第十三章遗传毒理学试验策略和资料的评价.doc

P439 第十三章遗传毒理学试验策略和资料的评价 第一节遗传毒性或诱变性与致癌性 遗传毒性或诱变性(mutagenecity)是指引起遗传物质DNA损伤的潜在性能，包括引起在核苷酸分子水平上的变化和DNA载体染色体发生畸变的特性。目前已知生物体的结构和功能均受遗传物质的严格控制。因此遗传物质的损伤得不到完全修复，就可导致生物体结构和功能的改变。在第十一章遗传毒性与疾病中已详细介绍了遗传毒性效应与多种非遗传疾病的关系.随着科学的发展，这类疾病的名单还会不断扩大，事实上,问题的实质只是在某种特定的疾病中，遗传因素与环境因素所起作用的比例大小而已. 肿瘤是人类的常见病和多发病，在多数国家占死因的第二位.有关资料表明，90以上的肿瘤由环境因子所引起。为了预防肿瘤就要对环境因子，其中主要是化学物的致癌性进行检测.在致癌机制方面，体细胞突变学说有一定的实验依据，所以较为流行。在20世纪70年代后期，有人提出化学物的诱变性与对哺乳动物致癌性之间相互关联的问题。早期的研究未发现化学物的诱变性与致癌性有密切的相关，仅发现少数化学诱变剂同时也是哺乳动物的致癌剂。后来的研究发现,大多数诱变剂和致癌剂都需经代谢后才有活性。当体外诱变试验系统中加入了代谢活化系统，不少原来出现阴性结果的受试物获得了阳性结果,也即许多动物致癌剂在体外诱变试验中无外源性代谢活化系统获得阴性结果，加了代谢活化系统试验结果转为阳性.这样，化学物的诱变性与致癌性的相关性明显提高.Mtlller等发现强诱变剂常为强致癌剂。l975年McCann报道了300种化学物Ames试验结果，发现其中的175种哺乳动物致癌剂中，157种Ames试验阳性，即90%具有诱发细菌诱变的能力。Sobel和Vogel l976年分析果蝇诱变试验的结果，也发现致癌剂多数具有诱变性.1979年Matsuoka根据体外染色体畸变分析的结果，也得出了与上述相同的结论.后来的研究表明,化学物的诱变性与致癌性符合率与受检化学物类别、一批受检化学物中已知致癌剂和已知非致癌剂的比例及诱变性的检测系统有关。例如Ames试验Ames test）对金属、氯化烃类化合物的诱变性不敏感,所以这些化学物的诱变性与致癌性的符合率较低。 根据化学物的诱变性与动物致癌性之间存在密切相关,近30年来遗传毒理学研究致力于用诱变试验筛检致癌剂.考虑到大多数诱变试验是简便快速的,花钱较少；而动物致癌试验所需时间至少23年，花费又大。采用不同的生物体和遗传终点的百余种诱变试验,就是在这个背景下发展起来的。遗传毒理学试验策略实际上开始就是围绕着如何利用诱变试验系统准确地筛检出动物致癌剂而制定的。目前已清楚，化学物对人的诱变性或遗传毒性的确定是至关重要的，因此检测环境化学物和其他环境因素对人群的遗传毒理学效应受到关注.从众多的环境化学物中选择哪些优先进行研究，对哪些人群，对哪些遗传终点进行观察等，也需要有合适的策略，才能用有限的人力物力资源,事半功倍地解P440决遗传毒理学面临的问题。 第二节 实验结果外推的可能性和局限性 遗传物质决定着生命现象的基本属性。除某些病毒它是由核糖核酸（RNA)组成外,其他生物的遗传物质都是由DNA组成的,且基本结构相同。从细菌到人类，所有生物体的DNA都有共同的特性,而且维持细胞正常功能的DNA合成、复制、修复等细胞基本活动过程是较为稳定的。甚至所有生物的基因内密码的信息、信息储存和基因表达机制基本上是相同的。因此能引起低等生物体DNA损伤的因素,预计也可引起高等生物体DNA的损伤。基于这样的假说，细菌、噬菌体广泛用于诱变性的检测，而且最早对基因的结构和功能的认识主要来自细菌和噬菌体的研究，所以利用细菌和噬菌体作诱变试验也是很自然的。目前,从大量Ames试验的结果分析，上述假说基本上是成立的，即从细菌的诱变性试验结果外推至对高等生物体的诱变性符合率较高。这说明遗传毒理学试验结果外推的可能性。 