HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202301015HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究李涵冰1，李树东1，常小艳2，杨学莲2，侯喜林1，王桂芹2*，余丽芸1*(1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆163319；2.中科南京生命健康高等研究院，江苏 南京211135)摘要：为研究不同H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 HPAIV)的HA和NA匹配度对流感假病毒组装和功能的影响，本研究将5株H5 HPAIV的HA和NA基因节段分别克隆于pCMV/R载体，构建3个HA和5个NA重组质粒，两两随机组合后将HA、NA质粒与pCMV/R驻8.9质粒、pHR-CMV-Luc质粒构成4质粒系统，利用磷酸钙法将4个质粒转染HEK293T细胞，检测各细胞培养上清液血凝效价，结果显示：有3个上清液无血凝效价，其余12个上清液的血凝效价在100 HAU/mL400 HAU/mL，表明获得12株具有血凝效价的流感假病毒。超速离心后获得浓缩假病毒，通过western blot检测假病毒HA蛋白的表达，结果显示各假病毒均在75 ku、50 ku和25 ku有特异性条带。利用各假病毒分别感染MDCK.1细胞60 h后裂解细胞，采用荧光素酶试验检测假病毒的相对荧光素酶活性(RLA)，结果显示各假病毒RLA在5.0伊1014.5伊105不等。上述结果首次表明不同H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和相对荧光酶活性(RLA)造成影响。本研究为后续流感病毒灭活疫苗制备及抗病毒药物的研发奠定基础。关键词：H5亚型高致病性禽流感病毒；假病毒；HA；NA中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0665-07Impact of various HA and NA pair combinations from different H5subtype highly pathogenic avian influenza virus on production ofinfluenza pseudovirusLI Han-bing1,LI Shu-dong1,CHANG Xiao-yan2,YANG Xue-lian2,HOU Xi-lin1,WANG Gui-qin2*,YU Li-yun1*(1.Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.Nanjing Advanced Academy of Life and Health,Nanjing 211135,China)Abstract:This research aims to elucidate the impact of various HA and NA pair combinations from different H5 subtypes ofthe highly pathogenic avian influenza virus(H5 HPAIV)on the assembly and functionality of influenza pseudoviruses.Initially,theHA or NA gene segments from five H5 HPAIV strains were integrated into the pCMV/R vector,yielding three HA and five NArecombinant plasmids.These plasmids were then randomly paired,and in conjunction with pCMV/R驻8.9 and pHR-CMV-Lucplasmids,a four-plasmid system was established.Subsequently,this system was introduced into HEK293T cells utilizing thecalcium phosphate method to generate pseudoviruses.then the hemagglutination titers of each cell culture supernatant were tested.Our findings reveal that three of the supernatants had no hemagglutination titers,while the remaining twelve supernatants had收稿日期：2023-01-20基金项目：“三纵”科研团队(自然)项目(TDJH201904)作者简介：李涵冰(1999-)，女，黑龙江绥化人，硕士研究生，主要从事病毒学方向研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorH5亚 型 高 致 病 性 禽 流 感 病 毒(H5 highlypathogenic avian influenza virus，H5 HPAIV)在1996年首次出现，2003年开始广泛流行1-2。