化学发光法检测稻谷新鲜度.pdf

引用格式：引用格式：顾雨熹,王平东,刘金阳,等.化学发光法检测稻谷新鲜度J.中国测试，2024,50(1):83-87.GUYuxi,WANGPingdong,LIUJinyang,etal.DetectionofricefreshnessbychemiluminescencemethodJ.ChinaMeasurement&Test,2024,50(1):83-87.DOI:10.11857/j.issn.1674-5124.2023080024化学发光法检测稻谷新鲜度顾雨熹1，王平东2，刘金阳3，张学峰4，刘冬雨4，王锦5，单晓雪5，杨超5，兰雪萍5，陈晋莹1(1.中储粮成都储藏研究院有限公司，四川成都610000;2.中储粮江苏质检中心有限公司，江苏南京210000;3.中国储备粮管理集团有限公司黑龙江分公司，黑龙江哈尔滨150000;4.中储粮黑龙江质检中心有限公司，黑龙江哈尔滨150000;5.中储粮质检中心有限公司，北京100000)摘要:过氧化物酶的活性可以作为判定稻谷新鲜度的一项重要指标，而过氧化物酶可催化鲁米诺-过氧化氢这一化学发光体系，基于此，该文建立一种新的稻谷新鲜度检测方法化学发光法。通过优化实验条件，选择过氧化氢浓度为 5.0103mol/L、鲁米诺浓度为 2.0106mol/L、pH9.2、稻谷颗粒数 10 颗，作为检测稻谷新鲜度的最佳条件。在最佳实验条件下，使用化学发光方法测量稻谷的新鲜度，并与传统的检测稻谷新鲜度检测方法进行对比。实验结果表明，两者相关性良好。这也表明，化学发光法检测稻谷新鲜度方法可靠，可为稻谷新鲜度的检测提供一种新的方法。关键词:稻谷;新鲜度;化学发光;鲁米诺;过氧化氢中图分类号:TB9文献标志码:A文章编号:16745124(2024)01008305Detection of rice freshness by chemiluminescence methodGUYuxi1,WANGPingdong2,LIUJinyang3,ZHANGXuefeng4,LIUDongyu4,WANGJin5,SHANXiaoxue5,YANGChao5,LANXueping5,CHENJinying1(1.SinograinChengduStorageResearchInstituteCo.,Ltd.,Chengdu610000,China;2.SinograinJiangsuQualityInspectionandSupervisionCo.,Ltd.,Nanjing210000,China;3.HeilongjiangBranchCompanyofSinograinCo.,Ltd.,Harbin150000,China;4.SinograinHeilongjiangQualityInspectionandSupervisionCo.,Ltd.,Harbin150000,China;5.SinograinQualityInspectionandSupervisionCo.,Ltd.，Beijing100000,China)Abstract:Sincethemeasurementofperoxidaseactivitycanbeusedasanimportantindicatortodeterminethefreshness of rice,and peroxidase can also catalyze the chemiluminescence system of luminol-hydrogenperoxide.Chemiluminescencemethod,anewricefreshnessdetectionmethodwasestablished.Inthispaper,byoptimizing the experimental conditions,the concentration of hydrogen peroxide was 5.0103 mol/L,theconcentrationofluminolwas2.0106mol/L,pH9.2,andthenumberofriceparticleswas10.Undertheoptimalexperimentalconditions,weusedthechemiluminescencemethodtomeasurethefreshnessofriceandcompareditwithtwotraditionalricefreshnessdetectionmethods.Theexperimentalresultsshowthatthecorrelationbetweenthemisgood.Thisalsoshowsthatthechemiluminescencemethodisreliableandprovidesanewmethodforthedetectionofricefreshness.