由于大多数诱变剂和致癌剂都要在体内经生物转化，形成活性代谢物才能发挥它们的作用,而由细菌、噬菌体到人类，机体对外源性化学物生物转化的能力，从质和量方面都有明显差别,即使是同种物种，不同品系之间它们的生物转化能力也不尽相同。物种间生物转化能力的差异，往往是导致诱变试验和致癌试验结果在各物种间差异的主要原因。由此可知，对于直接作用的诱变剂,诱变试验结果从低等生物试验外推至高等生物，其可靠性大一些,而对于需经代谢活化后发挥作用的诱变剂，即间接诱变剂，在外推时要特别谨慎.此外，体内与体外诱变试验系统还存在其他重要差别。诱变剂在体内试验有吸收、分布和排泄的过程，而在体外试验则无上述过程。DNA损伤的修复能力与生物进化过程有关,愈高等的生物，其修复能力愈强。这提示某诱变剂在低等生物体可诱发突变,而在较高等的生物体不一定也能诱发突变的.在应用人类细胞评价遗传毒物接触程度和对健康危害时，目前还普遍应用人类血细胞，如外周血淋巴细胞作为“岗哨细胞，但它们不能提供充分可信的资料，反映有关疾病靶细胞的状态.因此，须应用其他易于获得又更能代表疾病靶细胞的人类细胞如口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液中的细胞、结肠和尿道上皮脱落细胞、宫颈上皮细胞和精液中的生殖细胞等代替血细胞.这也为了克服从血细胞外推到其他类型细胞存在的严重缺陷。以往曾企图用体细胞的实验结果外推到生殖细胞，而实验结果表明,这类外推的误差太大，所以现在提倡直接对生殖细胞的观察以提示受试物对生殖细胞的遗传毒性。 第三节实验结果的判断 实验结果的判断对任何学科的实验来说都是至关重要的,而对于生命科学实验，包括毒理学和遗传毒理学则更为重要，因为受试生物体的变异性大，且有关因素不易控制，所以同一观察终点在不同实验室，或在同一实验室的不同时间所获实验结果可能有差异。众所周知，所有的测量都存在变异,其变异主要来自两个方面:其一,测量操作误差，其二，受试系统中生物体的个体差异和同一个体不同时间的生物学变化。这类问题是任何实验P441中都可存在的，本节不作详细讨论，而重点讨论对遗传毒理学实验结果判断的有关问题1。 一、初 评 主要对单个实验的设计、操作、观察过程、实验结果统计分析、引出的结论等进行检查和判断它们的合理性，可靠性和可信性.有一些实验国内或国际上已制订实验规范的,只要按规范逐项进行检查和评价即可，但不少实验尚无统一的规范，则须用实验通用规则或标准进行评价。1实验检查 遗传毒理实验一般须设阳性对照和阴性对照,后者包括空白对照和溶剂对照。对实验结果波动较大的实验系统，判断实验结果是否阳性时还需参照实验室积累的阴性对照结果,称为历史性阴性对照。受试物测试获阴性结果，如无阳性对照则很难下结论,因为有可能试验系统存在缺陷. 受试化学物的上限浓度一般应达到一定的毒性浓度或（和）饱和浓度，否则阴性结果不予认可，因为在增高受试浓度后很可能获得阳性结果。 观察的样本数受试验而异，例如SCE体外试验(SCE test in vitro)每档浓度观察30个分化染色合适的，染色体展开良好的细胞即可，而染色体畸变分析每档浓度至少观察100个细胞的核型,微核试验则要观察统计2000-3000个细胞。操作过程采用单盲法或双盲法，同一个操作或结果经过第二人复核过的，一般说来，观察误差会少些，结果的可靠性较高。实验结果在同一实验室和不同实验室获得重现，则实验结果的偶然性减少，可靠性提高，故如Ames试验要求至少重复一次。 已知大多数诱变剂和致癌物需经代谢活化后表现出遗传毒性.所以应注意测试系统是否具有代谢活化系统。在缺乏代谢活化系统下获得阴性效应,则还需要在加了活化代谢系统后再次测试其遗传毒性。2实验结果判断标准1-2 在判断实验结果为阴性效应或阳性效应时也尚会出现分歧，问题主要在于所采用的评价标准的不同。有人根据实验组与对照组比较,只要统计学差别有显著意义，就认为阳性结果。