据统计仅2022年在美国、非洲、亚洲和欧洲的25个国家和地区就暴发了近3 200例H5 HPAIV，导致约5千万动物死亡和捕杀，对世界养殖业和经济 构成严重的 威胁(https:/www.woah.org/en/disease/avian-influenza/#ui-id-2)。同时，H5 HPAIV也严重威胁人类的健康，截至2022年12月，全球共出现930例人感染H5 HPAIV的病例，致死率约49%，对全世界公共卫生安全造成极大的影响3。因此，禽流感疫苗的快速研发也迫在眉睫，除传统灭活疫苗外，新型疫苗，如基因疫苗、纳米佐剂疫苗、多联或多价疫苗研究已有报道4-6。假型病毒简称假病毒，是指由某一种病毒包膜蛋白嵌合在反转录病毒基因组编码的骨架蛋白上产生的一种病毒7-8，它具有外源病毒的包膜特征，并且保持着反转录病毒的自身特征，可以模拟真病毒结合受体以及进入细胞的过程，假病毒由于安全性高经常被用于研究高传染性和高致病性病毒9-10。也有研究将假病毒应用到疫苗及药物研发中，例如利用假病毒筛选并获得中和性单克隆抗体11-12。通常根据骨架基因的来源将假病毒分为3类：基于人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)的假病毒13-14、基于水疱性口炎病毒(Vesicular stomati-tis virus，VSV)的 假 病 毒15、基 于 鼠 白 血 病 病 毒(Murine leukemia virus，MLV)的假病毒16。已有研究表明利用HIV的gag和pol作为骨架蛋白，流感病毒的血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neura-minidase，NA)作为囊膜蛋白即可获得流感假病毒17。有研究证明利用流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的内部基因、H1N1亚型病毒的HA和H3N2亚型病毒的NA获得的H1N2重组病毒疫苗株可以诱导能有效抵抗H1N1和H3N2病毒攻击的中和性抗体18，也有研究表明N1亚型病毒的NA可以与不同亚型病毒的HA相匹配，形成不同亚型的重组病毒19，所以推测不同H5 HPAIV的HA和NA也可以相互匹配，获得具有功能性的假病毒。因此，本研究利用A/Thailand(Kan-1)/2004(H5N1 TH)、A/Sichuan/26221/2014(H5N6SC)和A/Chicken/Netherlands/14015526/2014(H5N8 NE)株的HA、NA基 因节 段，以 及A/Chongqing/00013/2021株(H5N6 CQ)、A/Whooper swan/Shandong/SC195/2021(H5N8 WS)株的NA基因节段构建重组质粒，经测序鉴定正确后将3个HA和5个NA重组质粒两两随机组合，分别与质粒pCMV/R驻8.9和pHR-CMV-Luc共转染HEK293T细胞获得流感假病毒，通过检测流感假病毒的血凝效价、western blot检测其HA蛋白的表达情况、荧光素酶试剂检测其相对荧光素酶活性(Relative luciferase activity，RLA)，分析不同H5 HPAIVHA和NA的匹配对假病毒组装和功能的影响，为后续H5 HPAIV假病毒的应用及疫苗研发奠定基础。1材料与方法1.1质粒与细胞pCMV/R质粒、携带HIV gag和pol基因片段的pCMV/R驻8.9质粒及携带荧光素酶基因片段的pHR-CMV-Luc质粒由中科南京生命健康高等研究院提供。大肠杆菌DH5琢感受态细胞购自上海昂羽生物有限公司；犬肾细胞(MDCK.1：ATCCCRL-2935)、人胚肾细胞(HEK293T：ATCC CRL-3216)购自美国模式培养物研究所(American Type CultureCollection，ATCC)。1.2主要试剂与抗体4%SPF鸡红细胞悬液购自郑州九龙生物制品有限公司；荧光素酶检测试剂盒(E1500)购 自Promega公 司；DMEM完 全 培 养 基hemagglutination titers between 100HAU/mL-400HAU/mL,indicating the acquisition of twelve influenza pseudoviruses withhemagglutin ationtiters.After ultracentrifugation,a concentrated pseudovirus was obtained.Further validation through western blotanalysis identified accurate band formations at 75ku,50ku,and 