黄花苜蓿MfNAC34基因克隆及特性分析.pdf

第 46 卷 第 3 期Vol.46 No.3 2024 年 3 月Mar.2024中 国 草 地 学 报Chinese Journal of Grassland黄花苜蓿 MfNAC34基因克隆及特性分析张立全1，常娜1，2，赵志远1，赵永秀1（1.内蒙古大学生命科学学院/牧草与特色作物生物学教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010070；2.呼和浩特市第三十五中学，内蒙古 呼和浩特 010021）摘要：NAC转录因子具有调节植物生长发育和应答非生物胁迫的功能。本研究从内蒙古锡林郭勒草原野生黄花苜蓿材料中克隆获得 1个 NAC家族蛋白基因 MfNAC34（GenBank登录号为 MH481768），分析 MfNAC34基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和转录激活特性。结果显示：MfNAC34基因开放阅读框序列为 621 bp，编码亲水性蛋白质，分子量为23.52 kD，理论等电点为4.09。MfNAC34为定位在细胞核内的胁迫诱导的转录因子，且转录激活域位于其C端。关键词：黄花苜蓿；MfNAC34；特性分析中图分类号：Q943.2；S541.9 文献标志码：A 文章编号：1673-5021（2024）03-0022-06低温、高盐和干旱是影响作物分布和产量的重要非生物胁迫因子。黄花苜蓿（Medicago falcata）又称野苜蓿，是豆科苜蓿属植物，具有极强的耐寒、抗旱性13，且与紫花苜蓿的遗传背景相似，是苜蓿抗逆性育种的重要种质资源和基因库12，4。但是，黄花苜蓿强抗逆性的生物化学及分子机制尚未被全面认知。因此，挖掘黄花苜蓿抗逆性相关基因，探究其调节抗逆性的功能和机制，进而全面认知黄花苜蓿优质种质资源的抗逆性，并为作物抗逆性改良提供具有潜在应用价值的相关基因具有重要的学术意义和应用价值5。目前，已有许多参与调节黄花苜蓿抗逆性的基因被挖掘，且其调节机制亦被在一定程度上获得认知。有研究表明，参与耐寒性调控的有：延伸因子基因（Elongation factor-2，MfEF2）5、乙 烯 应 答 因 子 基 因（Ethylene responsive factor，MfERF1）6、S-腺 苷 甲 硫 氨 酸 合 成 酶 基 因（S-adenosylmethionine synthetase gene 1，MfSAMS1）7、肌醇转运类蛋白基因（Myoinositol transporter-like，MfINT-like）8、温 度 诱 导 的 脂 质 运 载 蛋 白 基 因（Temperature-induced lipocalins 1，MfTIL1）9、质膜内在蛋白基因（Plasma membrane intrinsic proteins，MfPIP2-7）10；参与耐盐调控的基因有：小GTP酶基因 MfARL111、盐超敏感基因（Salt overly sensitive，MfSOS1）12；既参与耐寒调控又参与抗旱调控的基因有：杂合富含脯氨酸蛋白基因（Hybrid proline-rich protein，MfHyPRP）13；同时参与耐寒、抗旱和耐盐调控的基因有：肌醇半乳糖苷合成酶基因（Galactinol synthase，MfGolS1）14、肌醇-磷酸合酶基因（Myo-inositol phosphate synthase，MfMIPS1）4和广谱胁迫蛋白基因（Universal stress proteins，MfUSP1）15。NAC 蛋 白 的 命 名 源 于 No Apical Meristem（NAM）和 Arabidopsis transcription activation factor（ATAF）以及 Cup-shaped cotyledon（CUC2）基因的首字母，是广泛存在于植物中的一类转录因子，在参与调节植物应答干旱、高盐和低温等非生物胁迫响应过程发挥重要作用1618。Miao等18研究发现，黄花苜蓿的 12、33、62个 MfNACs基因分别受寒冷、高盐、干旱胁迫上调表达。Qu等19研究发现，干旱、盐和低温均可诱导 MfNAC3 的表达，过表达 MfNAC3可增强蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的抗寒性。Duan 等20研究发现，在干旱胁迫时，MfNACsa 由质膜转移到核内来调节谷胱甘肽的浓度，进而提高植物的耐旱性。本课题组发现，盐和干旱胁迫可显著诱导黄花苜蓿 MfNAC34（GenBank 登录号为MH481768）的表达，低温胁迫对 MfNAC34表达的影响是先上调后抑制，ABA对MfNAC34表达的影响是先抑制后上调21。但是，关于 MfNAC34同源基因的功能及编码蛋白特性研究尚未见报道。本研究克隆获得MfNAC34的开放阅读框序列，分析其编码蛋白的理化性质以及亚细胞定位和转录激活特性，以期为进一步探究和解析 MfNAC34调节黄花苜蓿适应逆境胁迫的功能和分子机制提供理论依据。