收稿日期:2023-08-12；收到修改稿日期:2023-09-19作者简介:顾雨熹（1993-），女，山东淄博市人，助理工程师，硕士，研究方向为食品质量与安全。通信作者:陈晋莹（1987-），男，四川成都市人，副研究员，博士，研究方向为食品质量与安全。第50卷第1期中国测试Vol.50No.12024年1月CHINAMEASUREMENT&TESTJanuary,2024Keywords:rice;freshness;chemiluminescence;luminol;hydrogenperoxide0 引言稻谷新鲜度是体现稻谷陈化程度的指标之一，反映稻谷随着储存时间的延长而产生的生理衰退、酶活力下降、品质劣变等情况1。目前检测稻谷新鲜度的方法较多，但仍存在不足。近红外法所使用的仪器价格较贵，且需要建立大量的计算模型2。愈创木酚染色法检测稻谷新鲜度具有简单、快捷的优点，但容易受实验条件影响，不能做到准确判断3。碘化钾显色法、TTC 显色法、和酸性指示剂法等显色法虽然操作简单，但只能粗略比较稻谷的新鲜度，误差较大4。因此，何在采购稻谷时，鉴别新鲜度，对基层粮库检测人员来说是一个很大的挑战。化学发光法具有灵敏度高、检出限低、操作简便等优点，还可以与其他方法结合使用5，在食品分析、环境和生物分析、癌症检测和治疗等领域中多有应用6-7。鲁米诺-过氧化氢体系是一种常用的定量分析方法，可用于检测稻谷样品中的酶活性。稻谷在有氧环境中会产生活性氧，导致多不饱和脂肪酸发生过氧化反应，这种过氧化反应会对酶和细胞造成损害，是稻谷在储存过程中变质的重要原因之一8-9。同时，稻谷中也存在着由酶和非酶成分组成的防御系统能够不断清除活性氧，其中过氧化物酶在保护稻谷免受活性氧攻击方面发挥着重要作用10-13。有报道称过氧化物酶丧失活性可能会导致稻谷在储存期间发生品质变化14。因此，过氧化物酶的活性可以作为判定稻谷新鲜度的一项重要指标15-16，同时过氧化物酶还可以催化鲁米诺-过氧化氢这一化学发光体系17-18。基于此，本文建立了一种新的稻谷新鲜度检测方法化学发光法，实现稻谷新鲜度的区分。1 材料和方法1.1 试剂和材料鲁米诺、过氧化氢和磷酸盐缓冲液均为分析纯。稻谷是从粮库收集到的不同年份样本，储存条件相似。1.2 分析方法使用 IFFM-E 流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）检测化学发光所产生的信号，将一定数量稻谷、200LPBS 和 100L 鲁米诺加入置于化学发光检测窗上的反应池中。将一定浓度的过氧化氢通过加样泵加入反应池，在室温下检测化学发光信号。负高压为1000V，采样速率为10次/s，每个实验平行重复 3 次。2 结果与讨论2.1 鲁米诺过氧化氢体系的化学发光为证明过氧化物酶在稻谷中的作用，进行鲁米诺过氧化氢体系化学发光实验。实验结果见图 1，在 PBS 中分别加入鲁米诺与稻谷、过氧化氢与稻谷时，化学发光信号非常低，分别为 8.6 和 10.7；同时加入鲁米诺和过氧化氢时，化学发光信号增加至368.9；同时加入鲁米诺、过氧化氢和稻谷时，化学发光信号显著增加至 3310.1。因此，从实验结果可以证明稻谷中的过氧化物酶可以增强鲁米诺过氧化氢体系。3 6003 5003 4003 3003 200400发光强度3002008.610.7368.93 310.110002.0 mol/L 鲁米诺+pH 8.2+稻谷1.0 mol/L 过氧化氢+pH 8.2+稻谷2.0 mol/L 鲁米诺+1.0 mol/L 过氧化氢+pH 8.22.0 mol/L 鲁米诺+1.0 mol/L 过氧化氢+pH 8.2+稻谷化学体系图 1 不同体系化学发光强度对比2.2 化学发光法检测稻谷新鲜度实验条件优化在 2.0103mol/L 鲁米诺，1.0103mol/L 过氧化氢、pH8.2 和 10 粒稻谷的初始体系中，利用控制变量法对体系进行优化研究。如图 2（a）所示，随着过氧化氢浓度的增加，化学发光信号值增加，当过氧化氢浓度达到 5.0103mol/L 时，信号值最大，过氧化氢浓度进一步增加，信号几乎没有变化。因此，选择 5.0103mol/L作为本实验过氧化氢的最佳浓度。84中国测试2024年1月如图 2（b）所示，随着鲁米诺浓度增加，化学发光信号值增加，当鲁米诺浓度达到 2.0106mol/L时，信号值最大，鲁米诺浓度进一步增加，信号变化不大。因此，选择 2.0106mol/L 作为本实验鲁米诺的最佳浓度。对 PBS 缓冲液的 pH 值和稻谷颗粒数对化学发光强度的影响进行研究。如图 2（c）所示，随着 pH的增加，化学发光信号随之增加。当 pH 为 9.2 时，信号值较大，pH 值进一步增加，信号只缓慢增加，基本可以忽略。此外，过高的 pH 还会影响酶的活性。因此，选择 9.2 作为本实验的最佳 pH。如图 2（d）所示，化学发光信号随着稻谷颗粒数量的增加而增加。当稻谷数大于 10 个时，信号变化很小，说明 10 个稻谷数是本实验的最佳稻谷数，产生的信号最好。