25ku,and the relative luciferase activity assay displayed valuesspanning from 5.0伊101to 4.5伊105.These findings strongly indicate that different combinations of HA and NA pairs extracted fromvarious H5 HPAIV strains significantly influence the hemagglutination titer and relative luciferase activity of the synthesizedpseudoviruses.This pioneering study thereby establishes a fundamental basis for the forthcoming developments in inactivatedinfluenza virus vaccine production and pharmaceutical research and development.Key words:H5 highly pathogenic avian influenza;pseudovirus;HA;NA中 国 预 防 兽 医 学 报2023年666(12800-017)、0.25%胰酶-EDTA(25200-072)、青-链霉素(15140122)均购自Gibco公司；Omni-EasyTM一步法PAGE凝 胶 快 速 制 备 试 剂 盒(PG212)、转 膜 液(ps109)、5伊loading buffer(L7103)购自雅酶公司；蛋白Marker(1610374)购 自Bio-rad公 司；脱 脂 奶 粉(232100)购自BD公司；Ecl显色液(34580)购自Ther-mo Fisher Scientific公司；羊抗鼠IgG-HRP(A4416)购自Sigma公司；质粒中量抽提试剂盒(740412.5)购自MN公司；质粒大量抽提试剂盒(12981)购自Qiagen公司；小鼠抗TH株病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)阳性血清、抗SC株VLP阳性血清和NE株VLP阳性血清，均由本实验室自制。1.3重组质粒的构建及鉴定根据全球共享禽流感数据倡议组织网站(Global Initiative on Sharing All In-fluenza Data website，GISAID)下载的AIV基因序列，由西图基因公司将H5 HPAIV A/Thailand(Kan-1)/2004(H5N1 TH)株、A/Sichuan/26221/2014(H5N6 SC)株和A/Chicken/Netherlands/14015526/2014(H5N8 NE)株的HA、NA基因节段(EPI20480、EPI20482、EPI533583、EPI533584、EPI547678、EPI547683)，以及A/Chong-qing/00013/2021(H5N6 CQ)株 和A/Whooper swan/Shandong/SC195/2021(H5N8 WS)株 的NA基 因 节 段(EPI1848289，EPI1921549)分别插入pCMV/R载体中，构建8个重组质粒，其中包括5个NA质粒和3个HA质粒，分别命名为pCMV/R-TH HA、pCMV/R-TH NA、pCMV/R-SC HA、pCMV/R-SC NA、pCMV/R-NE HA、pCMV/R-NE NA、pCMV/R-CQ NA和pCMV/R-WSNA，并由上海华津生物科技有限公司测序鉴定。1.4流感假病毒的包装将HEK293T细胞按照9伊106个/瓶接种于T75细胞培养瓶，375%CO2培养24 h至细胞融合度达到85%90%。采用磷酸钙介导的瞬时转染法将3个HA质粒和5个NA质粒两两随机组合后分别与质粒pCMV/R驻8.9(表达HIV的gag和pol)、pHR-CMV-Luc(含有荧光素酶基因片段)共转染HEK293T细胞，375%CO2培养60 h后收集上清液，共获得15种上清液，根据使用的HA和NA质粒名称将其分别命名为THHATHNA、THHASCNA、THHANENA、THHACQNA、THHAWSNA、SCHA-THNA、SCHASCNA、SCHANENA、SCHACQNA、SCHAWSNA、NEHATHNA、NEHASCNA、NEHA-NENA、NEHACQNA和NEHAWSNA。采用HA试验检测各上清液HA效价20，分析假病毒是否构建成功。其中利用病毒自身HA和NA质粒得到的假病毒称为亲本假病毒，利用病毒自身HA和其他病毒NA质粒得到的假病毒称为重组假病毒。1.5假病毒HA蛋白表达的western blot鉴定HA作为前体HA0产生，锚定在细胞内质网膜中。HA0单体由两个二硫键连接的亚基组成，其边界以蛋白水解切割位点为标志：HA1亚基包含带有受体结合口袋的球状头部结构域，HA2亚基包含大部分HA茎区域21。