DOI：10.16742/j.zgcdxb.20230151收稿日期：2023-05-25；修回日期：2023-11-06基金项目：国家自然科学基金项目（31460628）；内蒙古自治区高等学校科学技术研究重点项目（NJZZ22331）；内蒙古自治区应用技术研究与开发项目（2021PT0001）资助作者简介：张立全（1978-），男，内蒙古太仆寺旗人，高级实验师，博士，主要从事植物分子生物学及基因工程研究，E-mail：.22张立全 常娜 赵志远等 黄花苜蓿 MfNAC34基因克隆及特性分析1材料与方法1.1植物材料野生黄花苜蓿种子采自内蒙古锡林郭勒草原毛登牧场，挑选种体饱满的种子进行后续试验。1.2试验方法1.2.1植物幼苗获得选取成熟饱满种子，春化 2周后打磨种皮，75%酒精表面消毒 8 min后，0.1%氯化汞消毒 5 min，灭菌水冲洗 3 次后浸泡 6 h。将黄花苜蓿种子播种于MS 培养基，在 16 h光照/8 h黑暗、251、光照强度为 40 mol/（m2s）培养箱中培养，培养 1 周时选长势相同的幼苗移栽至盛有 1/2 Hoagland营养液的培养盒中，于 16 h 光照/8 h 黑暗、251 温室培养4周获得幼苗。1.2.2提取总 RNA及合成 cDNA取上述幼苗叶片，利用 TRIzol试剂（CWBio）提取总 RNA。利用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）合 成 cDNA，20 冻 存备用。1.2.3MfNAC34基因克隆依据 MfNAC34开放阅读框序列信息，设计引物MfN34-F 和 MfN34-R（表 1）。以合成获得的 cDNA为模板进行 PCR 扩增，扩增程序为：95 预变性5 min；95 变 性 1 min，58 退 火 50 s，72 延 伸50 s，30个循环；72 10 min。PCR 产物经纯化后克隆至 pMD19-T 载体，热激法转化大肠杆菌并涂平板，次日获得单克隆菌体，摇菌后进行测序分析。1.2.4MfNAC34蛋白理化特性分析用 SMART（http：smart.emblheidelberg.de/）分析蛋白质保守结构域，利用 ExPASy compute pI/Mw tool（http：www.expasy.org/tools/protparam.html）分析蛋白质的理化性质，利用 MEGA 11 最大似 然 法（Maximum likelihood，参 数 设 置 为 1000 BootStrap）构建进化树，利用 DNAMAN 软件进行蛋白质同源性比对。1.2.5MfNAC34蛋白亚细胞定位分析利 用 在 线 软 件 PSORT（http：/psort.hgc.jp/form2.html）对克隆获得的基因编码蛋白的亚细胞定位进行预测，利用烟草表皮细胞瞬时表达进行验证。利用分别含有 Kpn和 Sal酶切位点的特异性引物pC-34-F 和 pC-34-R（表 1），PCR 扩增不含终止密码子的 MfNAC34 序列，以 pCAMBIA1300（35S-sGFP）为骨架构建瞬时表达载体pC（35S-MfNAC34-sGFP）后，热激法转化大肠杆菌后测序分析验证。提取质粒载体 pC（35S-MfNAC34-sGFP），用农杆菌介导法注射烟草叶片下表皮细胞。温室中光照培养 36 h后，取叶片制片，遮光条件下 DAPI染色后，用激光共聚焦显微镜（NIKON A1R）进行观察。试验以转化pCAMBIA1300（35S-sGFP）骨架载体为对照。1.2.6MfNAC34转录激活特性分析依 据 骨 架 载 体 pGBKT7 的 多 克 隆 位 点 和MfNAC34 序列酶切位点，设计分别含有 EcoR和Sal酶切位点的特异性引物 pG-34-F1 和 pG-34-R1（表 1），以及分别含有 Nde和 BamH酶切位点的特异性引物 pG-34-F2 和 pG-34-R2（表 1）。分别以上述 2对引物 PCR 扩增 MfNAC34开放阅读框序列以及 MfNAC34 编码蛋白 C 端的基因序列，构建载体 pG-MfN34 和 pG-MfN34c。热激法转化大肠杆菌，经测序分析验证后，分别提取质粒载体 pG-MfN34和 pG-MfN34c。培 养 酵 母 AH109 菌 体，采 用 PEG/LiAc 法（Yeastmaker Yeast Transformation System 2，Clontech）分别转化载体 pG-MfN34和 pG-MfN34c。转表 1引物序列Table 1The sequence of primers引物名称Primer nameMfN34-FMfN34-RpC-34-FpC-34-RpG-34-F1pG-34-R1pG-34-F2pG-34-R2引物序列Primer sequence（53）A T G G G A G A T A T T G T C A A G CC T A C T G A G G C A T G G T TC C T G G T A C C A T G G G A G A T A T T G T C A AT T G T C G A C C T G A G G C A T G G T T A T T CT A G A A T T C A T G G G A G A T A T T G T C A A G CT A G T C G A C C T A C T G A G G C A T G G T TC T C A T A T G T G C T C C T C T G G A T T T GA A G G A T C C C T A C T G A G G C A T G G限制性内切酶Restriction enzymeKpnSalEcoRSalNdeBamH注：方框表示限制性酶切位点。