因此，选择 10 作为本实验的最佳稻谷数量。2.3 化学发光法检测稻谷新鲜度为了研究化学发光法检测稻谷新鲜度的可行性，参考优化后的实验条件，将 1.0mL2.0106mol/L鲁米诺溶液加入 2.0mL 的 PBS 缓冲液（pH9.2）中，然后加入不同产地、不同年份的 10 颗稻谷颗粒，最后加入 1.0mL5.0103mol/L过氧化氢溶液，结果见表 1。表 1 化学发光法检测不同年份稻谷的信号值稻谷产地稻谷种类稻谷年份信号值1信号值2信号值3平均值黑龙江粳稻201715905.215983.815877.915922.3202123237.123093.023060.923130.3江西籼稻201913567.313622.213719.013636.2202119012.719132.419075.619073.6湖北籼稻201710880.810974.210979.110944.7202115106.115166.415197.015156.5利用化学发光法检测黑龙江 2017 和 2021 年产的粳稻，信号值分别为 15922.3 和 23130.3；江西2019 和 2021 年产的籼稻，信号值分别为 13636.2 和19073.6；湖北 2017 和 2021 年产的籼稻，信号值分别为 10944.7 和 15156.5。发现 2021 年的籼稻信号较高，2019 年收获的籼稻信号较低。与年份久的稻谷相比，2021 年的稻谷信号相对较高，表明该方法20 00018 584.34 325.02 691.7584.0392.3135.718 632.118 00016 00014 00012 00010 000光发强度8 0006 0004 0002 000001H2O2溶液浓度/(103molL1)(b)鲁米诺溶液浓度与发光强度的关系(c)PBS 缓冲溶液 pH 值与发光强度的关系24591020 00018 692.317 938.38 846.04 717.32 521.3973.718 471.018 00016 00014 00012 00010 000光发强度8 0006 0004 0002 000001鲁米诺溶液浓度/(106molL1)24591030 00024 891.7106.02 406.318 679.325 999.01 026.317 344.719 146.025 168.724 182.324 890.724 529.325 00020 00015 000光发强度10 0005 000056PBS 缓冲溶液 pH 值789101130 00025 00020 00015 000光发强度10 0005 000032546稻谷数量/粒8710916151413121117 18(a)过氧化氢溶液浓度与发光强度的关系(d)稻谷数量与发光强度的关系图 2 化学发光法检测稻谷新鲜度实验条件优化第50卷第1期顾雨熹，等：化学发光法检测稻谷新鲜度85可以用于区分稻谷的新鲜度。2.4 化学发光法与传统方法的比较分析为了验证化学发光法检测稻谷新鲜度的可行性，将化学发光法与传统方法进行对比，传统方法参考GB/T205692006稻谷储存品质判定规则中利用稻谷脂肪酸值评判新鲜度和 LS/T61182017粮油检验稻谷新鲜度测定与判别中利用稻谷新鲜度检测仪检测新鲜度。分别使用 3 种方法检测 2017-2021 年的粳稻（图 3(a)）和 2018-2021年的籼稻（图 3(b)）。201760618343.122.412 713.3脂肪酸值新鲜度得分化学发光强度10 724.7971110 2698 551.324.521.519.18183865040302010010016 00014 00012 00010 0008 0006 0004 0002 000080604020020182019(a)粳稻(b)籼稻20202021发光强度 新鲜度得分/分脂肪酸值/(mg(100g)1)201860949010 533.323.89 437.711 463.39 435.722.120.794905040302010010016 00014 00012 00010 0008 0006 0004 0002 0000806040200201920202021发光强度 新鲜度得分/分脂肪酸值/(mg(100g)1)脂肪酸值新鲜度得分化学发光强度24.0年份/年年份/年图 3 化学发光法和两种传统方法检测稻谷新鲜度对比在化学发光法的检测结果中，总体趋势是储存时间增加，信号值越小，新鲜度越差。2021 年粳稻化学发光信号在粳稻样品中最高，2017 年粳稻化学发光信号最低。此外，2020 年籼稻化学发光信号在籼稻样品中最高，2019 年籼稻化学发光信号最低。这表明化学发光法可以区分稻谷的新鲜度，但不能区分储存年份。在脂肪酸值检测结果中，总体趋势是储存时间增加，脂肪酸值越大，新鲜度越差。