有人认为除此之外，还必须有剂量一反应或剂量一效应关系，缺一不可。此外,还必须参考历史性阴性对照，即小样本阴性对照值的波动范围，才能对实验结果作出正确的评价。文献中有果蝇隐性性连锁致死试验（sexlinked recessive lethal test in Drosophila，SLRL)的例子。在某实验室中，根据50000只果蝇积累的阴性对照资料,其SLRL频率为020。单个实验用1000只果蝇作实验,并列的阴性对照组SLRL为012，最高浓度组SLRL为030。此频率为并列对照的25倍,可认为是阳性反应结果，而与历史对照频率相比,仅为l5倍,则可认为实验组030不是阳性效应。再根据未见剂量反应关系,正确的判断是阴性效应。 SCE计数与染色体畸变分析相比，重复性好，没有主观性,但由于SCE的毒理学意义P442尚不清楚,所以SCE试验(SCE test）常被归为DNA初级损伤的一般终点。由于SCE方法简便，国内外广泛用它鉴定化学物的诱变作用。有不少研究者只根据实验组与阴性对照组具有统计学上显著差异，即判断为阳性效应，认为这种差别具有生物学意义.因此SCE试验较其他细胞遗传学试验，甚至其他诱变试验都敏感,即别的试验为阴性效应,SCE试验可显示阳性效应，或SCE试验在较低受试剂量下即获得阳性效应。总结分析国内外现有SCE的资料，可以看出这样往往会过高估计受试物的遗传毒性作用。据我们的经验，在人群的监测中SCE频率除统计学上有差别外，观察组至少应是对照组的15倍（在体外试验中应提高到2倍)差别才有意义，如再能确定剂量效应关系,则判断为阳性效应的结论更为可靠。这个评判标准，是根据SCE历史性阴性对照的波动范围，和阳性对照组SCE频率增高可以达到的最低水平而提出的。 在对职业人群检查时，选择每组人数在10-15人已足够，每个受检对象分析30个细胞，记录每个细胞的SCE数，最后以每个细胞的SCE数的均值表示各受检者的SCE频率。在计算观察组和对照组SCE频率时以各个体的SCE频率为单位，再求组的均值。统计处理时以受检人数为样本数.有许多生活因素也可引起SCE增高，所以在研究职业有害因素时,必须防止干扰因素的作用，对照组人选，除研究因素外，最好与观察组人选尽量配对选择。 在判断实验结果是否为阳性效应时，有些测试系统存在按经验法则提出的结果判断标准，即确定一个水平，低于这个水平的判为阴性,高于这个水平的判为阳性。例如，平板掺入法Ames试验判断阳性效应的准则之一是：平均每皿回变菌落数为溶剂对照的2倍，即超过1倍。为非程序DNA合成试验（unscheduled DNA synthesis test)我们也曾提出参照Ames试验的上述准则。血清癌基因蛋白P21用作接触致癌物的职业人群生物监测标志物,有人提出受检者的P21蛋白量为对照组的5倍，即超过4倍时-It0断为阳性效应，才表示受检者P21癌基因有过度表达。3假象的识别与排除 这类问题在体外测试中较多见，体内动物试验中较少见，但也存在。我们曾发现在测试一种农药的诱变性时,当受试物溶于植物油中获阴性结果，在配制成混悬液时获阳性结果.分析原因,发现配制成油剂的农药，大部分随粪便排出，吸收很少。在另一个动物实验中，受试物掺入饲料中喂饲大鼠,因饲料带有异味造成大鼠拒食，因此无法达到实验设计剂量。如果不仔细观察大鼠进食量，则就会造成将受试物判断为无效应的错误. 体外试验在遗传毒理学研究中已成功地广泛应用，但所选用浓度不当常是遗传毒性测试中最严重的缺陷。例如在细胞遗传-gNi,试ee，由于受试浓度过高引起培养液渗透压或pH的改变，致使细胞染色体断裂数增多。在不影响渗透压的浓度下或培养液pH校正在70左右时，染色体断裂数趋向于正常。在浓度选择时,受试物对靶细胞的毒性测试预备试验是必须做的。测试浓度一般可在细胞的存活率30%l00之间选择。 对实验基本原理缺乏认识，常会被实验假象所迷惑。