为确定假病毒粒子HA蛋白的表达情况，本研究将1.4中各转染细胞上清液425 000 r/min超速离心2 h，收集沉淀加入20滋L 1伊PBS溶解，再将浓缩后的假病毒样品与5滋L 5伊loading buffer混合，95金属浴10 min。分别以小鼠抗TH株VLP阳性血清(1颐125)、抗SC株VLP阳性血清(1颐125)和抗NE株VLP阳性血清(1颐125)为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1颐5 000)为二抗，通过western blot鉴定1.4中经分析构建的各假病毒的HA蛋白表达情况。1.6假病毒RLA的检测假病毒通常需要绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein，GFP)或荧光素酶基因等报告基因作指示，以便分析假病毒对靶细胞的感染情况。而荧光素酶可以作用于荧光素酶底物产生荧光，荧光强度与荧光素酶表达量呈正相关，相较于生物发光法灵敏度较高。因此本研究选用荧光素酶基因作为流感假病毒的内部基因，通过检测不同流感假病毒感染MDCK.1细胞后的荧光强度，计算RLA，分析假病毒对靶细胞的感染情况。将MDCK.1细胞按照5伊104个/mL铺于96孔平底板中，375%CO2培养24 h至细胞融合度达到85%90%时，以100滋L/孔分别加入经DMEM完全培养基10倍倍比稀释的1.5中各假病毒液(101106)，375%CO2培养60 h后检测发光值。弃去细胞上清液，向每孔加入200滋L 1伊PBS清洗细胞，弃残液后每孔加入50滋L 1伊lysis buffer，-802 h后室温2 h解冻，每孔加入50滋L底物，15 min内使用酶标仪读取OD540nm值，进一步分析荧光素酶的量，若发光值与荧光素酶的量成正比，发光值即为假病毒的RLA。1.7数据的统计与分析利用GraphPad Prism(ver-sion 9.0)软 件 分 析 数 据，通 过One-way analysis ofvariance(ANOVA)分析各组数据之间差异的显著性，*：0.05时表示差异显著；*：0.01、*：0.001、*：0.0001，均表示差异极显著。李涵冰，等.HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究第7期667A：假病毒THHATHNA、THHASCNA、THHANENA和THHACQNA血凝效价比较；B：假病毒SCHATHNA、SCHASCNA、SCHANENA和SCHACQNA血凝效价比较；C：假病毒NEHATHNA、NEHASCNA、NEHANENA和NEHACQNA血凝效价比较ns：无显著差异(No significant difference)；*：0.05；*：0.01；*：0.001；*：0.0001。下同。A:Comparison of the hemagglutination titers for THHATHNA,THHASCNA,THHANENA and THHACQNA pseudovirusB:Comparison of the hemagglutination titers for SCHATHNA,SCHASCNA,SCHANENA and SCHACQNA pseudovirusC:Comparison of the hemagglutination titers for NEHATHNA,NEHASCNA、NEHANENA and NEHACQNA pseudovirusns:No significant difference;*:0.05;*:0.01 and*:0.001;*:0.0001.The same as below.图1各假病毒血凝效价的比较THHATHNATHHASCNATHHANENATHHACQNASCHATHNASCHASCNASCHANENASCHACQNANEHATHNANEHASCNANEHANENANEHACQNA220215210252022021521025202202152102520ABCnsnsnsnsns2结果2.1重组质粒鉴定结果将H5 HPAIV TH株、SC株和NE株的HA、NA基因片段，以及CQ株和WS株的NA基因片段插入到pCMV/R载体，由公司合成后共获得8个重组质粒，经测序鉴定，结果显 示：pCMV/R-TH HA的HA基因节段1 736 bp、pCMV/R-SCHA的HA基因节段1 704 bp、pCMV/R-NE HA的HA基因节段1 751 bp、pCMV/R-TH NA的NA基因节段1 392 bp、pCMV/R-SC NA的NA基因节段1 413 bp、pCMV/R-NE NA的NA基因片段1 435 bp、pCMV/R-CQNA的NA基因片段1 432 bp、pCMV/R-WS NA的NA基因片段1 413 bp，各基因片段大小和序列比对结果均与预期一致。表明8个重组质粒均正确构建。