Note：The boxes stand for restriction enzyme cutting site.23中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期化后各取菌液 100 L，均匀涂布在 SD/-Trp固体培养基上，30 培养 48 h，挑取单菌落摇菌后进行 PCR 鉴定。挑取PCR鉴定为阳性的菌体，于SD/-Trp液体培养基振荡培养至 OD600=0.5，将菌体稀释 1/10 倍，分别取 20 L 滴加在 SD/-Trp-His-Ade 和 SD/-Trp-His-Ade/X-Gal（20 mg/mL）固体培养基表面，30 恒温培养 3 d，观测菌体生长和显色情况。以转化 pGBKT7-53+pGADT7-T为阳性对照，以转化 pGBKT7-Lam+pGADT7-T以及pGBKT7为阴性对照。2结果与分析2.1MfNAC34基因克隆及分析PCR 扩增后经电泳分析显示获得预期的特异性条带（图 1），克隆至 T 载体后测序分析，其长度为621 bp，与 GenBank（登录号 MH481768）中的开放阅读框序列完全一致，即该基因开放阅读框全长为621 bp，其编码含有 206 个氨基酸的蛋白质，蛋白质结构域分析发现其含有公认的 NAM 结构域（位于氨基酸序列 9142位），说明该基因属于 NAC 转录因子家族。构建系统进化树发现，该基因编码蛋白与蒺藜苜蓿 NAC 家族成员 MtNAC34 亲缘关系最近（图 2），因此命名为 MfNAC34。2.2MfNAC34蛋白理化特性分析MfNAC34蛋白分子量（Mw）为 23.52 kD，理论等 电 点（pI）为 4.09，GRAVY（Grand average of M：DL2000 DNA Marker；1：PCR产物。M：DL2000 DNA Marker；1：PCR production.图 1PCR产物电泳Fig.1Electrophoresis of PCR producttionMtNACs：蒺藜苜蓿 NAC家族成员；方框标识为 MfNAC34。MtNACs：the NAC proteins of Medicago truncatula；MfNAC34 was showed by box.图 2MfNAC34系统进化分析Fig.2Phylogenetic analysis of MfNAC3424张立全 常娜 赵志远等 黄花苜蓿 MfNAC34基因克隆及特性分析hydropathicity）数值为0.417，为亲水性蛋白。利用 Swiss-model Workplace 在 线 软 件 对 MfNAC34三 级 结 构 进 行 预 测，显 示 以 胁 迫 诱 导 转 录 因 子NAC1（Stress-induced transcription factor NAC1）3ulx.A 为模板时，其 3161 位氨基酸序列的晶体结构如图 3 所示，与 NAC1 的同源性为 34.42%，QMEAN 值为5.17，暗示 MfNAC34 属于胁迫诱导相关 NAC 转录因子。同时，分析 MfNAC34与拟南 芥（Arabidopsis thaliana）ANAC019、ANAC055和 ANAC072蛋白的同源性，结果表明在 MfNAC34亚结构域 D中含有核定位信号（图 4）。2.3MfNAC34亚细胞定位分析PSORT 预测 MfNAC34定位在细胞核内，为进一步验证 MfNAC34 蛋白的亚细胞定位，构建了 pC（35S-MfNAC34-sGFP）融合表达载体，在烟草下表皮细胞进行验证，结果进一步确定 MfNAC34 定位在细胞核内（图 5）。2.4MfNAC34转录激活特性分析为验证 MfNAC34 的转录激活特性，分别构建含有 MfNAC34 开放阅读框序列以及 MfNAC34 编码蛋白 C 端的基因序列的酵母表达载体，并在酵母菌株 AH109 中通过显色反应检测-半乳糖苷酶的活性，分析报告基因的活性。结果显示（图 6），含有全开放阅读框序列和编码蛋白 C端序列的酵母菌体在 SD/-Trp-His-Ade/X-Gal培养基上均有显色反图 3MfNAC34三级结构模型Fig.3The tertiary structure of MfNAC34横线标注 AE亚结构域，双箭头标注核定位信号。The A-E subdomains are indicated by lines.The nuclear localization signal is shown by a double-headed arrow.图 4MfNAC34亚结构域及核定位信号分析Fig.4Analysis of subdomains and nuclear localization signal in MfNAC34图 5MfNAC34亚细胞定位分析Fig.5Subcellular localization of MfNAC3425中国草地学报 2024 年 第 46 卷 第 3 期应，表明二者均可激活报告基因的表达，MfNAC34为转录激活因子且转录激活域位于蛋白的 C端。3讨论NAC转录因子具有调节植物生长、发育以及适应逆境胁迫的功能1617，19，21，但目前黄花苜蓿 NAC家族蛋白基因的挖掘和认知有限。