但是，2018 年的粳米虽然存放时间较长，但其脂肪酸值仅为22.4mg/100g，甚至低于 2019 年的粳稻脂肪酸值24.5mg/100g，也就是 2018 年的粳稻样品新鲜度优于 2019 年的粳稻样品。籼稻中也出现类似的情况，2020 年的籼稻脂肪酸值仅为 20.7mg/100g，低于2021 年的脂肪酸值 24.0mg/100g，也就是 2020 年的籼稻样品新鲜度优于 2021 年的籼稻样品。说明脂肪酸值只能分辨稻谷的新鲜度而不能区分储存年份。在稻谷新鲜度检测仪的检测结果中，总体趋势是储存时间增加，得分值越小，新鲜度越差。但是，2018 年的粳稻新鲜度得分较高为 83 分高于 2019年新鲜度得分 81 分。此外，2020 年籼稻新鲜度得分 94 分也高于 2021 年籼稻新鲜度得分 90 分。说明稻谷新鲜度检测仪只能分辨稻谷的新鲜度而不能区分储存年份。为查看化学发光法与传统方法是否有关联，对图 3 进一步分析。化学发光信号值与脂肪酸值的趋势是相反的，呈负相关关系，随着脂肪酸值的增大，化学发光信号值减弱；而化学发光信号值与新鲜度得分值的趋势是一致的，呈正相关关系，随着新鲜度得分值增大，化学发光信号值逐渐增大。从化学发光法与两种传统方法的一致性来看，其结果说明利用化学发光法检测稻谷新鲜度是一种可靠的方法。同时，从图 3 中还可以得到化学发光的信号值与脂肪酸值之间的趋势要好于与新鲜度得分值的趋势，说明化学发光法与脂肪酸值检测法的关系更为密切。此外，籼稻测试得到的化学发光值与脂肪酸值和新鲜度得分值的趋势的一致性好于粳稻，这可能是因为二者成分不同，导致化学发光信号的多样性。2.5 化学发光法测量结果的层次聚类分析为了进一步表明化学发光法测得数据的可用性，实施了层次聚类分析，每个年份样品各取 3 份，并编号为 1、2、3，分析结果如图 4 所示。如图 4（a）所示，不同年份的粳稻样品按新鲜度从低到高可被分成“不新鲜”、“次新鲜”、“新鲜”和“最新鲜”四类。2017 年的粳稻样品被分类为“不新鲜”；2019 年的粳稻样品被分类为“次新鲜”；2018 年和 2020 年的粳稻样品被分类为“新鲜”；2021 年的粳稻样品被分类为“最新鲜”。86中国测试2024年1月如图 4（b）所示，不同年份的籼稻样品按新鲜度从低到高可被分成“次新鲜”、“新鲜”和“最新鲜”三类。2019 年和 2021 年的籼稻样品被分类为“次新鲜”；2018 年的籼稻样品被分类为“新鲜”；2020 年的籼稻样品被分类为“最新鲜”。结合 2.4 中的样品脂肪酸值和新鲜度评分，不同年份的粳稻、籼稻样品的分级结果与实测值一致。说明化学发光法在鉴别大米新鲜度方面有应用潜力。3 结束语本文证明了稻谷中的过氧化物酶可以增强鲁米诺-过氧化氢体系，并通过实验优化化学发光法的反应条件。通过研究发现当过氧化氢浓度为 5.0103mol/L、鲁米诺浓度为 2.0106mol/L、pH 为9.2、稻谷颗粒数为 10 颗时产生的信号值最强。基于本文的最优反应体系，对比了化学发光法与两种传统方法的一致性，结果说明利用化学发光法检测稻谷新鲜度是一种可靠的方法。最后，利用层次聚类分析法对化学发光法检测稻谷新鲜度的结果进行分级，分级结果与传统方法实测值一致，说明化学发光法在鉴别大米新鲜度方面有着应用的潜力。使用化学发光法检测稻谷的新鲜度具有灵敏度高、操作方便、线性范围宽、分析速度快、易于自动化等优点。实验结果表明：化学发光方法与传统检测稻谷新鲜度的方法之间具有较好的相关性，是一种可靠的方法，同时也为检测稻谷新鲜度提供了一个新的方法。参考文献 杨建平,王若兰,高雪琴.玉米品质与新陈程度关系的研究J.粮食加工,2006,31(5):89-91.YANGJP.WANGRL,GAOXQ.StudyontheRelationbetween Corn Character and Old&New DegreeJ.GrainProcessing,2006,31(5):89-91.1于素平,石翠霞,杨冬平,等.稻谷新鲜度快速检测技术研究进展 J.粮食科技与经济,2015,40(6):26-28.2王天娇,庞文渌.提高愈创木酚染色法检测稻谷新陈度准确性的研究 J.粮食加工,2020,45(5):3.WANGTJ,PANGWL.Researchonimprovingtheaccuracyof guaiacol staining in the detection of rice new aging3degreeJ.GrainProcessing,2020,45(5):3.张静.几种检测大米新鲜度的方法比较 J.啤酒科技,2003(8):3.4CHRISTODOULEASD,FOTAKISC,ECONOMOUA,etal.Flow-basedmethodswithchemiluminescencedetectionforfood and environmental 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