2.2各假病毒血凝效价检测结果对获得的15种假病毒上清液检测血凝效价，将利用TH株HA质粒包装获得的4株重组假病毒与亲本假病毒THHATHNA相比较、利用SC株HA质粒包装获得的4株重组假病毒与亲本假病毒SCHASCNA相比较、利用NE株HA质 粒 包 装 获 得 的4株 重 组 假 病 毒 与 亲 本 假 病 毒NEHANENA相比较，分析利用不同H5 HPAIV的NA质粒对假病毒血凝效价的影响。结果显示：利用pCMV/R-WS NA质粒转染获得的3种上清液均无血凝效价，其余12种上清液均有血凝效价，表明共获得12株具有血凝效价的假病毒，分别为THHATHNA、THHASCNA、THHANENA、THHACQNA、SCHATH NA、SCHASCNA、SCHANENA、SCHACQNA、NEHA-THNA、NEHASCNA、NEHANENA和NEHACQNA。其中重组假病毒THHASCNA、THHANENA和THHA-CQN的血凝效价分别是817 HAU/mL、2 237 HAU/mL、408 HAU/m，TH亲本假病毒THHATHNA的血凝效价为578 HAU/mL，与重组假病毒THHASCNA、THHA-CQNA相比无差异性，是THHANENA血凝效价的30%(图1A)；SC株重组假病毒SCHATHNA、SCHA-NENA和SCHACQN的血凝效价分别为4 267 HAU/mL、578 HAU/mL和102 HAU/mL，SC亲本假病毒SCHA-SCNA的血凝效价是728 HAU/mL，与重组假病毒SCHANENA、SCHACQNA相 比 无 显 著 差 异，是SCHATHNA血凝效价的20%(图1B)；NE株重组假病毒NEHATHNA、NEHASCNA和NEHACQNA的血凝效价分别为754HAU/mL、1067HAU/mL和408HAU/mL，亲本假病毒NEHANENA的血凝效价为1 457 HAU/mL，与重组假病毒NEHASCNA的血凝效价相比无显著差异，是NEHATHNA的2倍、是NEHACQNA的3.5倍(图1C)。表明利用质粒pCMV/R-THHA、pCMV/R-SCHA、pCMV/R-NEHA、pCMV/R-THNA、pCMV/R-SCNA、pCMV/R-NENA和pCMV/R-CQNA得 到 的12株假病毒均具备与红细胞结合的能力。2.3各假病毒HA蛋白表达的western blot检测结果为确定假病毒粒子HA蛋白的表达情况，超速离心浓缩假病毒液后，经western blot检测HA蛋白的表达情况，结果显示：亲本假病毒THHATHNA与重组假病毒THHASCNA、THHANENA和THHACQNA，亲本假 病 毒SCHASCNA与 重 组 假 病 毒SCHATHNA、SCHANENA和SCHACQNA，以及亲本假病毒NEHA-NENA和 重组 假病 毒NEHATHNA、NEHASCNA和中 国 预 防 兽 医 学 报2023年668A：假病毒THHATHNA、THHASCNA、THHANENA和THHACQNA RLA比较；B：假病毒SCHATHNA、SCHASCNA、SCHANENA和SCHACQNA的RLA比较；C：假病毒NEHATHNA、NEHASCNA、NEHANENA和NEHACQNAHA RLA比较A:Comparison of the RLA for THHATHNA,THHASCNA,THHANENA and THHACQNA pseudovirus;B:Comparison of the RLA for SCHATHNA,SCHASCNA,SCHANENA and SCHACQNA pseudovirus;C:Comparison of the RLA for NEHATHNA,NEHASCNA,NEHANENA and NEHACQNAHA pseudovirus图3各假病毒相对荧光素酶活性的比较结果A：假病毒THHATHNA、THHASCNA、THHANENA和THHACQNA的HA蛋白表达的比较；B：假病毒SCHATHNA、SCHASCNA、SCHANENA和SCHACQNA的HA蛋白表达的比较；C：假病毒NEHATHNA、NEHASCNA、NEHANENA和NEHACQNAHA蛋白表达的比较A:Comparison of HA protein expression of THHATHNA,THHASCNA,THHANENA and THHACQNA pseudovirusB:Comparison of HA protein expression of SCHATHNA,SCHASCNA,SCHANENA and SCHACQNA pseudovirusC:Comparison of HA protein expression of NEHATHNA,NEHASCNA,NEHANENA and NEHACQNA pseudovirus图2各假病毒HA蛋白表达的western blot鉴定结果THHATHNATHHASCNATHHANENATHHACQNASCHATHNASCHASCNASCHANENASCHACQNANEHATHNANEHASCNANEHANENANEHACQNA75ku50ku25kuHA0HA1HA2ABCNEHACQNA的HA蛋白的表达量均无差异，均有75 ku的HA0、50 ku的HA1和25 ku的HA2条带，各条带均与预期大小一致(图2)。