本课题组以锡林郭勒草原野生黄花苜蓿为材料，通过转录组测序分析发现野生黄花苜蓿有 146 个 MfNACs 基因，并成功克隆了 MfNAC37 和 MfNAC95 基因2123。本研究成功克隆获得另一个具有完整开放阅读框的基因 MfNAC34，其编码蛋白 N 端含有公认的 NAM结构域，且编码蛋白与 MtNAC34的进化关系最近。已有的研究报道 MfNAC3 是定位在细胞核内的转录因子19，MfNACsa 是定位在质膜上的转录因子，干旱胁迫促使其转运至细胞核中发挥转录因子的功能20，但 MfNAC34 同源蛋白的分子特性及生物学功能研究均未见报道。本研究通过生物信息学预测 MfNAC34 定位在细胞核内，且蛋白质同源性分析发现其含有核定位信号，进一步利用烟草下表皮细胞瞬时表达系统验证发现 MfNAC34亚细胞定位在细胞核内。NACs 家族蛋白的 N 端是高度保守的 NAM/NAC 结构域，而端为转录激活域1617。本研究利用酵母表达系统验证表明 MfNAC34 具有转录激活特性，且转录激活域位于蛋白的C端。课题组前期研究发现MfNAC34表达受低温、盐和干旱胁迫调节21，本研究中蛋白三级结构建模分析发现 MfNAC34与胁迫诱导转录因子 NAC1 的同源性较高，说明MfNAC34 属于胁迫诱导相关 NAC 转录因子，为后续深入探究MfNAC34的生物学功能奠定了基础。4结论本研究克隆获得了黄花苜蓿 MfNAC34基因，其开放阅读框全长为 621 bp，编码 206个氨基酸的蛋白质，分子量 23.52 kD，理论等电点 4.09。MfNAC34是定位在细胞核内的亲水性蛋白，其转录激活域位于蛋白的 C端。参考文献（References）：1 Riday H，Brummer E C.Forage yield heterosis in alfalfa J.Crop Science，2002，42（3）：716-723.2 Pennycooke J C，Cheng H M，Stockinger E J.Comparative genomic sequence and expression analyses of Medicago truncatula and alfalfa subspecies falcata cold-acclimation-specific genes J.Plant Physiology，2008，146（3）：1242-1254.3 李贺洋，黄悠，陈超超，等.黄花苜蓿种质资源苗期抗旱性鉴定评价 J.中国草地学报，2023，45（10）：34-45.LI Heyang，HUANG You，CHEN Chaochao，et al.Evaluation of drought resistance in seedling stage germplasm resources of Medicago falcata J.Chinese Journal of Grassland，2023，45（10）：34-45.4 Tan J L，Wang C Y，Xiang B，et al.Hydrogen peroxide and nitric oxide mediated cold-and dehydration-induced myo-inositol phosphate synthase that confers multiple resistances to abiotic stresses J.Plant Cell&Environment，2013，36（2）：288-299.5 Shi H F，He S J，He X Y，et al.An eukaryotic elongation factor 2 from Medicago falcata（MfEF2）confers cold tolerance J.BMC Plant Biology，2019，19（1）：218-231.6 Zhuo C L，Lu L，Zhao Y Q，et al.A cold responsive ethylene responsive factor from Medicago falcata confers cold tolerance by up-regulation of polyamine turnover，antioxidant protection，and proline accumulation J.Plant Cell&Environment，2018，41（9）：2021-2032.7 Guo Z F，Tan J L，Zhuo C L，et al.Abscisic acid，H2O2 and nitric oxide interactions mediated cold-induced S-adenosylmethionine synthetase in Medicago sativa subsp.falcata that confers cold tolerance through up-regulating polyamine oxidationJ.Plant Biotechnology Journal，2014，12（5）：601-612.8 Mame A N S，He X Y，Tu Q H，et al.A cold-induced myo-inositol transporter-like gene confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco plants J.Physiologia Plantarum，2015，153（3）：355-364.9 He X Y，Sambe M A N，Zhuo C L，et al.A temperature induced lipocalin gene from Medicago falcata（MfTIL1）confers tolerance to cold and oxidative stress J.Plant Molecular Biology，2015，87（6）：645-654.10 Zhuo C L，Wang T，Guo Z F，et al.Overexpression of MfPIP2-7 from Medicago falcata promotes cold tolerance and growth under NO3 deficiency in transgenic tobacco plants J.T/H/A为SD/-Trp-His-Ade培养基，T/H/A/X为SD/-Trp-His-Ade/X-Gal培养基。T/H/A is SD/-Trp-His-Ade media，T/H/A/X is SD/-Trp-His-Ade/X-Gal media.图 6MfNAC34转录激活分析Fig.6Transactivation assay of MfNAC3426张立全 常娜 赵志远等 黄花苜蓿 MfNAC34基因克隆及特性分析BMC Plant Biology，2016，16：138-148.11 Wang T Z，Xia X Z，Zhao M G，et al.Expression of a Medicago falcata small GTPase gene，MfARL1 enhanced tolerance to salt stress in Arabidopsis thaliana J.Plant Physiology and Biochemistry，2013，63：227-235.12 Liu M，Wang T Z，Zhang W H.Sodium extrusion associated with enhanced expression of SOS1 underlies different salt tolerance between Medicago falcata and Medicago truncatula seedlings J.Environmental and Experimental Botany，2015，110：46-55.13 Tan J L，Zhuo C L，Guo Z F.Nitric oxide mediates cold-and dehydration-induced expression of a novel MfHyPRP that confers tolerance to abiotic stress J.Physiologia Plantarum，2013，149（3）：310-320.14 Zhuo C L，Wang T，Lu S Y，et al.A cold responsive galactinol synthase gene from Medicago falcata（MfGolS1）is induced by myo-inositol and confers multiple tolerances to abiotic stressesJ.Physiologia Plantarum，2013，149（1）：67-78.15 Gou L M，Zhuo C L，Lu S Y，et al.A universal stress protein from Medicago falcata（MfUSP1）confers multiple stress tolerance by regulating antioxidant defense and proline accumulationJ.Environmental and Experimental Botany，2020，178：104168-104179.16 Olsen A N，Ernst H，Leggio L L，et al.NAC transcription factors：structurally distinct，functionally diverseJ.Trends Plant Science，2005，10（2）：79-87.17 张立全，李慧，张凤英，等.苜蓿属植物转录因子研究进展 J.