例如用Ames试验测试中草药提取液或尿液中代谢产物的诱变性时,由于受试样品中含有一定量的组氨酸而导致回变菌落数明显增多,显示Ames试验阳性效应，而当其中残留的组氨酸去除后，则回变菌落数不再增多.相反的结果有时也会发生。例如用Ames试验筛选抗突变的物质,由于受P443试物对鼠伤寒沙门氏菌的毒性或抑菌和杀菌作用,在阳性诱变剂加受试物后回变菌落数明显降低，甚至低于对照组。上述两种假象，对熟知Ames试验原理的实验者并不难识别和排除。因为回变菌落数取决于平板上营养缺陷型细菌的最终数目，即它们的背景生长状况,而平板上最终细菌生长数决定于组氨酸浓度。因为受试样品中含有组氨酸，细菌背景生长过盛,回变菌落数也随之而增高.在第二种情况下，受试物有抑菌或杀菌作用，使背景生长不良，回变菌落数因此而减少，造成有抗突变作用的假象。这些情况表明，正式实验前要对受试物作毒性试验，在回变菌落数计数时必须观察一下平板上细菌的背景生长，只有背景生长的正常平板，其读数才有意义。 二、综合评价 在上述对每个遗传毒理学实验结果初评的基础上，确定了某受试物具有阳性效应或阴性效应后，就可以进一步评价该测试结果在确定受试物致癌性或对人是否具有诱变性中的意义，并还可评价该测试系统在鉴定致癌剂中的作用。由于已知的人类致癌剂只有近40种，所以评价遗传毒理学短期测试系统在鉴定化学物致癌性时常用啮齿类动物(主要是小鼠和大鼠）致癌资料,进行相关分析。即对啮齿类动物具有致癌性的化学物，若在某短期测试系统中获阳性效应，表示该测试系统在预测化学物致癌性中的作用大；同样理由，对于不具有致癌性的化学物，理想的短期测试结果应是阴性效应。但事实上，在分析比较较多化学物的实验结果时,无论是对致癌剂或非致癌剂,都不会有百分之百的符合，因此需要作综合评价,进行统计分析处理。详细讨论见本章第四和第五节。 使用遗传毒理学短期测试，预测受试因素对人的诱变性有较大困难,因为人类诱变剂名单尚未确定,目前只能估计人类已知致癌剂，也可能是人类的诱变剂。短期测试结果可提供优先对人群进行观察诱变作用的环境因素。职业人群遗传毒理学效应的流行病学调查，对确定人类诱变剂可能有重要意义，将在本章第七节作进一步讨论。 第四节单个测试系统结果的评价 上一节中我们讨论了对一次实验结果可靠性的判断，当对该实验结果认可后，无论是阳性效应或阴性效应，它在预测受试物致癌性中的作用将在本节中进行讨论。 一、真阳性与假阳性 一种已知啮齿类致癌剂在某项遗传毒理学短期筛检试验中获得阳性效应，则这个测试结果判为真阳性。而如果一个已知啮齿类的非致癌剂，在该项短期筛检试验中也获得了阳性效应,这个测试结果判为假阳性。理想的筛检试验应该是只产生真阳性结果，而无假阳性结果。但事实上，随测试的化学物数量加大，真阳性（real positive）和假阳性(falsepositive)结果都会出现一定的比例。它们可用相对数真阳性率(real positive rate）和假阳性率（false positive rate）表示。 真阳性和假阳性指标有时也用于两种测试方法的比较.以一种方法为标准方法，另P444一种待评估的方法所获结果与标准方法相比，与标准方法一样获得阳性效应的判为真阳性，而标准方法为阴性效应，待评估的方法获得阳性效应，则此效应判为假阳性。在遗传毒理学筛检试验中常以Ames试验为标准方法，检验其他筛检方法的真阳性率和假阳性率。因为至今Ames试验在致癌剂筛检中的重要性已被公认，且在世界各国应用广泛，积累的资料和经验比任何筛检试验都丰富。 二、真阴性与假阴性 一种已知啮齿类非致癌剂，在某项遗传毒理学短期筛检试验中获得阴性效应,则这个测试结果判为真阴性(real negatir)，而致癌剂测得阴性效应则判为假阴性(false negative）。与真阳性和假阳性概念一样，在测试一定数量的化学物后，可获得真阴性率（real negatirrate)和假阴性率(false negative rate). 