进一步表明获得了上述12株假病毒，且其HA蛋白均可正常表达。2.4各假病毒RLA的检测结果利用TH株HA质粒包装获得的4株重组假病毒与亲本假病毒THHATH-NA相比较、利用SC株HA质粒包装获得的4株重组假病毒与亲本假病毒SCHASCNA相比较、利用NE株HA质粒包装获得的4株重组假病毒与亲本假病毒NEHANENA相比较，分析利用不同H5 HPAIV的NA质粒对假病毒RLA的影响。结果显示：TH株重组假病 毒THHASCNA、THAHANENA和THHACQNA的RLA分别是139 606、31 751和28 6259，亲本假病毒THHATHNA的RLA是337 091，是THHASCNA的2倍、THHANENA的10倍、与THHACQNA相比无显著差异(图3A)；SC株重组假病毒SCHATHNA、SCHA-NENA和SCHACQNA的RLA分别是52、99579和119798，亲本假病毒SCHASCNA的RLA是298 521，是SCHA-THNA的5 700倍、SCHANENA的3倍和SCHACQNA的2倍(图3B)；NE株 重 组 假 病 毒NEHATHNA、NEHASCNA和NEHACQNA的RLA分 别 是245 972、85 685和455 449，亲本假病毒NEHANENA的RLA是20 618，是NEHATHNA的8%、NEHASCNA的20%、NEHACQNA的5%(图3C)。上述结果表明TH株、SC株和NE株的HA和NA可相互匹配，获得流感假病毒THHATHNA、THHASCNA、THAHANENA、SCHA-THNA、SCHASCNA、SCHANENA、NEHATHNA、NEHASCNA和NEHANENA；TH株、SC株与NE株的HA也可与CQ株的NA匹配获得假病毒THHACQNA、SCHACQNA和NEHACQNA，且所得假病毒HA蛋白的表达不受到影响，但是部分假病毒的血凝效价和RLA会受到影响。THHATHNATHHASCNATHHANENATHHACQNASCHATHNASCHASCNASCHANENASCHACQNANEHATHNANEHASCNANEHANENANEHACQNA6伊1054伊1052伊1050AnsBC6伊1054伊1052伊10506伊1055伊1054伊1053伊1052.4伊1051.8伊1051.2伊1056伊1024伊1022伊1020李涵冰，等.HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究第7期6691234567893讨论由于H5 HPAIV的传染性和致病性较强，所以要求在BSL-3实验室操作和研究，而假病毒具有致病性病毒的囊膜蛋白，可模拟病毒与宿主细胞结合和进入细胞的过程，因其具有安全性高、操作便捷等优点，可应用于高致病性病毒的研究。早期Kret-zschmar等将流感病毒的HA或NA作为假病毒的囊膜蛋白加入到VSV中，获得流感假型VSV重组病毒，但该假型病毒缺乏报告基因，无法在研究中使用22；当前常用反转录病毒如鼠白血病病毒(MLV)或慢病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)基因构建流感假病毒23，Chang等利用HIV作为假病毒骨架，流感病毒的HA和NA作为假病毒的囊膜蛋白，相应的荧光基因作为内部基因，构建了流感假病毒，并已将其应用于流感病毒研究17。因此，本研究参照以往研究成果，构建假病毒并分析比较不同H5 HPAIV的HA与NA匹配度，及匹配度对假病毒组装和感染力的影响。HA蛋白在流感病毒表面最丰富，主要功能是与宿主细胞上的唾液酸受体结合，并介导病毒与细胞膜的融合，常用血凝试验作为一种定性分析，通过观察病毒与红细胞的凝集反应判定病毒与细胞的结合情况20。同时，HA试验也可检测流感假病毒是否重组成功。本研究通过HA试验检测各重组质粒共转染后的细胞培养上清液，结果显示12个上清液均具有血凝效价，可见获得了12株流感假病毒。进一步分析各流感假 病毒血凝效价，结果显示假病毒THHANENA的血凝效价显著高于THHATHNA；假病毒SCHATHNA的血凝效价显著高于SCHASCNA；假病毒NEHATHNA、NEHASCNA和NEHACQNA的RLA显著高于NEHANENA。证明利用某些的NA获得假病毒的血凝效价和RLA高于利用病毒自身HA和NA获 得 假 病 毒 的 血 凝 效 价 和RLA。在 后 续H5HPAIV灭活疫苗的研究中也可以将这种方法应用于高血凝效价病毒疫苗株的筛选，通过反向遗传学的方法，利用某些病毒的NA和病毒自身的HA，获得血凝效价较高的重组病毒，既可以节省连续传代的时间，又有可能增强中和抗体的广谱性，已有研究表明利用2株不同病毒株的HA和NA拯救出的重组病毒可以诱导机体产生能够有效抵抗这两株病毒攻击的中和性抗体18。NA是一种位于流感病毒包膜中的糖蛋白，主要功能是帮助成熟的病毒颗粒与受感染的宿主细胞分离。de Vries E等在研究中提出HA-NA受体平衡(HA和NA在细胞及粘液上的完整性、多样化的功能性和诱饵受体谱上活性间的平衡)会影响病毒的活力，HA和NA的功能平衡对于新组装病毒颗粒的有效释放很重要，在人类宿主中，由抗原漂移引起的HA和NA活性变化也可能需要HA和NA的功能性共适应以恢复上述各方面的平衡24。