中国草地学报，2014，36（2）：108-116.ZHANG Liquan，LI Hui，ZHANG Fengying，et al.Research progress in Medicago transcription factors J.Chinese Journal of Grassland，2014，36（2）：108-116.18 Miao Z Y，Xu W，Li D F，et al.De novo transcriptome analysis of Medicago falcata reveals novel insights about the mechanisms underlying abiotic stress-responsive pathway J.BMC Genomics，2015，16（1）：818-835.19 Qu Y T，Duan M，Zhang Z Q，et al.Overexpression of the Medicago falcata NAC transcription factor MfNAC3 enhances cold tolerance in Medicago truncatula J.Environmental and Experimental Botany，2016，129（5）：67-76.20 Duan M，Zhang R X，Zhu F G，et al.A lipid-anchored NAC transcription factor is translocated into the nucleus and activates glyoxalase I expression during drought stress J.Plant Cell，2017，29（7）：1748-1772.21 Zhang L Q，Jia X H，Zhao J W，et al.Molecular characterization and expression analysis of NAC transcription factor genes in wild Medicago falcata under abiotic stressesJ.Functional Plant Biology，2020，47（4）：327-341.22 张立全，贾旭慧，赵静玮，等.黄花苜蓿 MfNAC37基因的克隆及盐胁迫下的表达分析 J.中国草地学报，2019，41（3）：10-14，166.ZHANG Liquan，JIA Xuhui，ZHAO Jingwei，et al.Cloning and expression analysis of MfNAC37 from Medicago falcata under salt stressJ.Chinese Journal of Grassland，2019，41（3）：10-14，166.23 张立全，贾旭慧，赵静玮，等.黄花苜蓿 MfNAC95 基因鉴定及其应答盐胁迫的表达分析 J.中国草地学报，2020，42（1）：1-6.ZHANG Liquan，JIA Xuhui，ZHAO Jingwei，et al.Identification of Medicago falcata MfNAC95 and expression analysis under salt stress J.Chinese Journal of Grassland，2020，42（1）：1-6.Cloning and Characteristic Analysis of MfNAC34 in Medicago falcataZHANG Liquan1，CHANG Na1，2，ZHAO Zhiyuan1，ZHAO Yongxiu1（1.School of Life Sciences of Inner Mongolia University/Key Laboratory of Forage and Endemic Crop Biology，Ministry of Education，Hohhot 010070，China；2.Hohhot No.35 Middle School，Hohhot 010021，China）Abstract：NAC transcription factor can regulate plant growth and development and respond to abiotic stress.In this study，a NAC family protein gene MfNAC34（GenBank accession number：MH481768）was cloned from Medicago falcata in Xilinguole League steppe of Inner Mongolia，the physicochemical properties，subcellular localization and transcriptional activation activity of MfNAC34 protein were identified.The results showed that the open reding frame sequence of MfNAC34 gene was 621 bp，encoding a hydrophilic protein with a molecular weight of 23.52 kD and a theoretical isoelectric point of 4.09.MfNAC34 was a stress-induced transcription factor localized in the nucleus，and the transcription activation domain was located at its C-terminal.Key words：Medicago falcata；MfNAC34；Characteristic analysis【责任编辑 胡卉芳】27