在讨论真阳性、假阳性、真阴性和假阴性时必须注意,这种判别是依据受试物对啮齿类动物的致癌性为依据的。要知道就以小鼠和大鼠的致癌实验结果为依据，有时也有一定难度。小鼠和大鼠各分雌雄两性共可分4组，若致癌试验结果4组都获得一致结果，判断受试物为致癌剂或非致癌剂比较容易，但如果仅小鼠或大鼠有致癌效应，甚至其中只有一组显示致癌作用，判断就会有困难.更复杂的情况是在不同的实验室获得了不一致的实验结果，判断就会出现分歧。例如同样是小鼠，但实验所用小鼠品系不同，常会表现出致癌效应的差异.有些化学物对啮齿动物致癌性的分类也可能会发生变动，当先前被定为非致癌的物质,现在改定为致癌物质，则先前判为假阳性的筛检试验结果，也就应改判为真阳性，真阴性应改判为假阴性。 致癌剂按作用机制可分为遗传毒性致癌剂（genotoxic carcinogen）或诱变性致癌剂(mutagenic carcinogen）和非遗传毒性或非诱变性致癌剂。所以出现假阴性结果的受检物中可能包括部分非遗传毒性致癌剂。有资料表明，83遗传毒性致癌剂可在多种动物诱发多种器官肿瘤，非遗传毒性致癌剂一般仅引起个别种属肿瘤高发，且具有器官特异性。Ames试验在筛检仅诱发单一种属单一器官肿瘤的致癌剂时，假阴性率特别高。 三、灵敏度与特异度 灵敏度(或敏感性)与特异度（或特异性)这里指的是遗传毒理学短期筛检试测结果与实际情况（致癌剂和非致癌剂)接近程度的真实性评价的主要指标。灵敏度是一批已知致癌剂在用某种短期筛检测试系统测试时获得阳性效应的百分率，表示某筛检测试系统检出致癌剂的能力，其灵敏度愈大，则表示假阴性率愈低。特异度是一批已知非致癌剂在用某种短期筛检测试系统测试时获得阴性效应的百分率，表示某筛检测试系统检出非致癌剂的能力，其特异度愈大，则表示假阳性率愈低。 这里需要说明，化学和免疫学等实验中使用的灵敏度与筛检试验中用的灵敏度，概念是不同的.前者的定义为能检出的水平愈低,方法灵敏度愈高，这种情况下常用最低检出限表示，而在筛检试验中则用阳性检出率表示。上述各指标可按四格表列式计算,见表131。P445表13 -1评定筛检试验鉴定致癌剂和非致癌剂真实性的模式表 筛检试验结果 致癌剂 非致癌剂 合计 阳性效应 真阳性（a） 假阳性（b) a+b 阴性效应 假阴性（c） 真阴性（d） c+d 合计 a+c b+d a+b+c+d 从计算式可知，灵敏度即真阳性率，仅与致癌剂有关，特异度即真阴性率，仅与非致癌剂有关。而且灵敏度与假阴性率，特异度与假阳性率是互补的，即1灵敏度为假阴性率，1-特异度为假阳性率. 请注意，某筛检测试系统的灵敏度的含义是：任一致癌剂在用该测试系统筛检时出现阳性效应的概率，但并不表示任一受检物获阳性效应时为致癌剂的概率。对特异度的认识也是这样。 四、符合率与预测价值 符合率（ concordance）是评定筛检试验结果，包括阳性效应和阴性效应与检出相应致癌剂和非致癌剂的准确性的指标。按表13 -1的计算公式如下: 预测价值( predictive value）指筛检测试阳性和阴性效应正确预示致癌剂或非致癌剂的百分比,计算公式如下： 阳性效应和阴性效应的预测价值与筛检化学物中致癌剂和非致癌剂的比例有关.若按McCann报道的Ames试验的灵敏度为0。897，特异度为0。872,并假设受检物中致癌剂为200种，而非致癌剂分别为20和200种，则两组测试的致癌剂比例分别为200：220和200:400，则阳性效应的预测价值分别为98.6和87。5，若致癌剂比例降至200：2200,则预测价值会剧降至41.2%，阴性效应的预测价值将随筛检化学物中致癌剂的比例上升P446而下降。这点在比较不同筛检测试系统的预测价值时必须加以注意的。 第五节组合试验的选择及其结果的评价 一、组合试验的选择 任何一种遗传毒理学筛检测试系统都有一定的假阴性率和假阳性率,不能准确地鉴别出遗传毒物和非遗传毒物.