因此，推测本研究构建的假病毒THHAWSNA、SCHAWSNA和NEHAWSNA无血凝效价可能是因为WS株的NA与TH株、SC株、NE株的HA之间未达到功能平衡，使WS株的NA不能正常行使剪切功能，假病毒粒子也就无法从细胞中释放。本研究首次证实不同亚型H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和RLA造成影响，为后续流感病毒灭活疫苗及药物研发奠定基础。参考文献：DUAN L,CAMPITELLI L,FAN X H,et al.Characterization oflow-pathogenic H5 subtype influenza viruses from Eurasia:im-plications for the origin of highly pathogenic H5N1 viruses J.J Virol,2007,81(14):7529-7539.CAPUA I,ALEXANDER D J.Human health implications ofavian influenza viruses and paramyxoviruses J.Eur J Clin Mi-crobiol,2004,23(1):1-6.李炯颉，梁真洁，陈普成，等.H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒HA基因重组质粒的免疫保护效力研究J.中国预防兽医学报，2022，44(1)：53-58.刘艳晶，潘舒心，麻琦，等.细胞源禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)免疫效力研究J.中国预防兽医学报，2022，44(3)：295-300.赵志，高远，舒建洪，等.纳米佐剂N-2-HACC/CMCS对鸡新城疫病毒和H9禽流感病毒二联灭活疫苗免疫效果的评价J.中国预防兽医学报，2022，44(6)：630-635.WONG S,YUEN K Y.Avian influenza virus infections in hu-mans J.Chest,2006,129(1):156-168.XIANG QI,LI LIN-HAO,WU JIE,et al.Application of pseu-dovirus system in the development of vaccine,antiviral-drugs,and neutralizing antibodies J.Microbiol Res,2022,3(258):126993.LI QIAN-QIAN,LIU QIANG,HUANG WEI-JIN,et al.Currentstatus on the development of pseudoviruses for enveloped virusesJ.Med Virol,2018,28(1):e1963.FAN CHANG-FA,WU XI,LIU QIANG,et al.A Human中 国 预 防 兽 医 学 报2023年6701011121314151617DPP4-Knockin Mouses Susceptibility to Infection by Authenticand Pseudotyped MERS-CoV J.Viruses,2018,10(9):448.CHEN MING-HAI,ZHANG XIAN-EN.Construction and appli-cations of SARS-CoV-2 pseudoviruses:a mini review J.Int JBiol Sci,2021,17(6):1574-1580.张卓，刘明，郑世民.利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感 病 毒 中 和 活 性 单 克 隆 抗 体J.中 国 预 防 兽 医 学 报，2015，37(7)：545-548.陈景艳，尹晓磊，王宜，等.应用假病毒和假型病毒制备抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体的初步研究J.中国预防兽医学报，2010，32(4)：289-293.DULL T,ZUFFEREY R,KELLY M,et al.A third-generationlentivirus vector with a conditional packaging system J.J Vi-rol,1998,72(11):8463-8471.WANG ZENG,ZHONG KUN-HONG,WANG GUO-QING,etal.Loss of furin site enhances SARS-CoV-2 spike protein pseu-dovirus infection J.Gene,2022,12(856):147144.ALMAHBOUB S A,ALGAISSI A,ALFALEH M A,et al.Evalu