水溶解后，用三蒸水溶解后，用三蒸水溶解后，用三蒸水溶解后，过滤过滤过滤过滤除菌除菌除菌除菌或高或高或高或高压灭压灭压灭压灭菌，分装，菌，分装，菌，分装，菌，分装，4444保存保存保存保存 HEPESHEPESHEPESHEPES（分子量（分子量（分子量（分子量238.31238.31238.31238.31）溶液）溶液）溶液）溶液一种弱酸，中文名字是一种弱酸，中文名字是羟羟乙基乙基哌哌秦乙硫磺酸，秦乙硫磺酸，对细对细胞胞无毒性无毒性主要作用主要作用:防止培养基防止培养基pHpH迅速迅速变动变动。在开放式培养条件。在开放式培养条件下，下，观观察察细细胞胞时时培养基脱离了培养基脱离了5%CO25%CO2的的环环境，境，CO2CO2气体气体迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此，此时时可以可以维维持持pH7.0pH7.0左右。一般在左右。一般在进进行克隆化培养行克隆化培养时时要添加要添加HEPESHEPES 使用使用使用使用终浓终浓终浓终浓度一般度一般度一般度一般为为为为10-5010-5010-5010-50mmol/Lmmol/L 常配成常配成常配成常配成1M 1M 1M 1M 储储储储存液：用存液：用存液：用存液：用20ml 20ml 20ml 20ml 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解4.764.764.764.76克克克克HEPESHEPESHEPESHEPES，过滤过滤过滤过滤除菌或高除菌或高除菌或高除菌或高压灭压灭压灭压灭菌，分装小瓶，菌，分装小瓶，菌，分装小瓶，菌，分装小瓶，4444保存。保存。保存。保存。使用使用时时可可向向100ml100ml培养液中加入培养液中加入2ml 2ml HEPESHEPESHEPESHEPES浓缩浓缩液，液，终浓终浓度度为为20mmol/L 20mmol/L 39.抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定40.器材和液体的准器材和液体的准备备 细细细细胞培养用的玻璃器材胞培养用的玻璃器材胞培养用的玻璃器材胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干培养瓶、吸管等在清洗干培养瓶、吸管等在清洗干培养瓶、吸管等在清洗干净净净净以后，装在以后，装在以后，装在以后，装在铝铝铝铝盒和盒和盒和盒和铁铁铁铁筒中，筒中，筒中，筒中，160160160160，2 2 2 2小小小小时时时时干烤或干烤或干烤或干烤或15151515磅，磅，磅，磅，121121121121，20202020分分分分钟钟钟钟蒸气蒸气蒸气蒸气灭灭灭灭菌后菌后菌后菌后备备备备用用用用 手手手手术术术术器材、瓶塞、配制好的器材、瓶塞、配制好的器材、瓶塞、配制好的器材、瓶塞、配制好的PBSPBSPBSPBS液液液液 15151515磅，磅，磅，磅，121121121121，20202020分分分分钟钟钟钟蒸气蒸气蒸气蒸气灭灭灭灭菌菌菌菌 MEMMEMMEMMEM培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液 用用用用G6G6G6G6滤滤滤滤器器器器负压负压负压负压抽抽抽抽滤滤滤滤后后后后备备备备用用用用41.完全培养基的组成基础培养基80一95血清5一20碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位毫升42.无菌操作中的注意事无菌操作中的注意事项项 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁洁洁洁 操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 30-60 30-60 30-60 分分分分钟灭钟灭钟灭钟灭菌，以菌，以菌，以菌，以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台启无菌操作台启无菌操作台启无菌操作台风风风风扇运扇运扇运扇运转转转转10 10 10 10 分分分分钟钟钟钟 操作操作操作操作时时时时，小心取用无菌之，小心取用无菌之，小心取用无菌之，小心取用无菌之实验实验实验实验物品，避免造成物品，避免造成物品，避免造成物品，避免造成污污污污染。染。染。染。勿碰触吸管尖勿碰触吸管尖勿碰触吸管尖勿碰触吸管尖头头头头部或容器瓶口，亦不要在打开之容部或容器瓶口，亦不要在打开之容部或容器瓶口，亦不要在打开之容部或容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作器正上方操作器正上方操作器正上方操作实验实验实验实验。容器打开后，以手。容器打开后，以手。容器打开后，以手。容器打开后，以手夹夹夹夹住瓶盖并住瓶盖并住瓶盖并住瓶盖并握住瓶身，握住瓶身，握住瓶身，握住瓶身，倾倾倾倾斜斜斜斜约约约约45454545角取用角取用角取用角取用 在整个无菌操作在整个无菌操作在整个无菌操作在整个无菌操作过过过过程中都程中都程中都程中都应该应该应该应该在酒精灯的周在酒精灯的周在酒精灯的周在酒精灯的周围进围进围进围进行行行行43.