这可能与筛检测试系统的观察终点有关。因为一种诱变试验只能反映1至2种遗传毒性作用终点.此外，要用筛检测试系统测试结果，预示受检物对人的诱变性,也需要观察多种遗传毒性作用终点，例如文献资料表明，Ames试验对重金属和卤代烃类诱变剂不敏感，常出现漏检，而使用大肠杆菌营养缺陷型回复突变试验或枯草杆菌重组缺陷型重组试验则可能弥补Ames试验的不足，检出Ames试验漏检的遗传毒性化学物。 国际环境诱变剂和致癌剂防护委员会(ICPEMC）1983年提出5类遗传毒作用终点，即DNA损伤与修复;DNA断裂；基因突变；DNA重组和染色体结构异常；非整倍体和多倍体.按该委员会意见，非遗传毒物的实用性定义为:在检出5类遗传毒作用终点的一系列测试中均为阴性效应。而遗传毒物的实用性定义为:在能检出任何一种遗传毒物作用终点的任何一个筛检测试系统中获得阳性效应。这样，在筛检化学物的诱变性时，应当进行一系列的试验，即至少选择分别能检出上述5类遗传毒作用终点的一组试验，即采用组合试验（或成套试验）的方法，而不是仅仅用单个试验。我国目前颁布的农药、药品、食品、化妆品等安全性毒理学评价程序中对诱变性试验都规定了组合试验,但其规定是否都很合理有待实践经验加以评论，其中有些规定肯定要改进。 根据数学计算,如果由lo种试验方法任意组合，则可以获得1023种组合,所以选择合适的试验组合是至关重要的。选择的原则主要有:受试系统(原核细胞、真核细胞、哺乳类动物)和观察终点(DNA损伤、突变、染色体畸变和细胞转化)的多样性；体内和体外试验的兼顾;各试验方法检出致癌剂和非致癌剂的能力应有所差别，以起到彼此互补的作用；符合鉴定化学物要求（以减少假阳性或假阴性结果为主，或两者都应兼顾）的灵敏度和特异度。 组成组合的试验数一般以奇数优于偶数.近年来国际合作研究表明，由5个准确的试验组成的组合,对鉴别致癌剂与非致癌剂是最佳的。正如表132所指，假设每种试验的灵敏度和特异度均为90%,并且如果只要其中1种试验为阳性结果，此受试化学物即评判为致癌剂，则含3种试验以上的组合,在检测l000种致癌剂时，999种以上均可检出,而可能遗漏的仅不到1种;可是如果其中有一定数量的受试物为非致癌剂，将被错误地评判为致癌剂。因此，单纯增加组合中试验的数量，灵敏度已不能再有明显提高,而特异度却会更显著地降低。为了提高试验组合鉴别致癌剂与非致癌剂的准确性，需将评判组合结果为阳性的标准加以调整.由表133可知，随着评判标准的提高(即要求增加组合中阳性试验数)，则组合的灵敏度逐渐下降，而特异度逐渐升高。由5种试验组成的组合，若以3种试验为阳性方可评判受试化学物为致癌剂时，灵敏度和特异度均较为理想，分别可达到991。此外,不多于5种试验的建议,肯定也考虑了经济效益的问题。P447表13 -2短期试验组合的理论性准确度 组合中的试验数 敏感度% 特异度 1 99。0 99.0 2 99.0 81。0 3 99.9 72.9 、 4 99.9+ 65.6 5 99。9+ 59.0注j假设每个试验方法是独立的，灵敏度和特异度均为90。表13 -3短期试验组合的理论性准确度与评判标准的关系 组合中的试验数 评判标准 灵敏度% 特异度 l 1 90.0 90。0 2 1 99。0 81.0 2 81.0 99.0 3 1 99。9 72.9 2 97.2 97.2 3 72。9 99.9 4 1 99。9+ 65.6 2 99.6 94.8 3 94。8 99.6 4 65.6 99。9+ 5 1 99。9+ 59.0 2 99.9+ 91.9 3 99。1 99。1 4 91.9 99。9+ 5 59。0 99。9+ 注:同表13 -2注，*确定试验组合为阳性结果所需的阳性试验数. 一、组合试验结果的评价1多数胜少数的评价原则 使用诱变性组合试验检测某化学物对动物的致癌性，很少得到全部阳性或全部阴性的结果，大多数情况是混合性结果，有些试验阳性有些试验阴性.对这类结果的评价曾提出过一些方法。如根据多数法则决定,多数为阳性结果，则估计受检物对动物具有致癌性，如多数为阴性结果，则否定其致癌性。这种评价方法的主要缺点是对每种测试系统均一视同仁,忽视了它们之间客观存在的生物学意义的差异。有人曾提出诱变性测试系统的权重价值按：其测试生物的进化程度：哺乳动物其他高等真核生物低等真核生物原核生物；染毒方式：体内体外;靶细胞：生殖细胞体细胞；观察终点：基因突变P448染色体损伤遗传学意义不明的. 根据上述原则，有人提出加权法，即对每一种测试系统获得阳性结果赋予正数值，无活化系统的数值大于有活化系统的，获得阴性结果则赋予负值，无活化系统的绝对值小于有活化系统的。后来又加上了测试浓度的系数.具体评价方法详见遗传毒理学原理1。用加权法评价的化学物还不多,从8种化学物评价的结果来看,加权记分预测受试物对动物的致癌性符合率并不高,仅38完全一致。不过该方法为综合评价组合试验结果提供了思路.2估计受试化学物是潜在致癌剂的概率法 概率法预测化学物致癌性的基本原理是利用Bayes氏公式,对一组短期试验的结果,分别以阳性反应和阴性反应表示,并考虑各试验的灵敏度和特异度，然后进行连续运算，最后获得受试化学物是潜在致癌剂的概率。 常用的22种短期试验的灵敏度和特异度参数列于表13 4。由表可知,至今由于对测试非致癌剂重视不够，许多试验方法的特异度参数无法获得，只能取0.5代之。试验的灵敏度和特异度参数还可参考其他文献。表13 4 22种短期试验的灵敏度和特异度参数缩写 试验名称 敏感度 特异度 Bsr Bacillus subtilis修复试验(应用rec+和rec一品系） 0。 906 0. 500 PIA Ecoli DNA修复试验（应用poIA+和polA 品系) 0.836 7（0.5） Sty Ames试验 0。 612 0.806 EcW Ecoli WP2回复突变试验 0。 612 0。857 Mly小鼠淋巴瘤L5178Y细胞特异性基因突变试验 0.836 7(0.5）CHO中国仓鼠卵巢细胞特异性基因突变试验 0. 781 7(0。5)V79中国仓鼠V79细胞特异性基因突变试验 0。781 7(0.5）UDS非程序DNA合成试验 0. 612 0。806 DrP+ DNA修复试验(应用真核细胞系统） 0。 890 7（0。5）SCE姐妹染色单体互换 0。 890 0. 667 Cvt 体外哺乳类细胞遗传学试验 0。 890 0。 667 Mnt微核试验 0。836 7(0。5）MsP小鼠皮肤斑点试验 0. 757 7(0。5)Msl小鼠特异性位点试验 0. 333 7(0.5） Bfl 应用体液进行的致突变试验 0。757 7(0。5）HMA宿主介导致突变试验 0。757 0。800 BHK BHK21细胞转化试验 0。906 0。800 3T3 BALB/e 3T3细胞转化试验 0。 781 7（0.5)SHE叙利亚仓鼠胚胎细胞转化试验 0.906 0.667 VET病毒对细胞转化的增强试验 0。890 0。 444 C3H C3H10Tl/2细胞转化试验 0. 890 7(0。5)MPR小鼠前列腺细胞转化试验 0. 890 7（0.5）DRL黑腹果蝇性连锁隐性致死试验 0。836 0.806P449 根据概率法求得受试物为致癌剂的概率0+后，按照目前通用的判别标准e+070判为潜在致癌剂，0+030判为非致癌剂，0300+070，则暂时无法下结论进行判断。此方法虽可给出定量数值作为客观判断的依据，但是关于各种诱变试验用于致癌剂筛检的灵敏度和特异度，文献报道的数值差异较大，因为在计算灵敏度和特异度时所依据的测试的致癌剂和非致癌剂的种类不同，甚至确定致癌剂和非致癌剂的判断标准也不同。例如根据不同实验室对Ames试验的验证结果分析，Ames试验的灵敏度波动在42100%，特异度波动在093。这就难以确定选用何值最为适宜。此外，目前许多短期筛选试验的特异度尚缺如，也是推广该方法的障碍之一。鉴于有些致癌剂是通过基因外机制（epigenetic mechanism)诱发癌症的，因此试验组合中除诱变试验外，增加一些非诱变性试验，如细胞转化试验和检测促癌剂的短期试验十分必要.今后必须加强短期试验在鉴别非致癌剂的能力方面的研究，以获得其特异度的确切数据。根据受试物的化学类别，采用分化的灵敏度和特异度参数,可能会提高预测的准确性.概率法在利用短期试验结果时只考虑了定性的资料,而反应的强度和有关的剂量等定量资料未加以充分利用，后者对确定化学物致癌作用的强弱有非常重要的意义，因此,概率法还有待进一步完善。 第六节组合试验的优化和分阶段试验 近30年来,对200多种短期诱变试验试用结果表明，从化学致癌剂筛检角度出发，真正经过验证有合适的灵敏度和特异度的方法，大概不到lo种。按照欧共体、美国、加拿大和日本等国家的规定，一般采用5种左右测试系统。欧共体的遗传毒理学测试规范中对药物的要求是在临床试验和产品发证前提供诱变性资料3。药物在Il缶床试验前，如果受试药物Ames试验阴性，则该药物可容许进入临床试验.药物发证所需的遗传毒理学测试规定两个水平，即基因水平和染色体水平，4种方法：细菌An2es试验或Ecoli突变试验；真核细胞系统（哺乳动物细胞或酵母）突变试验；体外培养细胞染色体畸变试验；体内试验，检测染色体损伤的微核试验.规定容许作其他试验，如果证明选择是合适的并经过论证的。 工业化学品在生产前或进口前的报告中,法律对遗传毒性要求也有详细规定。如果人的接触是有限的或可避免接触，则仅要求Ames试验或E.coli试验和体外培养细胞的染色体畸变试验或体内试验（微核试验或染色体畸变分析）.此外，还考虑化学品的年产量.如果年产量大于10吨，或上述试验出现阳性结果,才要求作补充试验。其他国家的有关规定在杂志Environmental and Molecular Mutagenesis，1993，21（1)，而在2000，35（3)上有些遗传毒理学测试方法有详细介绍,需深入了解的读者可查阅文献3和4. 药物遗传毒性试验是新药安全性评价的重要组成部分。国际协调会议（ICH)自1995年以来，曾多次召开国际会议讨论药物遗传毒性试验技术规定和各试验方法的标准化，以便使实验结果在各国之间相互接受通过，避免重复.Ames试验已一致通过作为体外首选的标准试验，此外有哺乳动物细胞基因突变试验和染色体畸变或微核试验。染色体畸变分析应包括整倍体或多倍体改变。美国推荐小鼠淋巴瘤细胞L5178Y（tk+tk一）tk基因座突变试验，因为形成的小克隆数反映基因突变,而形成的大克隆数反映染色体畸变。体内试验主要采用小鼠骨髓红细胞微核试验，现在也主张用外周血红细胞微核试验.P450 目前多数国家规定，如果根据药物动力学资料、应用情况和人接触情况证明生殖细胞可能受损,或体内诱变试验显示l个或l个以上试验呈阳性结果，即提示受试化学物在体内对体细胞是诱变剂或致染色体断裂剂,则需要对它进行生殖细胞遗传毒理效应的测试，包括显示与DNA相互作用的试验，显示潜在遗传效应（inherited effects)的试验和定量评定可遗传的效应(heritable effects）的试验。对体细胞诱变试验显示阴性结果的化学物，一般不作生殖细胞诱变试验.这种策略是否正确,有待时间考验。据分析，生殖腺尤其是睾丸，具有一定的代谢活化化学物的能力，血睾屏障的屏障能力极为有限，所以会有一些化学物,在体细胞诱变试验中显示阴性结果，而在生殖细胞诱变试验中可能呈现阳性结果。这一点是须加注意的。 综合各国遗传毒理评价规程中的规定可知，组合试验的优化主要集中在体外细菌和细胞基因突变试验与体内染色体损伤分析的不同组合，必要时补充作生殖细胞诱变试验，而分阶段或分层试验,也就是作为第一阶段试验先作体外筛检试验,有阳性结果时再作体内诱变试验,作为第二阶段试验